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ありさわたぬき
5 years ago
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1 1 アミノペプチダダーゼを用いた多様なジペプチドの生産法鳥取大学農学学部生物資源環境学科講師有馬二朗

2 研究背景短鎖ペプチドの有用性機能及び物性改善構成アミノ酸の栄養機能を有する単体アミノ酸の物性改善単体のアミノ酸には無い優れた生理機能を発揮医療食品分野での幅広い応用が期待!! < 食品 > 塩味 L-Ala- L- Lys HCl 甘味 L-Asp- L- Phe-OMe ( アスパルテーム ), L- Asp- D- Ala-fenchyl ester( アリテーム ) 血圧降下 L-Val- L- Tyr, L- Tyr- L- Tyr, L- Tyr- L- Thr, L- Ile- L- Tyr, L- Pro- L- Trp, L- Xaa- L- Pro その他多数坑潰瘍抗疲労 β-ala- L- His( カルノシン ), β-ala-1-methyl- L- His( アンセリン ), β-ala- L- BCAA < 医療 > 鎮痛 L-Tyr- L- Arg( L- キョートルフィン), L- Tyr- D- Arg( D- キョートルフィン ) 抗不安作用 L-Tyr- L- Leu, L- Phe- L- Leu, L- Trp- L- Leu 抗高血糖 cyclo ( L- Pro- L- His) 抗原免疫増強 D-Ala- L- Gln-octadecyl ester 抗生物質 cyclo ( L- Phe- L- Leu) 抗がん剤前駆体 cycle ( L- Phe- L- His) 輸液成分 L-Ala- L- Gln( グルタミンの安定化 ), L- Ala- L- Tyr( チロシンの水溶化 ) <その他 ( 農薬 )> アフラトキシン生合成阻害 cyclo ( L- Pro- L- Leu), cyclo ( L- Pro- L- Val), キチナーゼ阻害 cyclo ( D- Pro- L- Arg) 蛋白質安定化 β-ala- L- Orn- L- Orn 2

3 従来技術でのペプチド合成汎用性工程製造コスト特殊な溶媒や ( 材料試薬担体 ) 試薬の必要性化学合成高中低多中少高中低有一部無固相合成 : 液相合成 : 酵素合成プロテアーゼの逆反応 : アミノ酸リガーゼ : 酵素分解 : 発酵発酵法 : * 化学合成は汎用性が高く収量も多いこととが利点として挙げられ合成においては主流となっているが有害廃液や特殊な試薬のの使用など環境に与える負荷が大きいまた工程が多く N- 修飾アミノ酸を利用するる必要がありコストの面でも不利であるその他の合成法は汎用性に問題がありココストが高いものも存在する 3

4 4 酵素法によるペプチド合成汎用性基質特異性に依存酵素基質特異性を広げる酵素のバリエーションを増やすコスト基質の値段添加剤の有無工程の簡素化 N- 修飾アミノ酸を使わない単純な反応を触媒する酵素を選択変換率の良い反応系を確立環境への負荷特殊な試薬を使わない水アルコールを溶媒として利用出来る酵素を選択

5 5 アミノペプチダーゼアミノペプチダーゼペプチドアミノペプチダーゼ : ペプチドのN 末端アミノ酸を認識し順次単体のアミノ酸を遊離する反応を触媒ペプチド合成能があればアミノ基がフリーのアミノ酸 ( ) を基質として利用可能?? ロイシンアミノペプチダーゼアミノペプチダーゼN アミノペプチダーゼP プロリンンアミノペプチダーゼメチオニンアミノペプチダーゼ D- アミノペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼトリペプチジルアミノペプチダーゼなどなど

6 6 新技術の基となるる研究成果技術広い特異性を持つアミノペプチダーーゼの逆反応アミノリシス反応を利用したジペプチド合成に成功逆反応 H 2 N R1 C OH O = アミノリシス H 2 N H 2 N R1 R2 C O R2 O = C OR3 O = H 2 N R3 H 2 O R2OH H 2 H 2 N N R1 R1 C NH O = C NH R3 O R2 C OR3 O = 既に合成可能なペプチドの合成法改良既知有用ジペプチドの新規合成法確立未知有用ジペプチドの探索と同定 = ドの探索と同定使用酵素 : ファミリー M28アミノペプチダーゼ ( 逆反応 ) ファミリー S9アミノペプチダーゼ ( アミノリシス反応 ) ファミリー S12アミノペプチダーゼ ( アミノリシス反応 )

7 7 ペプチド合成法 1 ファミリー M28アミノペプチダーゼ : ジペプチド合成能 TLC HPLC MS 98% アルコール溶媒中ル溶媒中 PheとPhe-OMe から強いPhePhe-OMe 合成能が確認

