東京都臨床検査技師会第 8 回微生物検査研究班研修会 菌力アップトレーニング 菌トレ ~ 基礎的な細菌編 ~ 東京医科大学微生物学分野大楠清文 E mail: ohkusu@tokyo med.ac.jp 2017 年 1 月 6 日 菌 分類 命名 同定の概念 分類の対象となる最小単位は 菌株 Strain 1 分類 classification 類似性に基づいて菌株を秩序正しく配列する 2 命名 nomenclature 1 のグループの単位に学名をつける 3 同定 identification 分離菌株が 1 と 2 によって定義 命名されたグループ ( 菌種 ) のどれに属するかを決定する 同定キットや自動同定機器 ( 数値同定 ) エンテロチューブⅡ IDテストHN20ラピッド API20E 同定キット 価格 500 円台 ~800 円台 ミニテックYYシステム MALDI Biotyper メインスペクトル (MSP) コンセプトピークの位置 強度 出現頻度の情報からパターンママッチングを行う. その際にノイズを減算し質量補正も実施される. 2.0 < Score Value < 3.0 Strain 1 Strain 2 Strain 3 Strain 4 Strain 5 Rank 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Matched Pattern Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 DSM Pseudomonas aeruginosa 8147_2 CHB Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 THL Pseudomonas aeruginosa A07_08_Pudu FLR Pseudomonas aeruginosa 19955_1 CHB Pseudomonas aeruginosa DSM 50071T HAM Pseudomonas indica DSM 14015T HAM Pseudomonas jinjuensis LMG 21316T HAM Pseudomonas resinovorans LMG 2274T HAM Pseudomonas citronellolis DSM 50332T HAM Score Value 2.188 2.179 1.983 1.943 1.821 1.78 1.55 1.49 1.417 1.393 起炎菌同定の思考フレーム臨床情報 検体採取のタイミング検体種使用培地培養環境 期間 染色像 起炎菌はどれか? 簡易同定 or フルID 同定まで? 感受性試験も? 報告のタイミング疫学的視点 アウトブレイク? 追加試験 検査は? 培地の追加 培養環境変更 集落 & 五感 検体の到着確認 臨床情報の入手 反映はどのタイミング? 塗抹 培地塗布ここです! 1 塗抹鏡ここです! 検 2 ここです! 3 培地の観察 同定パネル選択 菌種のここです! 判定 4 薬剤感受性試験の判定 臨床サイドとの緊密なコミュニケーションが重要ハーモナイゼーション ; 相互理解と 協働 ここです! 5 菌種と薬剤感受性試験最終報告 1
血液培養液のグラム染色像 菌トレ 1 30 代男性感染性心内膜炎 サブカルチャー血液寒天培地 さて, この菌なんだろう? 1 Staphylococcus aureus 2 Staphylococcus intermedius 3 Staphylococcus schleiferi 4 Staphylococcus hyicus 5 Staphylococcus lugdunensis コアグラーゼ試験陰性クランピングファクター陽性 菌トレ 1 Staphylococcus lugdunensis 1988 年フランスのリヨン Lyon で初めて分離された リヨンのラテン語 ;Lugdunum に由来 コアグラーゼ / クランピングファクター試験 2013 ASM WS13 テキストより引用 コアグラーゼ / クランピングファクター試験陽性の菌種 M100S26 Table 2C 菌種 ( 亜種 ) コアグラーゼ試験 クランピングファクター S. aureus subsp. aureus S. hyicus d S. intermedius d S. pseudintermedius S. lugdunensis S. schleiferi subsp. schleiferi *Kocuria kristinae d PYR オルニチン ND 淡いクリーム色 / オレンジ色 2
鼻腔に S. lugdunensis がいると S. aureus 保菌率が有意に低下! S. lugdunensis が産生する lugdunin が S. aureus の定着を抑制する! A Zipperer et al. Nature 535, 511 516 (2016) doi:10.1038/nature18634 A Zipperer et al. Nature 535, 511 516 (2016) doi:10.1038/nature18634 菌トレ 21 80 代男性市中肺炎 & 敗血症 菌トレ 22 80 代男性市中肺炎 & 敗血症 さて, この菌の血清型はなんだろう? さて, この菌なんだろう? Streptococcus pneumoniae ムコイド型 (mucoid type) 血清型 3 (serotype 3) 血清型 3 の肺炎球菌は莢膜が厚く白血球に貪食されにくいため病原性が強い Otol Jpn 10(2):89 94, 2000 写真は西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による 耳鼻科医はムコイド型をすぐに知りたい! 3
