Contents トランスフェクション選択ガイド 3 トランスフェクション試薬 ( リポフェクション ) 3 Transfection Reagent 4 MessengerMAX Transfection Reagent 6 RNAiMAX Transfection Reagent 8 CRISP

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1 トランスフェクション製品カタログ 3 Transfection Reagent MessengerMAX Transfection Reagent RNAiMAX Transfection Reagent CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent Neon Transfection System New

2 Contents トランスフェクション選択ガイド 3 トランスフェクション試薬 ( リポフェクション ) 3 Transfection Reagent 4 MessengerMAX Transfection Reagent 6 RNAiMAX Transfection Reagent 8 CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent 9 Expi293 Expression System ExpiCHO Expression System トランスフェクション装置 ( エレクトロポレーション ) Neon Transfection System 2 In vivo トランスフェクション試薬 Invivofectamine 3. Reagent 4 トランスフェクション関連試薬 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium 6 Gibco 選択用抗生物質 6 Ordering information 8 2

3 トランスフェクション選択ガイド 5, 45, 4, 35, トランスフェクションとは 核酸を真核細胞に導入するプロセスです 手法は多岐にわたり 脂質トランスフェクションやエレクトロポレーションのような物理的手法が用いられます Invitrogen シリーズは 広範囲の細胞に対して優れた性能を発揮するため 市販されているトランスフェクションの中で最も引用文献数が多く 最も信頼されている製品です 当社のトランスフェクション製品の中から お客様に最適なソリューションをお選びください 製品名 サンプルタイプ 多くの文献で引用されているロングセラー製品 2 プラスミド DNA sirna DNA と sirna の co-transfection DNA の導入に最適なリポフェクション試薬 3 プラスミド DNA sirna DNA と sirna の co-transfection sirna の導入に最適なリポフェクション試薬 RNAiMAX sirna microrna mrna の導入に最適なリポフェクション試薬 MessengerMAX 3, 25, 2, 5,, 5, 年発売以来 製品が引用された文献の累積数 Cas9 Protein の導入に最適なリポフェクション試薬 CRISPRMAX mrna Cas9 Protein 試薬では導入困難な細胞のためのエレクトロポレーション装置 Neon Transfection System プラスミド DNA sirna microrna タンパク質 導入効率 トライアルサイズ -. ml サイズ. ml サイズ. ml サイズ. ml サイズ ( 製品番号 L3) ( 製品番号 )( 製品番号 LMRNA) ( 製品番号 CMAX) デモ受付中 細胞タイプ別推奨ガイド トランスフェクション製品 DNA mrna RNAi Co-delivery 一般的な細胞 導入困難な細胞 初代細胞 幹細胞 浮遊細胞 リポフェクション試薬 3 RNAiMAX MessengerMAX Expi293 system ExpiCHO system 2 エレクトロポレーション Neon Transfection System In vivo delivery Invivofectamine 3. Expi293F cell 専用 ExpiCHO cell 専用 尾静脈注射による肝臓への in vivo 導入 Transfection Decision Tree 導入の目的は何ですか? RNAi sirna, mirna Plasmid DNA Cas9 DNA, GFP, Luc, shrna mrna Cas9 mrna, GFP mrna co-transfection 推奨トランスフェクション試薬 RNAiMAX 2, 3 3 MessengerMAX ゲノム編集におけるトランスフェクション法の選択 結果 良好 まあまあ 不良 良好 まあまあ 不良 推奨するトランスフェクション試薬 & 機器 CRISPRMAX CRISPR 導入フォーマット DNA mrna protein Lenti- Viral production 改善策 TRY リバーストランスフェクション 2 細胞密度の最適化 3 sirna 濃度の増加 TRY Neon System 2 ウイルスによる shrna の導入 TRY DNA 濃度の最適化 2 細胞密度の最適化 Neon Transfection System TRY mrna + MessengerMAX reagent 2 Plasmid DNA + Neon System 3 mrna + Neon System 4 ウイルスによる導入 3 Neon Transfection system MessengerMAX 3

4 3 Transfection Reagent Invitrogen 3 Reagent は 弊社がもつ最新の脂質ナノ粒子テクノロジーを利用しており 優れたトランスフェクション性能と再現性の高い結果を実現します さまざまな導入困難な細胞および一般的な細胞において 非常に優れた導入効率をもたらし 細胞生存率も向上させます 3 Reagentを使用することで 我々の導入困難な細胞株で 倍以上のトランスフェクション効率を得られたことにとても喜んでいますし 驚いています それだけでなく細胞死も低減しました 素晴らしい結果です! リスボン大学 Rui Eduardo Castro, PhD 優れたパフォーマンス導入困難な細胞から一般的な細胞まで 非常に広範囲の細胞で高い導入効率が得られます細胞生存率が改善細胞に優しく 低毒性です高い汎用性 つの試薬でDNA, RNA, co-transfectionが可能です 3 によりタンパク質発現量が増加 GST-STAT ϐ-actin 2 Western blot, HepG2 3 他社製品 FH 他社製品 XH 図 2. HepG2 細胞株における GST-STAT タンパク質発現 ( ウェスタンブロッティング ) 2 3 他社製品 FH 他社製品 XH を使用し 24 ウェルプレートで細胞に GST-STAT プラスミドをトランスフェクションしました トランス フェクションから 48 時間後に細胞を回収し ウェスタンブロット解析を行いました コント ロールである β- アクチンのブロットの結果から 4 サンプルは等量にロードされたこと が分かります 3 2 他社製品 FH 向上した細胞生存率 低毒性 HEK 293 HeLa LNCaP 3は トランスフェクションの過程における全てのステップを最適化して開発されました 安定した高いトランスフェクション性能をもつため より高い細胞生存率を求める場合には 試薬の量を減らすことで毒性のリスクを低減することができます % Transfection 9 8 HepG2 A549 % Transfection LTX Dose (µl) 図. 3 の使用により 従来のトランスフェクション試薬よりも導入効率が向上 3 2および他社製品 FHを使用して HEK 293 HeLa LNCaP HepG2 および A549 細胞株に96ウェルフォーマットでトランスフェクションを行ない 48 時間後にGFP 発現を解析しました 5 種類すべての細胞株において 3はInvitrogen 2および他社製品 FHよりも高いGFPのトランスフェクション効率をもたらしました 図 3. 3 は幅広い使用量で安定した高い導入効率を維持 各試薬を用い 96- ウェルフォーマットにて グラフに示される用量で HeLa 細胞にエメ ラルドグリーン蛍光タンパク質 ( GFP) 発現ベクターをトランスフェクションしました ト ランスフェクションから 48 時間後 フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率および GFP の発現強度を解析しました 3 は 2 および Invitrogen LTX よりも高いトランスフェクション効率お よびタンパク質発現を示しました 4

