ACQUITY UPLC TM /MS/MS と GC/MS/MS によるベビーフード中の残留農薬の分析 No. 720007 20001436J 概要 EU の Baby Food Directive 2003/13/EC 1) では ベビーフード中の使用が禁止されている残留農薬について明示しています その濃度が 0.003mg/kg を超えているのか あるいは 0.004-0.008mg/kg の間である MRL(Maximum Residue Limits) 内にあるのかを示す必要があります この規制では LC/MS 分析が適する 7 種の農薬と 9 種の代謝物のような関連化合物と GC/MS 分析が適する 9 種の農薬と 3 種の関連化合物が示されています より高感度な一斉分析を可能にするために いくつかのサンプルの抽出 クリーンアップ法が検討されており アセトニトリルを用いた固相抽出による方法が果物 野菜や脂肪分からの農薬の分析に適用され報告されています 2)3) GC と HPLC はどちらも食品中の農薬の分析に多用されています Waters ACQUITY UPLC TM は分析時間を短縮し さらに感度を向上させることが期待されます 4) このアプリケーションノートでは HPLC/MS/MS UPLC TM /MS/MS GC/MS/MS を用いた 25 種の農薬と関連化合物を定性 定量するための迅速かつ高感度な分析条件を開発した内容について説明します サンプルの準備ベビーフード 10g を遠心分離管に量り取り 回収率のため各化合物を 0.001mg/kg スパイクしました アセトニトリル 10mL 無水硫酸マグネシウム 4g 塩化ナトリウム 1g を加え よく振ったのちにボルテクスにかけました GC/MSMS 分析の内部標準として 1μg/mLδ-HCH100μL を加えました 4300g で 5 分間遠心分離しました 上澄み液 1mL をの PSA(Primary Secondary amine) 吸着剤 50mg と無水硫酸マグネシウム 150mg が入った遠心分離用マイクロバイアルに移しました GC/MSMS 分析のために C18 200mg を加えました 30 秒間ボルテクスにかけたあとに 5000g で 1 分間遠心分離しました 上澄み液を GC/MSMS には直接 LC/MSMS には 10 倍希釈して注入し 分析しました 分析条件 Alliance 2795 セパレーションモジュールカラム :Sunfire TM C18 2.1 100 mm, 3.5 μm カラム温度 :40 移動相 :A)20mM 酢酸アンモニウム /90% メタノール B)20mM 酢酸アンモニウム /10% メタノールグラジェント :0%B(0 分 ) 100%B(13 分 ) 100%B(17 分 ) 流速 :0.3 ml/min 注入量 :50 μl ACQUITY UPLC TM システムカラム :ACQUITY UPLC TM BEH C 18 2.1 100 mm, 1.7 μm カラム温度 :40 移動相 :A)20mM 酢酸アンモニウム /90% メタノール B)20mM 酢酸アンモニウム /10% メタノールグラジェント :0%B(0 分 ) 100%B(5 分 ) 100%B(7 分 ) 流速 :0.3 ml/min 注入量 :50 μl Quattro Premier TM XE タンデム四重極型質量分析計イオン化 :ESI ポジティブキャピラリ電圧 :3.5kV ソース温度 :120 コリジョンガス :3.0e -3 mbar Agilent 6890 GC/7683 オートサンプラーカラム :Varian FactorFour VF-5ms 30mx0.25mmID, 0.25μm コンスタントフロー :1.0mL/ 分ヘリウム昇温条件 :50 (1.5 分 ) 200 (9 分 ) 200 (11 分 ) 280 (15 分 ) 注入法 :Cyro cooled PTV/solvent vent mode 注入量 :5μL Quattro microtm GC タンデム四重極型質量分析計イオン化 :EI+ トラップカレント :200μA ソース温度 :180 コリジョンガス :3.0e-3mbar
表 1. HPLC/MS/MS MRM パラメータ 表 2. GC/MS/MS MRM パラメータ 表 1 に HPLC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し 定量用のトランジション 確認用のトランジションとコーン電圧を設定しています 表 2 には GC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し 定量用のトラジションと確認用のトランジションを設定しています 表 3. HPLC/MS/MS 法による平均回収率と %RSD (n=7) 抽出法を検討するために 果物ベース じゃがいもベース シリアルベースのベビーフードに対して 7 回ずつの回収率試験を行いました 農薬類は各 0.001mg/kg をスパイクしました HPLC/MS/MS による測定結果を表 3 に示します 回収率は 85%-113% と良好でした また HPLC/MS/MS 法によって 0.0005μg/mL- 0.0100μg/mL の範囲で較正曲線を作成し 相関係数は 0.99 以上と直線性は良好な結果でした