8 8 ペプチド合成法 1 ファミリー M28アミノペプチダーーゼ : 合成における基質特異性ファミリー M28 アミノペプチダーゼによるジペプチド合成メカニズム : 逆反応 N C + N C フリーのアミノ酸 ~ アシル供与体 (N 側 ) アミノ酸エステル ~ アシル受容体 (C 側 ) N C N C アミノ酸アシル供与体の特異性 w/ Phe-OMe アミノ酸メチルエステルジペプチドアシル受容体の特異性 w/ free Phe

9 9 ペプチド合成法 1 ファミリー M28アミノペプチダーゼ : 既知有用ジペプチドの合成 AspPhe-OMe 合成 ( 合成甘味料 ) ValTyr-OMe 合成 ( 血圧降下剤の前駆体 ) AlaTyr-OMe 合成 ( 輸液成分 )

10 10 ペプチド合成法 1 ファミリー M28アミノペプチダーゼ : 合成可能なペプチド N 末側のアミノ酸 : L- アミノ酸疎水芳香族極性塩基性酸性 L-Ala L-Phe Gly L-His L-Asp L-Val L-Tyr L-Ser L-LysLys L-Glu L-Leu L-Trp L-Thr L-Arg L-Ile L-Asn L-Met L-Gln L-Pro +α: 非タンパク質性 L-α- アミノ酸非天然 L-α- アミノ酸 AlaDOPA-OMe 合成 (DOPA の水溶性改善に期待 ) C 末側のアミノ酸 : L- アミノ酸エステル疎水芳香族極性塩基性 L-Ala L-Phe Gly L-Lys L-Val L-Tyr L-Ser L-Arg L-Leu L-Trp L-Thr L-Ile L-Cys L-Met L-Asn +α: 非タンパク質性 L-α- アミノ酸非天然 L-α- アミノ酸合成可能な有用ジペプチド L-Asp-L L- Phe-OMe ( アスパルテーム ) L-Val- L- Tyr ( 血圧降下 ), L- Tyr- L- Tyr ( 血圧降下 ) L-Tyr- L- Thr ( 血圧降下 ), L- Ile- L- Tyr ( 血圧降下 ) L-Pro- L- Trp ( 血圧降下 ), L- Tyr- L- Leu ( 抗不安 ) L-Phe- L- Leu ( 抗不安 ), L- Trp- L- Leu ( 抗不安 ) L-Ala- L- Tyr ( 輸液 ) その他

11 11 ペプチド合成法 2 アミノリシス反応を用用いたペプチド合成 ( セリン型アミノペプチダーゼ )

12 12 ペプチド合成法 2 SDS-PAGE ファミリー S9 アミノペプチダーゼ : 酵素の性質我々が取得した S9 アミノペプチダーゼ (SDS-PAGE のレーンno.) 1. Streptomyces thermocyaneoviolaceus 由来 2. Streptomyces coelicolor 由来 3. Streptomyces griseus 由来 4. Acid dthermus 由来特徴 S9アミノペプチダーゼの触媒作用によるペプチド結合形成反応の特徴水溶液中でのペプチド結合形形成反応が可能特異性が広く特殊構造を持持つアミノ酸をペプチドに組み込む能力を有する配列の制御が厳密で目的ののペプチドをピンポイントに合成可能

ペプチド合成法 2 ファミリー S9アミノペプチダーゼ :β-ala 含有ペプチド合成能

from Streptomyces thermocyaneoviolaceusv β-ala-bcaa

β-ala-ile-ome 基質濃度生成物濃度変換率 β-ala-obzl His-OMe 20 mm

13 ペプチド合成法 2 ファミリー S9アミノペプチダーゼ :β-ala 含有ペプチド合成能 β-ala-his( カルノシン ) 合成 UPLC-ESI-TOF/MS 分析使用酵素 *:S9AP from Streptomyces thermocyaneoviolaceusv β-ala-bcaa 合成 β-a Ala-Val-OMe β-ala-leu-oet 酵素なし酵素なし β-ala-ile-ome 基質濃度生成物濃度変換率 β-ala-obzl His-OMe 20 mm 20 mm 64mM % 5 mm 40 mm 4.7 mm 94 % 5 mm 60 mm 5.0 mm 100 % 酵素なし 13