ムコーズス中耳炎ムコイド型肺炎球菌が起炎菌の急性中耳炎 ( 難治性中耳炎 ) 臨床的にセフェム系薬は効果が低い (pbp2xの変異) 初期治療にセフェム系抗菌薬を使用した例では重症化することがある 一方, ペニシリンGに対する感受性が良好である ムコーズス中耳炎は, 小児に比べ成人に多い 激しい耳痛や頭痛, 噴出する耳漏, 両側性への進行, 内耳障害, 急速に進行する難聴などを呈し, 頭蓋内合併症での死亡例もある 早期の診断と治療開始が不可欠 ( ペニシリン系抗菌薬, 鼓膜切開, プレドニゾロンの投与 ) 13 価肺炎球菌結合型ワクチン (PCV13) 6 種の追加血清型 7 種の血清型 (PCV7) 4 6B 9V 14 18C 19F 23F 1 3 5 6A 7F 19A Carrier protein CRM 197 さて, この反応はなんだろう? 陰性陽性 IASR Vol. 34 p. 6768 Quellung 反応 ; 莢膜膨化 陰性 陽性 スライドグラス上にて肺炎球菌, 型特異抗血清, メチレンブルー溶液を混合し 光学顕微鏡 ( 1,000 倍 ) で検鏡する 肺炎球菌の莢膜抗原と抗血清に反応が起こらなければ, メチレンブルーで染色された菌体のみが見られる 莢膜抗原と抗血清が反応している場合, 莢膜に型特異抗体が結合することによって莢膜の膨化 (Quellung 反応 ) が見られる IASR Vol. 34 p. 6768 IASR Vol. 35 p. 234236 Sandra S. Richter et. al.:the Ongoing Genetic Adaptation of Streptococcus pneumoniae, JCM, 2017 4
血清型 35B 血清型 15A 胆汁溶解試験 対照 陽性 写真は那覇市立病院大城健哉先生のご厚意による Corynebacterium accolens がヒトの中性脂肪を分解して生じた遊離脂肪酸が肺炎球菌の増殖を抑制する トリオレイン リノレイン Lindsey Bomar et al. mbio 2016; doi:10.1128/mbio.0172515 Lindsey Bomar et al. mbio 2016; doi:10.1128/mbio.0172515 血液培養陽性グラム染色像 菌トレ 3 日齢 8 女児細菌性髄膜炎 S.aureus この反応なんだろう? さて, この菌なんだろう? β 溶血レンサ球菌の主な種類と性状 Species S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae S. dysgalactiae subsp. equisimilis S. equi subsp. zooepidemicus S. canis S. anginosus S. porcinus Lancefield group(s) A B C,(L) A,C,G,L C G A,C,G,F E,P,U,V 宿主 PYR ヒト ヒト, ウシ 動物 ヒト 動物 イヌ ヒト ブタ CAMP VP その他 / バシトラシン感受性 馬尿酸水解 () ソルビトール () 集落が小さい ソルビトール () PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase 5
こんな色の GBS もいるよ! さて, この色素は? PNAS vol. 101(40): 14491 14496, 2004 A 群溶血レンサ球菌 Streptococcus pyogenes 化膿性レンサ球菌 溶レン菌 β 溶血性レンサ球菌 苺舌 咽頭炎 扁桃炎 猩紅熱 丹毒 膿痂疹 劇症型 A 群レンサ球菌感染症続発症 急性糸球体腎炎 (AGN) リウマチ熱 (ARF) β 溶血レンサ球菌の主な種類と性状 Species S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae S. dysgalactiae subsp. equisimilis S. equi subsp. zooepidemicus S. canis S. anginosus S. porcinus Lancefield group(s) A B C,(L) A,C,G,L C G A,C,G,F E,P,U,V 宿主 PYR ヒト ヒト, ウシ 動物 ヒト 動物 イヌ ヒト ブタ CAMP VP その他 / バシトラシン感受性 馬尿酸水解 () ソルビトール () 集落が小さい ソルビトール () PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase PYR テスト PYR(L ピロリドニル β ナフチルアミド ) で菌の産生する L ピロリドニルペプチダーゼを検出する リドザイム PYR テスト (LSI メディエンス ) 希望納入価 :200 円 /1 本 菌トレ 4 70 代女性敗血症 陽性 陰性 陽性 :Streptococcus pyogenes, Enterococcus spp., Citrobacter spp. 陰性 : その他のStreptococcus spp.,salmonella spp., Proteus spp. 写真は西神戸医療センター山本剛氏のご厚意によるさて, この菌なんだろう? 6