5 がん研究を増進 3は 多岐にわたる細胞でより高いトランスフェクション効率を示すため がん研究に用いる細胞株の選択肢が大きく広がります % Transfection efficiency Transfection efficiency in cancer cell line panel Hs-578T SK-MEL-28 4T SW48 NCI-H23 PANC- Saos-2 RD BT-549 L6 SK-OV-3 DU-45 HCC937 MDA-MB-468 SW62 NCI-H46 Caki- Cell line ゲノム編集の成果を向上 3は 従来の遺伝子導入法の限界を打開し ゲノム編集のような新しいテクノロジーを利用した研究をより促進することを可能にしました このトランスフェクション試薬を用いて Invitrogen GeneArt CRISPRにより HepG2および U2OS 細胞においてAAVS 遺伝子座のターゲティングを行ったところ トランスフェクション効率 蛍光強度 およびゲノム切断に向上が見られました この高い導入効率とゲノム編集効率は Invitrogen GeneArt Precision TALsにおいても同様に認められました 導入効率が向上することにより ゲノムに対する部位特異的な挿入が促進され ダウンストリーム解析に進むための手間が軽減し 幹細胞の操作がより容易となります A B Mean OFP intensity 2, 5,, 5, Mean OFP intensity 5,, 5, 3 Transfection Reagent トランスフェクション試薬図 4. がん細胞株パネルにおけるトランスフェクション効率 2 および 3 を用い 7 種類の細胞株に 24 ウェル プレートフォーマットで ウェルあたり.5 µg の GFP 発現プラスミドを 各試薬の推奨プロトコールに従ってトランスフェクトしました トランスフェクションから 48 時間後に GFP 発現を解析しました 各条件についてトリプリケートで実験を行い データポイントは平均トランスフェクション効率 + SDで示しています 人工多能性幹細胞の作製 人工多能性幹細胞 ( ipsc) は 無数の疾患および症状に対する未来の再生医療および個別化治療につながる大きな可能性を秘めています 3にInvitrogen Epi5 Episomal ipsc Reprogramming Kitを組み合わせて使用することにより 優れたトランスフェクション効率が得られ エレクトロポレーションを使用せずに高効率な体細胞のリプログラミングを実現できます ( 図 5) 図 6. Invitrogen GeneArt CRISPR Nuclease Vectorのトランスフェクション効率およびタンパク質発現 OFPレポーター遺伝子を含むベクターを 2または 3により (A)U2OSおよび(B)HepG2 細胞株にトランスフェクトしました 棒グラフはレポーター遺伝子の発現を示しており 画像はOFP 遺伝子を発現している細胞です 幹細胞へのトランスフェクション 3は 幹細胞の有用性を最大限に引き出すために エレクトロポレーションに代わる高効率で低コストな核酸導入法として開発されました ( 図 7) 細胞ストレスの高いエレクトロポレーションに代わり 高度な脂質ナノ粒子テクノロジーが リプログラミング トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬のワークフローを簡略化し 新しいゲノム編集技術を可能にします A 3 reagent Neon system electroporation B Day 4 Day 7 BJ HDFn HDFa 図 5. 3によるリプログラミングの効率性をエレクトロポレーションと比較 3 またはInvitrogen Neon Transfection System を用いて Epi5 ベクターをトランスフェクションすることにより BJ 繊維芽細胞および 新生児 (HDFn) または成人 (HDFa) ヒト皮膚繊維芽細胞をiPS 細胞にリプログラミングしました コロニーは (A) 明視野顕微鏡および (B) アルカリフォスファターゼ染色に A B DNA:. µg 3 SSEA4+/GFP+: 42% GFP MFI H9 胚性幹細胞 ips 細胞 より観察しました トランスフェクション関連試薬5 DNA:.3 µg 3 SSEA4+/GFP+: 69% GFP MFI 図 7. 幹細胞へのトランスフェクション 3 を用いて H9 胚性幹細胞 (ESC)( A) または ips 細胞 ( B) にト ランスフェクションを行いました 蛍光顕微鏡により細胞を可視化し フローサイトメト リーを用いた解析によりトランスフェクション効率を求めました 製品詳細および細胞別データについてはウェブページをご覧ください