表 4. HPLC/MS/MS を用いた場合のイオン比 HPLC/MS/MS 法では Disulfoton と Terbufos を除くすべての化合物が 0.001mg/kg レベルで S/N3 以上の感度で確認されました 農薬同定の確認は モニターされたイオンの比によって行われました 5) 表 4 には 3 種類のマトリクスを使用した回収率試験 (n=7x3=21) におけるイオン比を示します 2002/657/EC 5) Tolerance は EU による許容誤差の値です Disulfon と Terbufos を除き %RSD はこの許容誤差範囲内にあり 良好です Disulfon と Terbufos に関しては MRL レベルにおける確認用の MRM トランジションの感度が十分ではなかったために再現性が良好ではなかったと考えられます 表 5. UPLC TM /MS/MS 法による平均回収率と %RSD (n=7) 表 5 に UPLC TM /MS/MS 法による果物ベース じゃがいもベース シリアルベースのベビーフードに対する 7 回ずつの回収率試験を行った結果を示します 農薬類は各 0.001mg/kg をスパイクしました 回収率は 92%- 118% 再現性 %RSD は 11% 以下とすべての化合物に対して良好な結果でした また UPLC TM /MS/MS 法によって 0.0005μg/mL- 0.0100μg/mL の範囲で較正曲線を作成し 相関係数は 0.99 以上と直線性は良好な結果でした 表 6. UPLC TM /MS/MS を用いた場合のイオン比 UPLC TM /MS/MS 法では Disulfoton と Terbufos を含むすべての化合物が 0.001mg/kg レベルで S/N3 以上の感度で確認されました 表 6 には 3 種類のマトリクスを使用した回収率試験 (n=7x3=21) におけるイオン比を示します すべての化合物の %RSD は EU の許容誤差範囲内にあり 良好です UPLC TM を使用することにより感度が改善されたためと考えられます
図 4. UPLC TM カラムの安定性 図 4 に試料注入 4 回目と 308 回の Disulfoton sulfonr ピークの比較を示します 308 回注入の内訳は 64 回の溶媒注入と 244 回のマトリクス試料注入です ピーク形状は良好で 圧力の変動もなく安定した測定が可能でした 表 7. UPLC TM による平均回収率 %RSD イオン比 さらに 10 種類の異なるベビーフードに対し UPLC TM を用いた分析を行いました 農薬化合物各 0.001mg/kg をスパイクして測定したときの平均回収率と %RSD を表 7 に示します これら 10 種類のベビーフードには果物をベースとした低脂肪のものや肉類をベースとした脂肪分の高いものも含まれています (n=20) Demeton-s-methyl sulfone を除き 平均回収率は 89-104% %RSD は 12 以下と良好な結果が得られました Demeton-s-methyl sulfone に対しては再測定を行いましたが 高回収率が確認されました ブランクからの影響は見られなかったため この理由については今後検討して行く予定です 表 8. GC/MS/MS による平均回収率と %RSD 表 8 に GC/MS/MS 法による果物ベースとじゃがいもベースのベビーフードに対する 7 回ずつの回収率試験を行った結果を示します 農薬類は各 0.001mg/kg をスパイクしました 回収率は 71%-105% 再現性 %RSD は 19% 以下とすべての化合物に対して良好な結果でした また GC/MS/MS 法によって 0.0005μg/mL- 0.0100μg/mL の範囲で較正曲線を作成し 相関係数は 0.99 以上とすべての化合物に対し直線性は良好でした
図 5. 内部標準 δ-hch の面積値のレスポンス 図 5に Quattro micro TM GCにマトリクス試料を52 回注入したときの内部標準化合物 δ- HCHのレスポンス値を示します %RSDは5% と安定した結果でした 表 9 に 2 種類のマトリクスを用いた場合のイオン比と %RSD を示します EU による許容誤差範囲内で良好な結果が得られました 表 9. GC/MS/MS によるイオン比 参考文献 まとめベビーフード中の 25 種類の残留農薬とその関連化合物のの LC& GC/MS/MS 分析条件を示しました 抽出工程における回収率 規制レベルでの精度ともに高い結果が得られました UPLC TM を使用することによって より高い S/N 比が得られ 分析時間も約 2.5 倍スピードアップされました これらの結果は EU Baby Food Directive 2003/13/EC 1) に準拠しています このアプリケーションノートの内容は University of York(UK) Central Science Laboratory(UK) と Waters Corporation(UK) の共同研究によるものです