Enterococcus casseliflavus Etymology: N.L. gen. n. casseli, of Cassel (Cassel yellow); L. adj. flavus, yellow; N.L. masc. adj. casseliflavus, yellow colored. 黄色 黄色 2 黄色 E. casseliflavus と類縁菌種の鑑別性状 E. gallinarum E. casseliflavus E. mundtii 運動性 黄色色素産生 リボース いま知りたい MALDI バイオタイパーを用いた菌種同定実践ガイドより引用 耐性遺伝子 耐性遺伝子の存在部位 感受性 (MIC μg/ml ) VCM TEIC vana プラスミド 64 >1,024 16 512 vanb バンコマイシン耐性腸球菌 (VRE) 遺伝子型と薬剤感受性の特徴 プラスミド / 染色体 4 1,024 0.5 128 vanc 染色体 2 32 0.51 菌種 E. faecalis E. faecium E. avium E. faecalis E. faecium E. gallinarum E. gallinarum vanc1 E. casseliflavus vanc2/3 E. flavescens 感染症法おける 5 類感染症 VRE; VCM の MIC 値が 16μg/ml 以上 E. casseliflavus の薬剤感受性パターンとして適当な組み合わせは次の 1~5 のどれか? 1 2 3 4 5 VCM >256 128 16 8 0.5 MIC(μg/ml) TEIC >256 2 >256 1 0.5 VRE と誤同定 ( 誤判定 ) しやすい菌は? Lactobacillus Pedicococus Leuconostoc Weissella Enterococcus Pedicococus Leuconostoc Weissella e.g., L. casei, L. rhamnosus, L. gasseri, L. crispatrus PYR LAP 6.5% NaCl α 溶血レンサ球菌の主な種類と性状 属名 / 菌種 Pairs, chains Clusters, tetrads PYR Enterococcus Facklamia languida Lactococcus Aerococus sanguinicola Vagococcus Abiotrophia Granulicatella Gemella Gemella haemolysans Globicatella Aerococus viridans Weisella Aerococus urinae Pediococcus エスクリン (), アルギニン () Viridans group streptococci Leuconostoc LAP NaCl その他 バンコマイシン耐性 バンコマイシン耐性 PYR; Pyrrolidonyl aminopeptidase ガス産生 (), アルギニン () ガス産生 (), アルギニン () 7
喀痰のグラム染色像 菌トレ 5 80 代女性市中肺炎 β ラクタマーゼ陽性 ( ニトロセフィン法 ) 菌トレ 5 Moraxella catarrhalis Branhamella catarrhalis Neisseria catarrhalis 集落を取ろうとするとズリズリん さて, この菌なんだろう? さて, あなたの施設では M. catarrhalis の同定をどのようにやって報告しますか? 1 同定キット 2 グラム染色像 & 触感 &βラクタマーゼ試験 3 上記 2の例外あり & 同定キット 4 上記 2&DNase 産生性 5 その他 8
千葉県こども病院感染症科 喀痰のグラム染色像 Moraxella catarrhalis ( 尿道分泌物のグラム染色像 Neisseria gonorrhoeae 髄液のグラム染色像 Neisseria meningitidis 小児感染免疫 2013 Vol. 25 (2) :151155 喀痰のグラム染色像 菌トレ6 80 代女性院内肺炎 & 敗血症 Acinetobacter baumannii A. baumannii calcoaceticus complex Acinetobacter baumannii Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter genomic species 3 Acinetobacter genomic species 13TU 2011 年に新種として記載 A. pittii A. nosocomialis さて, この菌なんだろう? 2015 年に新種記載 A. seifertii 9
ハウスキーピング遺伝子の塩基配列クラスター解析 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2016), 66, 4105 4111 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2016), 66, 4105 4111 菌トレ 7 60 代女性肝膿瘍 第 32 回日本環境感染学会での発表ポスターより引用 西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による 血液培養液 眼内液 写真は西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による Mustafa OM, AdurizLorenzo PM. N Engl J Med 2016;374:e33. 10