6 MessengerMAX Transfection Reagent Invitrogen MessengerMAX mrna Transfection Reagentは mrna 導入用トランスフェクション試薬で 神経細胞および幅広い種類の初代細胞において 一般的なDNA の導入試薬に比べて トランスフェクション効率を大幅に改善することが期待できます アプリケーションの結果を改善し より生物学的な意味を持つ細胞実験を行うことができます これらの導入困難な細胞における導入効率の改善は mrna 導入効率を最大限に高めるように最適化された弊社が持つ最新の脂質ナノ粒子テクノロジーと DNA 導入で必要となる DNA の核への取り込みステップを省くことにより実現しています MessengerMAX 試薬は 骨髄由来間葉系幹細胞へのトランスフェクションを高効率に行うことができます ウイルスベクターの毒性の影響を受けることもありません ペンシルベニア大学 Dr. Daniel Cohen 一般的なDNA の導入に比べて トランスフェクション効率を大幅に改善核に入る必要が無く 細胞質で迅速にタンパク質発現ゲノム組込みのリスクなし神経細胞 初代細胞 幹細胞を用いた研究を促進 ゲノム組み込みのリスクがなく 迅速にタンパク質を発現 MessengerMAX を用いたmRNA 導入では 全般的にタンパク質が迅速に発現され トランスフェクションされた細胞間で発現に非常に高い均一性が認められました また mrna の導入では DNA の核への取り込みステップがないため ( ステップ 4) ゲノム組み込みのリスクが排除されており トランスフェクション効率は細胞周期による影響を受けません DNA 導入 vs mrna 導入. Attachment to cell 2. Endocytosis into cell 3. Escape from endosome 4. Nuclear entry Protein expression Reagent DNA complex DNA DNA トランスフェクション Endosome Nucleus mrna トランスフェクション Protein mrna Reagent mrna complex 6

7 トランスフェクション試薬神経細胞や初代細胞でトランスフェクション効率が改善 MessengerMAX mrna reagent DNA 導入用試薬 他社 mrna 導入用試薬 神経細胞 hnsc BJ 線維芽細胞 RAW mrna 導入を行うための 3 つのステップ DNA 鋳型の調製 T7 プロモーター配列を含む DNA 鋳型を調製します DNA 鋳型の調製は 目的遺伝子を Invitrogen Gateway pcdna -DEST4 ベク ターにクローニングするか もしくはそのベクターを鋳型に T7 プロモーター配列を含む プライマーを用いて PCR 増幅するか いずれかの方法により行います Cloning option T7 attr Cm R ccdb attr2 V5 epitope 6xHis P CMV BGH pa f ori SV4 ori MessengerMAX Transfection Reagent 図 8. MessengerMAX は 初代マウス皮質神経細胞 hnsc BJ 線維芽細胞 および RAW 細胞において 主要な DNA 導入試薬や従来の 他社 mrna 導入試薬に比べてより優れた導入効率を実現 hnsc を除くすべての細胞では MessengerMAX および他社 mrna 導 入試薬を用いて 24- ウェルフォーマットで ウェルあたり 5 ng の GFP mrna を各 細胞に導入しました また 主要な DNA 導入試薬を用いて ウェルあたり 5 ng の GFP DNA を各細胞に導入し トランスフェクションから 24 時間後に GFP 発現を観察しま した hnsc では MessengerMAX および他社 mrna 導入試薬を用いて 48 ウェルフォーマットで ウェルあたり 25 ng の GFP mrna を各細胞に導入しました Expression vector DNA PCR option T7 Ampicillin R Gateway pcdna -DEST4 Vector puc ori ORF SV4 pa Neomycin また 主要な DNA 導入試薬を用いて ウェルあたり 25 ng の GFP DNA を各細胞に 導入し トランスフェクションから 24 時間後に GFP 発現を観察しました MessengerMAX による mrna 導入例 細胞タイプ MDA-MB-23 A43 A549 bend.3 MessengerMAX のトランスフェクション効率 (%) 2 mrna の合成 Invitrogen mmessage mmachine T7 ULTRA Transcription Kit を使用して 調製した鋳型 DNA から転写により mrna を合成します ARCA-capped mrna with poly(a) tail トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬BJ 線維芽細胞 H9 ESC 初代肝細胞 Hep G2 HT-29 ipsc 初代ケラチノサイト 3 mrna の導入 MessengerMAX のシンプルなプロトコールに従って 目的の mrna を 導入します Day Timeline Steps Seed cells to be 7 9% confluent at transfection トランスフェクション関連試薬7 L929 LNCaP hnsc MCF7 2 3 Diluted MessengerMAX Reagent Vortex 2 3 sec Diluted mrna Dilute MessengerMAX reagent in Opti-MEM medium (2 tubes) mix well Prepare diluted mrna master mix by adding mrna to Opti- MEM medium mix well Neuro-2a 初代神経細胞 Day 4 Add diluted mrna to each tube of diluted MessengerMAX reagent (: ratio) RAW RBL SK-N-SH 5 Incubate 6 Add mrna-lipid complex to cells SH-SY5Y トランスフェクション効率 (%): <3% 3 5% 5 79% >8% Day Visualize/analyze transfected cells