14 ペプチド合成法 2 ファミリー S9アミノペプチダーゼ :Pro 含有環化ペプチド合成能 cyclo ( L- Pro- L- His)( 抗高血糖 ) 合成 UPLC-ESI-TOF/MS 分析使用酵素 *:S9AP from Streptomyces thermocyaneoviolaceus 生成物の時間変化基質濃度生成物濃度変換率 Pro-OBzl His-OMe 20 mm 20 mm 8.2 mm 41 % 合成可能な有用ジペプチド β-ala- L- His( 抗疲労 ), β-ala- L- BCAA( 抗疲労 ), β- Ala-1-methyl- L- His( 抗疲労 ), L-Pro- L- Trp ( 血圧降下 ), c( L- Pro- L- His)( 抗高血糖 ) c( L- Phe- L- His)( 抗ガン剤前駆体 ) c( L- Pro- L- Leu)( アフラトキシン生合成阻害 ) c( L- Pro- L- Val)( アフラトキシン生合成阻害 ) その他 14

15 15 ペプチド合成法 2 ファミリー S12アミノペプチダーゼ : 酵素の性質 S12 アミノペプチダーゼ : 加水分解活性は D 体特異的活性中心にセリン残基を持つ 1 2 S9アミノペプチダーゼ (SDS-PAGEのレーンno.) 1. Streptomyces sp. 82F2 由来 2. Streptomyces sp. 83D12 由来配列の上で本酵素と3~6 割の相同性を持つ酵素は存在するが本酵素が持つ性質 ( アミノペプチダーーゼ活性とペプチド合成活性 ) 放線菌由来の酵素特有の性質である S12アミノペプチダーゼの触媒作用によるペプチド結合形成反応の特徴水溶液中でのペプチド結合形成成反応が可能特異性が広く特殊構造を持つアミノ酸をペプチドに組み込む能力を有する配列の制御が厳密で目的のペペプチドをピンポイントに合成可能

16 ペプチド合成法 2 ファミリー S12アミノペプチダーゼ : 広い特異性生成物の特徴特徴 D-アミノ酸エステル D-,D-ジペプチド L-アミノ酸エステル L-,L-ジペプチドエステル D- アミノ酸エステル + L- アミノ酸 D-,L- ジペプチド D-アミノ酸エステル + L-アミノ酸酸エステル D-,L-ジペプチドエステル環化ジペプチド R 1 R 3 R 2 -OH R 1 H R 3 H 2 N C OR 2 H 2 N C OR 4 H 2 N C N C OR 4 O O O O アシル供与体アシル受容体使用酵素 *:S9AP from Streptomyces sp. 82F2 アシル供与体のみになれる基質 D-Ala D-Val D-Pro D-HisD アシル供与体にも受容体にもなれる基質 L-LeuLeu D-Leu L-Met Mt L-Phe D-Phe L-Trp D-Trp L-Tyr D-Tyr アシル受容体のみになれる基質フリー L- アミノ酸 (L-Pro L-Asp, L-Glu 以外 ) Gly L-Ala L-ValL L-IleL L-Met L-Ser L-Thr L-Asn L-Gln L-His L-Arg L-LysLys L-Asp L-Glu 16

17 17 ペプチド合成法 2 ファミリー S12アミノペプチダーゼ :D-L-ペプチド合成能 cyclo ( D- Pro- L- Arg)( キチナーゼ阻害 ) 合成使用酵素 *:S9AP from Streptomyces sp. 82F2 ESI-TOF/MS 基質 20 mm から生成物 10.3 mm 生成物の時間変化変換率 :5 割以上基質濃度を変える ( 上げる ) ことで更に高生産の系の確立が可能合成可能な有用ジペプチド L-Tyr- L- Tyr ( 血圧降下 ), L-Tyr- L- Thr ( 血圧降下 ), D-Ala- L- Gln-octadecyl ester c( D- Pro- L- Arg)( キチナーゼ阻害 ) その他

18 今後のの展開 18

19 従来技術とそペプチド合成の手法として化学ペプチド合成の手法として化学有害廃液や特殊な試薬の使用な有害廃液や特殊な試薬の使用な有害廃液や特殊な試薬の使用な有害廃液や特殊な試薬の使用ないことに加えことに加え工程が多い工程が多いことこと化学合成法以外で既に実用化さ化学合成法以外で既に実用化さガーゼを大腸菌に組み込み発酵ガーゼを大腸菌に組み込み発酵菌体内のシステムを作り変えたも菌体内のシステムを作り変えたも乏しく乏しく多くの有用ペプチドを合成多くの有用ペプチドを合成また酵素合成法においてはまた酵素合成法においては金反応によるアスパルテーム合成研反応によるアスパルテーム合成研反応によるアスルテム合成研反応によるアスルテム合成研問題や変換率の低さ高価な基問題や変換率の低さ高価な基問題点を有する問題点を有する問題点を有する問題点を有するその問題点学合成が頻繁に利用されるが学合成が頻繁に利用されるがなど環境に与える負荷が大きなど環境に与える負荷が大きなど環境に与える負荷が大きなど環境に与える負荷が大きとが問題点としてあげられるとが問題点としてあげられるされているものにはされているものにはアミノ酸リアミノ酸リ酵で酵で Ala Ala-Gln Gln を合成を合成できるようできるようものも存在しているがものも存在しているが汎用性に汎用性に成するまでには至っていない成するまでには至っていない金属酵素サーモライシンの逆金属酵素サーモライシンの逆研究研究が盛んであるが特異性の研究が盛んであるが特異性の研究が盛んであるが特異性のが盛んであるが特異性の基質工程の数段階に及ぶ等の基質工程の数段階に及ぶ等の 19