Klebsiella pneumoniae 過粘稠性の確認 Hypermucoviscosity ネバネバの度合い String Test ストリング テスト 高い粘稠性は maga( 染色体性 ) と rmpa( プラスミド性 ) の 2 つの遺伝子に関係する (Clin Infect Dis. 2006 May 15;42(10):13518.) maga は血清型 1 型 (K1) の莢膜合成に関与する さて, この試験は何とよばれていますか? Nadasy, A. at al. Clin Infect Dis. 2007;45:e2528 3 亜種 Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae subsp. pneumoniae K. pneumoniae subsp. ozaenae K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis VP 尿素分解 問 1 K. oxytoca との鑑別性状は? 問 2 Raoultella ornithinolytica (K. ornithinolytica) との鑑別性状は? カルバペネム耐性腸内細菌科細菌 (CRE) A.β ラクタマーゼ産生量の増加とポーリンの変化 染色体性の誘導型 AmpCセファロスポリナーゼを大量に産生し, 細菌の外膜に存在する薬剤の透過孔となっているポーリンが減少あるいは欠失したEnterobacter 属菌 プラスミド媒介性のDHA 型クラスCセファロスポリナーゼやCTXM 型 ESBLを多量に産生し, 同時にポーリンが減少したり欠失した肺炎桿菌など B. カルバペネム分解酵素 ( カルバペネマーゼ ) の産生 カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌 (CPE) ClassA KPC,SME,NMC A,IMI,PER,GES,SFO,SFC,IBC ClassB IMP,VIM,NDM,SPM,GIM,SIM プラスミド ClassD OXA,PSE IMP の遺伝子 染色体 CLSI M100 S26, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 11
CIM vs. mcim 2016 asm microbe 336 AST Update: Clinical and Laboratory Impact CHROMagar TM ESBL/KPC ESBL 分画 耐性菌スクリーニング培地の活用 KPC 分画 CHROMagar TM ESBL CHROMagar TM MDRP クロモアガーオリエンタシオン /ESBL 分画培地 ( 関東化学 ) CRE 産生の K. pneumoniae オリエンタシオン分画 ESBL 分画 CHROMagar TM MDRA オリエンタシオン ESBL ESBL E. coli K. pneumoniae ESBL E. coli P. mirabilis 日本臨床微生物学雑誌 Vol. 25 No. 4 2015. 菌トレ 8 10 代男性集団食中毒 TSI SC LIM BTB 乳糖加寒天培地血液寒天培地 Rapid ID 32 キットでの同定結果 Hafnia alvei : 同定確率 91.5% ブドウ糖 : 分解 リジン : 陽性 乳糖 & 白糖 陰性 イント ール : 陰性 : 非分解 運動性 : 陰性 写真は川村千鶴子氏のご厚意による さて, この菌なんだろう? 12
Escherichia albertii 下痢症状を呈するバングラデイッシュの小児から分離 Albert らにより 1991 年に初めて報告 Escherichia albertii の生化学的性状と従来の分類 E. albertii 生物型 1* E. albertii 生物型 2* E. albertii 生物型 3 インドール リジン脱炭酸 * 生物型を 1 および 2 に分類したのは Nataro (2007) 該当する生化学的性状を示す菌株が従来分類されていた菌種 陰性 陽性 Hafnia alvei あるいは大腸菌 陽性 陰性 Shigella boydii 血清型 13 報告者 Huys et. al. 2003 Hyma et. al. 2005 陽性陽性大腸菌 Lindsay Oasks et. al. 2010 Ooka et. al. 2012 病原微生物検出情報 Vol.33 No5;2012.5 より引用 Escherichia albertii の生化学的な鑑別性状 生化学的性状が非定型的な大腸菌 ( 運動性なし, ラクトース陰性, キシロース陰性 ) eae 陽性 stx2f 陽性 EPEC E. albertii eae EHEC E. albertii stx2f EPEC(eae) または EHEC(stx2f) と登録して, 生化学的性状の項に E. albertii と記入する E. albertii に特徴的遺伝子 (E. albertii の病原因子 ) を検索する ;clpx, lysp, mdh 13