8 RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen RNAiMAX Transfection Reagentは sirna 導入用に特化して開発されたトランスフェクション試薬です 幅広い細胞株において 高効率で低毒性な遺伝子導入が可能です また microrna( mirna) の導入にも適しており sirna/mirnaを用いたrnai 実験には Invitrogen RNAiMAX が最もお奨めの試薬になります p53, relative to nontransfected sirna の導入に適したトランスフェクション試薬 少ない sirna 量でも高いノックダウン効率 幅広い試薬レンジにおいて高い細胞生存率を維持 さまざまな細胞株で使用可能 少ない sirna 量でも効率よくノックダウン 高効率な遺伝子ノックダウンを達成するためには RNAiMAX Transfection Reagentをぜひご使用ください わずか nm のsiRNAで ターゲット遺伝子を高効率でノックダウンすることが可能です nm + RNAiMAX Scrambled control nm + B 社製品 nm + T 社製品 nm p53 sirna nm + Q 社製品 nm + RNAiMAX nm + B 社製品 図 9. RNAiMAX と他社試薬との比較 nm + T 社製品 nm nm + Q 社製品 Nontransfected RNAiMAX および他社試薬 (B 社, T 社, Q 社 ) の計 4 種類のトランスフェクション試薬を用いて nmまたは nmのp53 sirna を導入した場合のp53 遺伝子の抑制効果を確認しました 細胞毒性が低く 最適化が容易 RNAiMAX Reagent は 倍の濃度範囲にわたって 高いノックダウン効率と優れた細胞生存率が保たれます ( 図 ) このため RNAiMAX 試薬は 低濃度のsiRNA で容易に最適化でき 同時に実験系に対する細胞毒性を抑えます トランスフェクション時の細胞毒性によって ターゲット遺伝子による表現系が隠れてしまう可能性があるため トランスフェクション試薬量を最小限に抑えることは RNAi 実験を成功させるための一つの重要な要素となります p53 発現レベル μ μ μ μ μ μ μ μ RNAiMAX 試薬量 細胞生存率 (%) p53 発現レベル 細胞生存率 (%) 図. RNAiMAXは幅広い試薬レンジにおいて 高いノックダウン効果と細胞生存率が得られる. ~. μl のRNAiMAX 試薬量を用いて実験を行なったところ p53 遺伝子レベルが効果的に抑制されていること 試薬量が多い条件においても優れた細胞生存率が得られていることが確認されました さまざまな細胞株で使用可能 Average GAPDH mrna remaining % 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% % % Primary cortex Primary hippocampus Glial precursor NSC Rat astrocytes Human astrocytes PC-2 MEG- JAWSII TF - RAW HUVEC RH3 JN - DSRCT- TC7 Negative control 図. RNAiMAXを用いた Silencer Select sirnaの導入例 RNAiMAXを用いて各種細胞に3 nm/well のSilencer Select sirnaをトランスフェクションし GAPDH mrnaのノックダウン効率を qpcrで評価しました Neuronal and glial precursor Blood cell Soft tissue cell 8

9 CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent Invitrogen CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent は タンパク質フォーマットの Cas9 Nucleaseで行うCRISPR のゲノム編集に最適な導入試薬です 脂質ベースのトランスフェクション試薬として定評ある シリーズとして開発され Cas9 Nucleaseタンパク質と RNAの複合体を高い効率で細胞に導入します 多くの細胞で CRISPR によるゲノム編集の効率を最大化 導入された Cas9 Nuclease タンパク質は 細胞内で速やかに働き 代謝されるため オフターゲットが最小化 Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 Nucrease を始め 一般的な Cas9 Nuclease タンパク質 & grna 複合体導入に対応 RNAiMAX Transfection Reagent CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent トランスフェクション試薬ゲノム編集効率の高いタンパク質フォーマット CRISPR 導入フォーマット Plasmid(GCD%) mrna(gcd%) タンパク質 (GCD%) トランスフェクション試薬 3 MessengerMAX CRISPRMAX 293FT U2OS マウスES 細胞 ヒトiPS 細胞 N2A Jurkat 9 K562 2 A HepG2 N/A N/A 3 3T3 N/A N/A 57 HCT6 N/A N/A 85 ゲノム編集におけるトランスフェクション法の選択 表. DNA mrna タンパク質フォーマットでのゲノム編集効率の比較 多くの細胞でタンパク質フォーマットのゲノム編集の効率が高いことを確認しました ゲノム編集の効率は Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kitを使って ターゲット部位で切断された効率で評価しました (GCD%) ips 細胞や ES 細胞でも優れたゲノム編集効率を実現 トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬トランスフェクション関連試薬9 ゲノム編集効率が高いタンパク質フォーマットでのゲノム編集には CRISPRMAX が最適です また レンチウイルスのパッケージングには 3 ( 4ページ ) が推奨です リンパ球系など 浮遊細胞などでは Neon Transfection system(2 ページ ) によるエレクトロポレーションをお試しください Gibco ipscs grna+ Control Cas protein H9 ESCs grna+ Control Cas protein 推奨するトランスフェクション試薬 & 機器 CRISPR 導入フォーマット DNA mrna protein Lenti-Viral production Cleavage % CRISPRMAX 3 Neon Transfection system 図 2. ips 細胞とES 細胞での切断効率を検証 Gibco Human ips 細胞 ( 左 ) 及び H9 ES 細胞 ( 右 ) へ GeneArt Cas9/gRNA リボヌクレオタンパク質 ( RNP) 複合体をトランスフェクトしました トランスフェクション 48~72 時間後に GeneArtGenomic Cleavage Detection Kitを用いて標的部位の切断効率を確認しました MessengerMAX