20 20 新技術の特徴従従来技術との比較酵素法に限れば従来技術のの問題点であった汎用性汎用性の点で改良することに成功した従来の酵素法はエンドペプチチダーゼを利用した逆反応であったため N- 修飾アミノ酸を使用用する必要があったが本技術はアミノペプチダーゼを利用すすることで単純なアミノ酸やエステルのみを利用することで合合成が可能となったためコストを下げることが可能であると予予測される酵素の大量調整法もすでに確確立している本技術の適用により合成の工程が簡素化できるため最終的に製造コストが~1/2 程度まで削減されることが期待される

21 21 想定されれる用途本技術の特徴を生かすためには医薬中間体農薬などの製造に適用することで安全かつ効率的的に生産できるメリットが大きいと考えられる上記以外に様々な新奇有用ペププチド系化合物の開発への効果がの効果が得られることも期待されるまた達成された有用ジペプチド合合成に着目すると機能性食品製造や化粧品といった分野や用途に展開することも可能と思われる利用者対象想定されれる業界医薬農薬機能性食品製造造メーカー新薬など新奇機能性物質創新奇機能性物質創創成における開発事業

22 22 実用化に向向けた課題現在様々な有用ペプチド合成について 1ポット合成が可能なところまで開発済みしかし合成のシシステムの点が未解決である今後固定化酵素の作成とシステム化について実験データを取得しバイオリアクターに適用していく場場合の条件設定を行っていく実用化に向けて汎用性に加え標標的合成物質の変換率の精度を~ 80% まで向上できるよう技術を確確立する必要もあり企業へへの期待未解決のシステムについては固固定化酵素の作成とバイオリアクターへの応用技術により克服できると考えている新奇生理活性物質の評価技術をを持つ企業との共同研究を希望

23 23 本技術に関すする知的財産権発明の名称 : プロリンおよびβ- アラニンを N 末端に有するジペプチド及びその環化ジペプチドの酵素合成法出願番号出願人発明者 : 特願 : 鳥取大学 : 有馬二朗森本正純発明の名称出願番号出願人発明者 :D-,, L- ペプチドの立体選択的的合成法 : 特願 : 鳥取大学 : 有馬二朗伊藤瞳参考発明の名称出願番号出願人発明者 : ジペプチドの製造方法 : 特願 : 岡山県 : 畑中唯史有馬二朗

24 24 産学連携携の経歴 2007 年年長瀬産業株式会社と有用酵酵素の共同開発を実施 2008 年年 JST 地域イノベーション創出総合支援事業重点地域研究開発推進プログラム平成 20 年度シーズ発掘試試験 ( 発掘型 ) に採択 2009 年年 JST 地域イノベーション創出総合支援事業重点地域研究開発推進プログラム平成 21 年度シーズ発掘試試験 ( 発掘型 ) に採択 2010 年 - おしどり薬局有限会社と好熱熱菌発酵技術の共同開発を実施お問い合合わせ先鳥取大学農学部講師有馬二朗 TEL , FAX arima@muses.tottori-u.ac..jp 鳥取大学産学地域連携推進機構知的財産管理運用部門長教授佐々木茂雄 TEL , FAX s.shigeo@cjrd.tottori-u.ac.jp

Microsoft PowerPoint 説明資料（きのこを活用してGABA富化素材を作る）林産試験場

Microsoft PowerPoint 説明資料（きのこを活用してGABA富化素材を作る）林産試験場きのこを活用して GABA 富化素材を作る説明内容はじめにきのこと GABA のこと本技術の開発と技術内容 GABA に着目した理由きのこのGABA 生産能素材の機能性評価素材生産プロセスの効率化本技術の活用素材の多様化用途企業等への期待課題展開施設栽培により生産されているきのこ GABA( ギャバ ) の機能性血圧上昇抑制精神安定成長ホルモン分泌促進その他記憶学習促進体重低減血中の中性脂肪低減