非定型的な Escherichia albertii 株もあるよ! TSI LIM SIM BTB XLD SIB TSI LIM SIM BTB XLD SIB 白糖陽性やキシロース陽性の株もあるようです! 天草地域医療センター磯崎将博氏のご厚意による 腸管出血性 EHEC 毒素原性 ETEC 腸管侵入性 EIEC 腸管病原性 EPEC 下痢原性大腸菌の分類 分類 発症機序 主な病原 因子 腸管凝集付着性 EAggEC 定義 毒素 stx1, stx2 Stx 産生性あるいはStx 遺伝子が確認されたもの ( 保菌者も含む ) 毒素 LT, ST 易熱性エンテロトキシン (LT) 耐熱性エンテロトキ シン (ST) のどちらかあるいはその両者の産生性 あるいは毒素遺伝子が確認されたもの 侵入性 inve, ipah 組織侵入性プラスミドを保有 あるいは組織侵入 性遺伝子が確認されたもの 細胞局在付着性 細胞局在付着性 eae, bfpa, EAF aggr, CVD432 その他の下痢原性 不明 afa, asta, CDT, cnf 培養細胞への局在付着性 またはそれに関連する遺伝子が確認されたもの stx, LT, ST, 侵入性が確認されたものは除く 培養細胞への凝集付着性 またはそれに関連する遺伝子が確認されたものStx,LT,ST, 侵入性が確認されたものは除く上記 5つに該当しないが胃腸炎の原因菌と考えられるもの stx1 stx2 下痢原性大腸菌の病原因子 凝集接着因子 14
髄液のグラム染色像 菌トレ 91 70 代女性髄膜炎 培養翌日血液寒天培地の集落 菌トレ 92 70 代女性髄膜炎 血液培養液のグラム染色像 サブカルチャー血液寒天培地 BTB 寒天培地 西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による さて, この菌なんだろう? Listeria monocytogenes グラム陽性桿菌 β 溶血 カタラーゼ試験陽性 BTB 寒天培地に発育 細胞内寄生性 ファゴゾーム膜を傷害 (hly; Listeriolysin O) して細胞質へ脱出, 増殖する 低温増殖性 ( 冷蔵庫 ;4 以下でも増殖 ) セフェム系抗菌薬に耐性 高齢者, 免疫不全者, 乳幼児は髄膜炎や敗血症等などの重篤な症状に陥ることもあり, 死亡率も 2030% と非常に高い また, 妊婦は流産, 早産や死産の原因となる S. pneumoniae L. monocytogenes 感度 90% 感度 30% 髄液 1000 髄液 1000 西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による Percentage of smear positive (%) 100 80 60 40 20 髄液中の菌数と塗抹検査の陽性率 0 25% 60% 97% 10 3 10 4 ~10 5 >10 5 (n=8) (n=20) (n=35) concentration (CFU/ml) La Scolea, L.J. J. Clin. Microbiol. 19:187190, 1984 西神戸医療センター山本剛先生のご厚意による 15
市販食品のリステリア菌汚染状況 1 薬事 食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用 市販食品のリステリア菌汚染状況 2 市販食品のリステリア菌汚染状況 3 薬事 食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用 微生物 ウイルス評価書食品中のリステリア モノサイトゲネス ( 案 ) 平成 25 年 1 月 17 日第 38 回微生物 ウイルス専門調査会 食品内のリステリア菌の増殖状況 薬事 食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より引用 食品健康影響評価のためのリスクプロファイル : 食品安全委員会 (2012 年 1 月 ) より引用 16
食品健康影響評価のためのリスクプロファイル : 食品安全委員会 (2012 年 1 月 ) より引用 菌トレ 10 30 代女性子宮頸癌手術後膿瘍形成 FMOX,IPM/CSを使用するも解熱せず いま知りたい MALDI バイオタイパーを用いた菌種同定実践ガイドより引用 膿汁培養 3 日目 ( 炭酸ガス ) 集落のグラム染色像 MALDI バイオタイパーによる測定 さて, この菌なんだろう? 1 Gardnerella vaginalis 2 Ureaplasma urealyticum 3 Mycoplasma genitalium 4 Mycoplasma hominis 5 Chlamydia trachomatis さて, この菌なんだろう? 17
菌トレ 10 Mycoplasma hominis グラム染色に染まらない ( 細胞壁なし ) 血液寒天培地に微小集落形成 (2~4 日 ) 膿汁 ( 子宮, 卵巣, 帝王切開創部ほか ), 関節液, 髄液, 羊水など 初代は嫌気培養が発育良好 術後感染症 ; 腹部, 胸部 ( 縦隔炎 ),PID, 関節炎, 髄膜炎のケースもあり EM(R),AZM(R),CLDM(S) PPLO 培地上の集落 (Dienes 染色 ) (X 100) 今日の菌トレメニュー 1 Staphylococcus lugdunensis 2 Streptococcus pneumoniae 3 Streptococcus agalactiae 4 Enterococcus casseliflavus 5 Moraxella catarrhalis 6 Acinetobacter baumannii 7 Klebsiella pneumoniae 8 Escherichia albertii 9 Listeria monocytogenes 10 Mycoplasma hominis 菌 18