10 Expi293 Expression System 哺乳類細胞系タンパク質発現システム Gibco Expi293 Expression Systemは 哺乳類細胞による一過性タンパク質発現システムです 発現量を高めるために特別に開発された 細胞 + 培地 + トランスフェクション から構成されたトータルシステムです 高い増殖能を誇るExpi293F 細胞 高密度でも培養可能なGibco Expi293 Expression Medium さらに高密度培養用に開発されたGibco ExpiFectamine 293 トランスフェクション試薬が相互に作用し これまでにない大量発現を可能にしています 私がこれまで使用してきた HEK293 一過性発現システムの中で 2.3 g/l の発現量を達成したのは Expi293 Expression System が初めてです Jelte-Jan Reitsma Research associate 従来法よりも 2~ 倍の大量発現 ( 培養 L あたり最大 グラム ) 培養容量は ml ~ L 以上まで幅広いスケール調整が可能 従来の低密度 HEK 293 システムから Expi293 Expression System への移行も有効 グラムレベルの高い発現量 ml EPO Crypto human lgg ml ml ml FreeStyle ml ml ml Expi293 3 ml ml Expi293 システムによるタンパク質発現ヒトエリスロポエチン (EPO) Crypto およびヒトIgG を FreeStyle 293 Expression System ( ) とExpi293 Expression System( ) で発現させ 比較しました タンパク質の発現は ml 3 ml および L の培養液中で行い タンパク質の回収は遺伝子導入後 5 日から7 日後に行いました それぞれの収量はすべて L の培養液当たりのタンパク質量 ( mg) で示しています (mg/l) 図 3. Expi293 Expression System の使用により 培養 L あたり g 以上のヒト IgG および Fc-tagged Cripto タンパク質の発現を達成 大量発現のための高密度培養を実現 Viable cell density (cells/ml 6 ) Viability(%) Days in culture Expi293 medium Test medium Test medium 2 Test medium Days in culture 8 Expi293 システム専用のトランスフェクション試薬 ExpiFectamine 293 Transfection Kit ExpiFectamine 293 Transfection Kit は Expi293 Expression System の主要な構成品のつです 本製品は 高密度に培養した HEK293 細胞の一過性トランスフェクションを行うための試薬です 高効率な陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬およびトランスフェクションエンハンサーが含まれています Expi293 Expression Mediumで培養されたExpi293F 細胞のタンパク質発現量を最大限に高めるように設計されています 図 4. 培養日数の経過による生細胞率および生存細胞密度について Expi293 Expression Medium および他の 293 培養培地で増殖した細胞を比較 Expi293 システムの詳細はウェブページも合わせてご覧ください www. thermofisher.com/expi293

11 力価 ( タンパク質収量 )( g/l) 力価 ( タンパク質収量 )(mg/l) コントロールに対する割合 トランスフェクション試薬トランスフェクション関連試薬 ExpiCHO Expression System 哺乳類細胞系タンパク質発現システム Gibco ExpiCHO Expression Systemは CHO 細胞による哺乳類系タンパク質発現システムです 細胞 培地 遺伝子導入試薬を厳選し 従来の一過性システムを凌ぐ発現量を達成し Expi293 Expression System ExpiCHO Expression System ました また ExpiCHO システムは 創薬プロセスの初期段階のスクリーニング用に 迅速かつ効率的な一過性 CHO 発現タンパク質を入手できます 既存の一過性システムよりも優れた発現量 ( 最大 3 g/l) シンプルでスケーラブルなタンパク質産生 ( 用途に応じて 3 種類のプロトコールから選択可能 ) 創薬プロセスの初期段階から一貫して CHO 細胞で開発に取り組むことが可能 既存の一過性システムよりも優れた発現量 ヒト IgG ウサギ IgG ヒトエリスロポエチン 力価 ( タンパク質収量 )( g/l) x 3x 95x 4x 25x 2x 4 2 トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬 FreeStyle CHO Expi293 ExpiCHO FreeStyle CHO Expi293 ExpiCHO FreeStyle CHO Expi293 ExpiCHO 図 5. FreeStyle CHO Expi293 および ExpiCHO システムによる組換えタンパク質発現 ヒト IgG ウサギ IgG およびエリスロポエチンを FreeStyle CHO Expi293 および ExpiCHO 一過性発現システムで発現させた際の発現量を示しています ExpiCHOシステムにおけるタンパク質発現量は FreeStyle CHOシステムを用いた場合の25 ~6 倍 Expi293システムを用いた場合の 2~ 4 倍となりました シンプルでスケーラブルなタンパク質産生 ExpiCHO システムは Standard High titer Max titer の 3 種類のプロトコールを提供しています お客様の研究ニーズ タンパク質収量 時間 および装置の利用可能性に応じてお選びいただけます 力価 ( タンパク質収量 )( g/l) フラスコサイズ 25 ml 25 ml 5 ml L 3 L 培地量 35 ml 7 ml 4 ml 28 ml L 培養日数 Max titer プロトコール High titer プロトコール Standard プロトコール 図 6. 異なるプロトコールオプションにおけるヒト IgG 発現の速度 Standard プロトコール : 回のフィード添加 + 温度シフトなし High titer プロトコール : 回のフィード添加 +32 への温度シフト Max titer プロトコール :2 回のフィード添加 +32 への温度シフト 図 7. ExpiCHOシステムのスケーラビリティ ExpiCHOシステムは 25 ml( コントロール ) から 3 Lのフラスコサイズまで タンパク質発現量の割合が5% の範囲内でスケール調整可能です 35 ml 未満の容量およびバイオリアクタースケール用の追加のプロトコールはオンラインで入手できます

12 エレクトロポレーション Neon Transfection System Invitrogen Neon Transfection System は ピペットチップ型電極 ( 特許 ) を採用した次世代エレクトロポレーション装置です 浮遊細胞や血球系細胞など リポフェクション試薬ではじゅうぶんな導入効率が得られない またはさらに導入効率を向上させたい場合 Neonシステムが最良のソリューションとなります 私がこのシステムを推奨する理由は とにかく使い易いということです 実際 コストも私たちが以前に使用していたシステムより若干安価ですし 何よりもデータベースなどの特長が気に入っています マンチェスター大学 Dr. Lydia Wunderley リポフェクション試薬では導入が困難な細胞に最適なツールピペットチップ型電極により 高効率 低毒性なエレクトロポレーションが実現 4 ~ 5 6 個の細胞に DNA RNA タンパク質が導入可能細胞の種類によって試薬を使い分ける必要なし A B 画期的なピペットチップ型電極を採用 Neon システムによる Jurkat 細胞へのプラスミド導入結果 Neon システムを用いて Jurkat 細胞へEGFP 遺伝子を導入後 24 時間でレポーター遺伝子の発現を観察しました (A) 位相差顕微鏡での細胞像 (B) 蛍光顕微鏡での細胞像 Neon システムによるエレクトロポレーションは 従来のキュベットタイプではなく ピペットチップ型チェンバーにて サンプル採取およびエレクトロポレーションを行ないます この革新的技術は 操作性を向上させるだけでなく チップ内で均一な電界を形成することで導入効率を高め 電極に金メッキを施すことで細胞へのダメージを軽減しています A Percent(%) msec 4V 2msec 6V 3msec 2V 3 msec 4V B Percent(%) msec 5V msec msec 7V 5V 細胞毒性の低減 + 高い導入効率 + 操作性の向上 Pulse Number/Pulse Width/Pulse Voltage Pulse Number/Pulse Width/Pulse Voltage 図 8. Jurkat 細胞と PC2 細胞での sirna 効果の検証 (A) 細胞種 :Jurkat (B) 細胞種 :PC2 Neon システムにより5 pmol のGAPDH sirnaを導入し 24 時間後にノックダウン効果を検証しました Jurkat 細胞は 実施した 4 条件すべて9% 以上のノックダウン効率が観察され 4 V, ms,3 pulse の条件で最大 97% のノックダウン効率が見られました PC2 細胞は 3 条件実施し 7 V, 2 ms, pulse の条件で最大 95% のノックダウン効率が確認されました 最高のノックダウン効率が確認された時の生存率は alamarblue 試薬で確認した結果 それぞれ約 8% と約 83% でした Neon システム A B 従来法 新しい Neon Transfection Systemのピペットチップ型電極 (A) と従来のキュベットタイプ (B) との比較 表 2. Neon システムと他社システムとの比較 システム仕様 サンプル調製 消耗品 インビトロジェン Neon システム 金メッキを施した電極をもつ長く細いピペットチップをチャンバーとして使用するエレクトロポレーション装置 Neonピペットチップ ( μl または μl サイズ ) すべての細胞で共通の消耗品を使用可能 室温保存 L 社遺伝子導入システム アルミニウム電極をもつ従来のプラスチック製キュベットを使用したエレクトロポレーション装置 プラスチックキュベット ( μl サイズ ) 5 種類以上の異なる消耗品から細胞のタイプによって使い分けが必要 冷蔵保存 Neon システムのメリット チップの形状により 温度上昇や細胞に有害なイオン成分の流出が抑えられ 毒性が低く効率の高いトランスフェクションが可能 (Biosens Bioelectron 23:353 (28 ). 少ない細胞数からトランスフェクション可能 異なる複数のキットを買い揃える必要が無い 冷蔵庫のスペースの確保や廃棄リスクも減り 無駄なく経済的に使用可能 2

13 トランスフェクション試薬トランスフェクション関連試薬3 Neon システムによるプラスミド導入例 Cell line Cell type Transfection efficiency(%)* Viable cells(%) Astrocyte primary cells Brain neuron Dendritic primary cells Blood 5 7 HL-6 Human acute myeloid leukemia 55 7 Human neural stem cell ES Jurkat T-cell leukemia KG-a Blood MEF primary cell Embryo 8 75 Mesenchymal stem cells Bone marrow 54 9 Mouse embroynic stem cells Embryo Vero Kidney * Transfection efficiency is calculated from total population of live and dead cells. 上記以外にも 多くの細胞タイプで良好な結果が得られています 実績のある細胞名および各導入条件に関する情報は 弊社ウェブサイトからご覧いただけます 操作の流れ どなたでも簡単にご使用いただけます Neon Transfection System. Neon システムのセットアップ 2. サンプルの調製 バッファーを入れる セットする Neon チューブにバッファーを入れ ピペットステーションにセット 細胞懸濁液と核酸溶液を混合 Neon ピペットにチップをセットし サンプルを吸引 トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬3. サンプルを Neon システムにセット 4. エレクトロポレーション実行 5. 細胞を培地へ ピペットステーションに Neon ピペットをセット Neon システム用消耗品キット タッチパネルで選ぶだけ 本体画面のスタートボタンを選択 電極チップのサイズにより µl 用と µl 用の2 種類があります すべての細胞で共通の消耗品を使用できます 細胞の種類によって消耗品を使い分ける必要がありません キットには 反応に必要なものがすべて含まれています ( 電極チップ サンプル調製液 バッファー チューブ ) 導入を終えたサンプルを培地に移す キットタイプ製品番号 * Neon チップは 本 2 回まで使用可能です ( サンプルが同じ場合 ) ** Neon チューブは 本 回まで使用可能です ( サンプルが同じ場合 ) µl 用 µl 用 (MPK96) (MPK25) (MPK96) (MPK25) Neon チップ *( 最大回数 ) 96 tips (92 回 ) 25 tips (5 回 ) 96 tips (92 回 ) 25 tips (5 回 ) Neon チューブ ** Resuspension Buffer R 3 ml ml 3 ml ml Resuspension Buffer T 3 ml ml 3 ml ml Electrolytic Buffer E 2 5 ml 75 ml - - Electrolytic Buffer E ml 75 ml 消耗品ランニングコスト *** Neon チップ使用回数 反応あたりのコスト 回,927 2 回 964 *** MPK96 または MPK96 を使用した場合

14 In vivo トランスフェクション試薬 Invivofectamine 3. Reagent Invitrogen Invivofectamine 3. Reagent は 大幅に性能が 改良されたin vivornai 導入用の画期的な試薬です マイクログラムレベルのsiRNAを用いて最大 85% のノックダウンを達成します Complexation buffer sirna duplex シンプルな操作で使いやすい わずか数ステップの作業で 導入用のsiRNA 複合体を調製することができます Invivofectamine 3. Reagent Diluted sirna 2 高いノックダウン効果ターゲットのノックダウン検証において 最大 85% のノックダウンが観察されています sirna 使用量を削減従来の試薬と比べ 使用する sirnaを最大 9% まで削減できます Complex 3 ノックダウンの持続性 一回の投与で 長期間のノックダウン効果が観察されました 5ºC 3 min 低毒性 4 複合体は 極めて低い in vivo 毒性を示します Complex シンプルな操作で使いやすい導入用のInvivofectamine 3. ReagentとRNAi の複合体は 試薬の混合 3 分インキュベート 希釈 の簡単な操作で調製が完了します ( 図 9) Lateral caudal vein Dorsal vein 5 高いノックダウン効果 Invivofectamine 3. Reagent と Factor VII をターゲットする Invitrogen Ambion in vivo sirna または PPIBをターゲットとする Invitrogen Stealth RNAiとの複合体は 肝臓組織へマウス尾静脈注射によって導入されました ( 図 2) mrnaレベルでfactor VII および PPIB の高いノックダウン効果が確認されました 図 2. Invivofectamine 3. Reagentを用いると 一回の静脈投与により肝臓における標的ノックダウンが可能です Invivofectamine 3. ReagentとFactor VII (FVII) または PPIBをターゲットとする sirna との複合体を マウス体重 kg あたり mg の用量 (mg/kg) で投与しました ターゲット遺伝子のmRNAレベルのノックダウン効率は 85% でした (Applied Biosystems TaqMan assayによる測定 ) 図 9. 投与するための RNAi/Invivofectamine 3. Reagent 複合体は わずか数ステップの操作で迅速に調製できます mrna expression % remaining 2% % 8% 6% 4% 2% % %!!"!!#$ -!"!!#$,!"!!#$ +!"!!#$ *!"!!#$ )!"!!#$ (!"!!#$ '!"!!#$ &!"!!#$ %!"!!#$!"!!#$!"#$%&'!()*)*+%./$234$563.7$889:$563.7$ ;<99$563.7$ No Treat. Neg CTRL sirna =3.7$>/=?6@6@$ PPIB sirna FVII sirna 4

15 トランスフェクション試薬トランスフェクション装置In vivo トランスフェクション試薬Ordering information トランスフェクション関連試薬5 ノックダウンに使用する sirna 量を削減 尾静脈注射により Invivofectamine 3. Reagent と sirna の複合体を含有量の範囲内で導入しました 投与から 24 時間後に 発色アッセイを用い て血清中の FVII タンパク質レベルを測定しました ( 図 2) ノックダウン効果の高さは 複合体中の sirna 量と相関しました Invivofectamine 3. Reagent の ED 5 は. mg/kg です ( これまでの導入試薬では. mg/kg でした ) mrna remaining % Units 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% %!"##$%&'(#$ Invivofectamine 3. Invivofectamine 3. %.. FVII sirna mg/kg in vivo 毒性が低い,. GLU 3 U ALP 3 U ALT 3 U AST 3 U Blood chemistry markers TBIL 3 U 図 2. Invivofectamine 3. Reagent および FVII をターゲットとする sirna では 単回静脈内注射後に肝臓において用量反応ノックダウンが生じま した Invivofectamine 3. Reagent と FVII をターゲットとする Invitrogen in vivo sirna との複合体を 用量.2 ~ 2 mg/kg の範囲で投与しました 血清を分離し FVII タンパク質レベルについてアッセイしました (Biophen chromogenic assay) Invivofectamine 3. 試薬の in vivo 毒性を評価するために 複数回の試薬の投与時点における血液化学分析およびサイトカイン測定を行いました ( 図 22) Invivofectamine 3. Reagent を用いてトランスフェクションを行なった個体中のバイオマーカーの値は トランスフェクション未処理の場合と比 較して大きな差異は認められませんでした CHOL 3 U TRIG 3 U Invivofectamine 3. Reagent 図 22. 時間経過および各投与量における in vivo 毒性マーカーの評価 Invivofectamine 3. ReagentとFVII をターゲットとする Invitrogen in vivo sirnaとの複合体をマウスに mg/kgまたは 3 mg/kg の用量で投与しました 血液サンプルを 時間後に採取し 臨床化学アッセイを用いていくつかのバイオマーカー (Antech) について評価しました

16 トランスフェクション関連製品 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium は Eagle s Minimum Essential Mediumを改良した組成となっています HEPESと重炭酸ナトリウムで緩衝され ヒポキサンチン チミジン ピルビン酸ナトリウム L-グルタミン酸 微量元素 および増殖因子が添加されています 血清を添加した培地中で増殖している細胞の大部分はOpti-MEM 培地に移行させ 血清を 5% 以上低減させることができます Opti-MEM 培地は 複合体形成前のトランスフェクション試薬と核酸の希釈に適しており 試薬シリーズを用いた実験時の必需品となります Gibco 選択用抗生物質 Gibco ブランドの高品質な選択用試薬は 安定発現株の樹立 二重セレクションの手法などに有用です ( 表 2) 表 3. 真核生物用抗生物質 選択用抗生物質一般的な用途一般的な使用濃度サイズ ( 粉末タイプ ) サイズ ( 液体タイプ ) ブラストサイジン真核細胞 バクテリア 2 µg/ml 5 mg x ml, 2 ml ジェネティシン (G48) 真核細胞 2 µg/ml ( バクテリア ) 2 5 µg/ml ( 哺乳類細胞 ) g, 5 g, g, 25 g 2 ml, ml ハイグロマイシン B 真核細胞 二重選択実験 2 5 µg/ml 2 ml ミコフェノール酸哺乳類細胞 細胞性細胞 25 µg/ml 5 mg ピューロマイシン真核細胞 バクテリア.2 5 µg/ml x ml, 2 ml ゼオシン 哺乳類 昆虫 酵母 バクテリア 植物細胞 5 4 µg/ml 8 x.25 ml, 5 ml 6

17 トランスフェクション試薬トランスフェクション装置Ordering information Opti-MEM I Reduced-Serum Medium Gibco 選択用抗生物質トランスフェクション関連試薬In vivo トランスフェクション試薬7

18 Ordering information トランスフェクション試薬および機器 製品名サイズ製品番号価格 3 3 Transfection Kit. ml L3 9,9.75 ml L38 7,8.5 ml L35 6,4.5 ml 5 L375 47,3 5 ml L35 789,2 MessengerMAX Reagent MessengerMAX Reagent. ml LMRNA,4.3 ml LMRNA3 3,.75 ml LMRNA8 72,6.5 ml LMRNA5 3, 5 ml LMRNA5 845,9 RNAiMAX RNAiMAX Transfection Reagent. ml 3778,4.3 ml ,.75 ml ,7.5 ml ,3 5 ml ,9 CRISPRMAX CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent. ml CMAX,8.3 ml CMAX3 29,8.75 ml CMAX8 7,8.5 ml CMAX5 2, Expi293 Expression System Expi293 Expression System Kit* kit A ,9 ExpiFectamine 293 Transfection Kit x L culture A4524 7,4 x L culture A ,8 5 x L culture A4526 3,96,8 pcdna 3.4 TOPO TA Cloning Kit kit A ,6 * Expi293 Expression System (A4635) の構成品 Expi293F Cells( ml) 2 Expi293 Expression Medium( ml) ExpiFectamine 293 Transfection Kit ( L Culture) Antibody-Expressing Positive Control Vector Opti-MEM Reduced-Serum Medium( ml) ExpiCHO Expression System ExpiCHO Expression System Kit * 2 kit A , ExpiFectamine CHO Transfection Kit x L culture A2929 5, x L culture A , 5 x L culture A293 3,698, pcdna 3.4 TOPO TA Cloning Kit kit A ,6 * 2 ExpiCHO Expression System Kit(A2933) 構成品 ExpiCHO-S Cells, ( 7 cells) 2 ExpiCHO Expression Medium ( ml) ExpiFectamine CHO Transfection Kit ( L Culture) Antibody Expressing Positive Control Vector (A4662) OptiPRO SFM ( ml) Neon システム Neon Transfection System* 3 ユニット MPK5,, Neon Transfection System Starter Pack* 4 セット MPK5S,64, * 3 Neon Transfection System(MPK5) は Neon システム本体 Neon Pipette(MPP) Neon Pipette Station(MPS) で構成されています * 4 Starter Pack(MPK5S) には Neon Transfection System(MPK5) に Transfection Kit(MPK96 MPK96 各 キット ) が添付されています Neon 消耗品キット Neon Transfection System Kit ( μl) キット ( Neon チップ :96 本 ) MPK96 85, キット ( Neon チップ :25 本 ) MPK25 6,7 Neon Transfection System Kit ( μl) キット ( Neon チップ :96 本 ) MPK96 85, キット ( Neon チップ :25 本 ) MPK25 6,7 Neon Transfection Tubes パック ( 本 ) MPT 55, Neon Pipette ユニット MPP 78,8 Neon Pipette Station ユニット MPS 5, 8

19 製品名 サイズ 製品番号 価格 Invivofectamine 3. Invivofectamine 3. Reagent ml IVF3 58,4 5 x ml IVF35 588, その他のトランスフェクション試薬 2.3 ml ,5.75 ml ,3.5 ml 6689, ml 66827SP 35, 5.5 ml 6689SP 454,7 LTX. ml A262 9,9 (. ml.3 ml mlサイズには Plus 試薬が添付されています ).3 ml ,6 ml ,5 5 ml 53385,26,5 Plus Reagent.85 ml ,6 その他の関連試薬 Opti-MEM I Reduced Serum Medium Opti-MEM I Reduced Serum Medium ml ,9 5 ml ,9 mrna 転写キット mmessage mmachine T7 ULTRA Transcription Kit* 5 反応 AM345 96,8 5 反応 AMB3455 4,3 * 5 MessengerMAX Reagent (6ページ) を用いたトランスフェクション実験において mrna 転写産物を作製するための推奨試薬です Gibco 選択用抗生物質 ブラストサイジン Blasticidin S HCl ( mg/ml) x ml A393 6,9 2 ml A392 8,5 Blasticidin S HCl, Powder 5 mg R2 34,7 ジェネティシン (G48) Geneticin Selective Antibiotic (G48 Sulfate)(5 mg/ml) 2 ml 335 3,5 ml 327 9, Geneticin Selective Antibiotic (G48 Sulfate), Powder g 823 8, 5 g 83 54,7 25 g , ハイグロマイシン B Hygromycin B (5 mg/ml) 2 ml , ミコフェノール酸 Mycophenolic Acid 5 mg , ピューロマイシン Puromycin Dihydrochloride x ml A383 33,4 2 ml A382 62, ゼオシン Zeocin Selection Reagent 8 x.25 ml R25 43, ランスフェクション試薬トランスフェクション装置Ordering information In vivo トランスフェクション試薬トランスフェクション関連試薬9 記載の価格は 26 年 7 月現在の価格です 消費税は含まれておりません 価格は予告なしに変更する場合がありますので 予めご了承ください

20 トランスフェクションの詳細はウェブページも合わせてご覧ください 研究用にのみ使用できます 診断目的およびその手続上での使用はできません 記載の社名および製品名は 弊社または各社の商標または登録商標です 標準販売条件はこちらをご覧ください For Research Use only.not for use in diagnostic procedures. 26 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, used under permission and license. Zeocin is a trademark of Cayla, Ltd. Printed in Japan. IVN26-F67TY 販売店 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社本社 : 8-23 東京都港区芝浦 テクニカルサポート [email protected] オーダーサポート TEL: FAX: 営業部 TEL: FAX: