Microsoft PowerPoint - マトリックス効果対策と検量線について2 [互換モード]

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ひでかうづき
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1 マトリックス効果による異常回収率の対策について ~ PEG 共注入による対策 ~ 株式会社アイスティサイエンス

2 マトリックス効果対策異常回収率の原因は? 原因として注入口やカラムやイオン化室 (MS の場合 ) などの活性点が異常回収率 (100% 以上 ) を引き起こしていると考えられる標準試料 ( スタンタート ) スタンタート活性点 10 マトリックスを含んだ標準試料 (e.g. 添加回収試験 ) 10 マトリックスマトリックスが活性点をコーティング一部が活性点に吸着 5 5 検出されるスタンタートは減少している (10 5) 10 スタンタートを 100% として計算するため添加回収率が 200% となる検出されるスタンタートは活性点の影響を受けない

3 マトリックス効果対策検量線の問題について低濃度の検量線を作成した時に 2 次曲線に沿うような検量線になるような経験はないでしょうか? 60,000 高濃度のスタンダードピーク面積値 50,000 40,000 30,000 定量面積値 20, 活性点の影響 : 小 (100 95) 10,000 校正検量線から得られた濃度値直線検量線から濃度 (ppb) 得られた濃度値これを無理やり直線で検量線を作成した場合添加回収率試験や定量において大きな問題を引き起こす事があります低濃度のスタンダード 5 5 活性点の影響 : 大 (10 5) 低濃度程活性点の影響を受けやすくなる

4 異常回収率が引き起こす検量線の問題点マトリックス効果対策低濃度域を拡大 A 点検量線が Y 切片を切っている濃度 (ppb) 図 1. 検量線濃度 (ppb) 図 2. 検量線拡大図

5 マトリックス効果対策対策 :PEG 共注入法標準液 ( スタンダード ) にマトリックスのかわりに PEG( ポリエチレングリコール ) を添加しその PEG で活性点をコーティングすることでスタンタートの吸着を防ぐ標準試料 ( スタンダード ) スタンタート PEG マトリックスを含んだ標準試料マトリックス 10 活性点 PEG が活性点をコーティング 10 PEG が活性点をコーティング PEG が活性点をコーティングするためスタンタートは活性点の影響を受けにくい PEG が活性点をコーティングするためマトリックスの吸着による活性点の増大を防げる

6 マトリックス効果対策 PEG 共注入による効果 PEG 共注入による効果 [ クロマトクラム ] TIC : マトリックスによる異常回収率の低減感度向上 6.0E+07 PEG PEG PEG PEG PEG PEG ピーク形状の改善 4.0E+07 カラム劣化の防止検量線の直線性の向上 2.0E+07 PEG PEG PEG300 を使用 0.0E+00 R.T--> 10:00 15:00 20:00 25:00 30:00 35:00 ほとんどの農薬のリテンションタイムをカバーしているフラグメントイオンは主に100 以下しか持たないため農薬のマススペクトルと重なりにくい標準液 ( スタンダード ) だけでなく最終試験溶液にもPEG 共注入マトリックスによる活性点の増大をPEGのコーティングにより防ぐことができる PEG 共注入検量線法標準液 ( スタンダード ) にマトリックスのかわりに PEG( ポリエチレングリコール ) を添加して検量線を作成する手法マトリックス検量線の欠点である残留農薬の影響を受けない

7 マトリックス効果対策 PEG 共注入の使用方法 PEG300 の作成方法 PEG300を1g 秤とりアセトンで100mLにメスアップし 1%(w/v)PEGアセトン溶液を作成しその溶液を適量添加する使用上の注意点 GC 絶対量で約 500ngとなるようにPEG300をGCへ注入する少ないと効果が無く多すぎると吸着を引き起こし悪影響を及ぼす GCへ1μL 注入の場合 :500ppm(ng/μL) GCへ2μL 注入の場合 :250ppm(ng/μL) GCへ25μL 注入の場合 :20ppm(ng/μL) 必ずPEG300を使用する PEG400 以上は高沸点のPEGが分離カラムに残る可能性があり分離カラムの極性を変えてしまう GCの最終最高温度を310 まで上げる高沸点のPEGを分離カラムに残さない高温に対して耐久性のある分離カラムの選択 ( 例 : 最高使用温度 370 ) GC のインターフェース温度を 290 に設定する

8 マトリックス効果対策 PEG 共注入の使用方法 PEG300 の作成方法 PEG300を1g 秤とりアセトンで100mLにメスアップし 1%(w/v)PEGアセトン溶液を作成する 500ppm(ng/μL) の場合 :1%(w/v)PEGアセトン溶液 50μLを1mLで定容 250ppm(ng/μL) の場合 :1%(w/v)PEGアセトン溶液 25μLを1mLで定容 20ppm(ng/μL) の場合 :1%(w/v)PEGアセトン溶液 2μLを1mLで定容使用上の注意点 GC 絶対量で約 500ngとなるようにPEG300をGCへ注入する少ないと効果が無く多すぎると吸着を引き起こし悪影響を及ぼす GCへ1μL 注入の場合 :500ppm(ng/μL) GCへ2μL 注入の場合 :250ppm(ng/μL) GCへ25μL 注入の場合 :20ppm(ng/μL) 必ずPEG300を使用する PEG400 以上は高沸点のPEGが分離カラムに残る可能性があり分離カラムの極性を変えてしまう GCの最終最高温度を310 まで上げる高沸点のPEGを分離カラムに残さない

9 PEG 共注入によるクロマトグラム比較マトリックス効果対策ポジティブ効果ネガティブ効果 PEG 有 PEG 有 PEG 有 PEG 有 PEG 無 PEG 無 PEG 無 PEG 無ホスチアセートトリシクラソールイソサチオンイフロシオン PEG 有 PEG 有 PEG 有 PEG 有 PEG 無 PEG 無 PEG 無 PEG 無エティフェンホスヒラクロホスイミヘンコナソールアクリナトリン

10 日本食品衛生学会第 94 回学術講演会 PEG 共注入による効果農薬数 ( 成分 ) (ST のピーク面積 )/(PEG 共注入 ST のピーク面積 ) 面積比

11 農薬標準品の測定における問題点 GC/MS で農薬標準溶液を単品で測定した場合と混合標準溶液で測定した場合で同じ濃度にもかかわらず面積値が大きく異なる経験をしたことはありませんか? 本当に起きている? 原因は? 対策は? 検証実験

12 農薬 A 単品標準溶液混合標準溶液 ( 農薬 A+ その他農薬 ) 農薬 A 活性点原因の推測 GC/MS 分析におけるマトリックス効果と似たような現象がおきているのではないか? その他農薬活性点をその他農薬がコーティング一部が活性点に吸着農薬 A は活性点への吸着が抑制される単品標準溶液より混合標準溶液の方がピーク面積が大きくなる!

13 検証実験目的成分 : フェニトロチオンクロルピリホス検討内容 :1 単品標準溶液フェニトロチオン 0.5ppm 2 混合標準溶液 32 ( フェニトロチオンを含む ) 0.5ppm 3 混合標準溶液 34 ( フェニトロチオンを含まない )+フェニトロチオン 0.5ppm 4 上記 1+ポリエチレングリコール (PEG)300を一定濃度添加 5 上記 2+ポリエチレングリコール (PEG)300を一定濃度添加 6 上記 3+ポリエチレングリコール (PEG)300を一定濃度添加 * クロルピリホスも上記と同様に検討測定方法 : 上記 1~6をそれぞれスプリットレス注入法で2μL 注入し GC/MS 測定を行った

14 結果 - フェニトロチオンフェニトロチオン 0.5ppm [ フォルタ ] C : \ N o v a S p e c \ D a t a S T N 0. 1 : A N 0. 2 : A N 0. 3 : A N 0. 4 : A N 0. 5 : A N 0. 6 : A フェニトロチオン 0.5ppm 2uL スフリットレス注入 Area [ クロマトクラム ] Y 軸 : 相対値 ( % ) ( 面積計算範囲 : 1 2 : : 4 6 ) [ ] [ N o. 1 面積 : 0 ] [ N o. 2 面積 : 0 ] [ N o. 3 面積 : 0 ] [ N o. 4 面積 : 0 ] [ N o. 5 面積 : 0 ] [ N o. 6 面積 : 0 ] 単品標準溶液 ( フェニトロチオンのみ ) 混合標準溶液 32( フェニトロチオン含む ) 混合標準溶液 34( フェニトロチオン含まない )+ フェニトロチオン単品標準溶液 ( フェニトロチオンのみ )+PEG 混合標準溶液 32( フェニトロチオン含む )+PEG 混合標準溶液 34( フェニトロチオン含まない )+ フェニトロチオン +PEG300 1 が最も面積値が小さくピーク形状もテーリングを起している N o. 1 N o. 2 N o. 3 N o. 4 N o. 5 N o. 6 [ 0 ] R. T - - > 1 2 : : : : : : : : N o と 3 の面積値はほぼ同じで 1 よりもピーク形状面積値が高くなった PEG 添加によりピーク形状面積値ともに向上した (4 5 6)

15 結果 - クロルピリホスクロルピリホス 0.5ppm クロルピリホス 0.5ppm 2uL スフリットレス注入 [ フォルタ ] C : \ N o v a S p e c \ D a t a S T N 0. 1 : B N 0. 2 : B N 0. 3 : B N 0. 4 : B N 0. 5 : B N 0. 6 : B 単品標準溶液 ( クロルヒリホスのみ ) Area [ クロマトクラム ] Y 軸 : 相対値 ( % ) [ ] 混合標準溶液 32( クロルヒリホス含む ) 混合標準溶液 34( クロルヒリホス含まない )+クロルヒリホス単品標準溶液 ( クロルヒリホスのみ )+PEG 混合標準溶液 32( クロルヒリホス含む )+PEG 混合標準溶液 34( クロルヒリホス含まない )+ クロルヒリホス +PEG N o. 1 N o. 2 N o. 3 N o. 4 N o. 5 No. 6 [ 0 ] R. T - - > 1 2 : : : : : : N o が最も面積値が小さくピーク形状もテーリングを起している 2 と 3 の面積値はほぼ同じで 1 よりもピーク形状面積値が高くなった PEG 添加によりピーク形状面積値ともに向上した (4 5 6)

16 結果と対策本当に起きている? 単品標準溶液と混合標準溶液では同じ濃度に調製しても面積値が異なる現象を確認原因は? 標準溶液の濃度ではなく GC/MS 分析における要因 ( 単品のほうがより活性点への吸着を起しやすい ) が大きいことがわかった対策は? PEG300 の添加 ( 共注入 ) により農薬の活性点への吸着が抑制されより正確な定量値に近付けることができると考える

17 PEG 共注入の GC/MS 条件注入口条件 LVI-S200の場合 : 最高温度を290 とする Splitless 注入口の場合 : 設定温度を270 とするインターフェース MS 条件ポストカラム : 不活性化処理カラム 0.25mm 0.5M インターフェース温度 :290 * 高沸点の PEG をインターフェースに残さないため GC オーブン条件プレカラム : 不活性化処理カラム 0.25mm 0.5M プレスフィット分離カラム : PBX mm 30M, df.0.25um 最高使用温度 :360 * 高温条件に対して耐久性のある分離カラムを選択オーブン温度 : イオン化室温度 :260 最高温度を 310 (5min 以上 ) とする * 高沸点の PEG を分離カラムに残さないため

18 測定順序について GC/MS でのサンプル測定順序について検量線作成用のスタンダードをどの順序で測定すればよいのか? 各スタンダードをサンプルで挟んで測定する起爆注入 ( 標準溶液を注入する前に試料溶液を注入する ) マトリックス効果対策例 1) 1 ほうれんそう Blank dummy 2 ほうれんそう Blank 3 ほうれんそう 0.01ppm 添加 1 4 Standard 0.005ppm 5 ほうれんそう 0.01ppm 添加 2 6 Standard 0.01ppm 7 ほうれんそう 0.01ppm 添加 3 8 Standard 0.02ppm サンプル測定後はマトリックスが活性点をコーティングしているため吸着が抑制される

19 測定している分子数についてクロルピリホス ( 分子量 : 350.6) 10ppb を 1uL 注入した時の分子数は? 10ppb 1uL 注入 = 10pg = g g 個 MW: mol 個の原子分子の集団 1 mol の物質の質量 = 原子量分子量 [g] = 個 = 170 億個!

20 GC 大量注入と GC/MSMS GC/MSMS 高感度高選択性測定対象成分の絶対量が少ない場合再現性が損なわれやすいマトリックス効果の影響( 異常回収率 ) を受けやすい検量線の直線性が損なわれやすいどんなに感度が良くてもある程度の絶対量が必要 GC 大量注入 + GC/MSMS

21 検量線の種類について

22 検量線比較 :Pyributicarb 1 直線重み付け直線 2 次曲線対数 * 残農研の坂様からの助言

23 2 検量線と定量値比較直線化合物名 Pyributicarb 直線ファイル名濃度定量値 ( 回収率 %) A-S02 200ppb A-S03 100ppb A-S04 50ppb A-S05 20ppb A-S06 10ppb A-S07 5ppb A-S08 2ppb 検量線を作成したスタンダードの面積値でその検量線により定量値を求め回収率として表した理想は 100% になるはず重み付け直線化合物名 Pyributicarb 重み付け直線ファイル名濃度定量値 ( 回収率 %) A-S02 200ppb A-S03 100ppb A-S04 50ppb A-S05 20ppb A-S06 10ppb A-S07 5ppb A-S08 2ppb 次曲線対数化合物名 Pyributicarb 2 次曲線化合物名 Pyributicarb 対数ファイル名濃度定量値 ( 回収率 %) ファイル名濃度定量値 ( 回収率 %) A-S02 200ppb A-S02 200ppb A-S03 100ppb A-S03 100ppb A-S04 50ppb A-S04 50ppb A-S05 20ppb A-S05 20ppb A-S06 10ppb A-S06 10ppb A-S07 5ppb A-S07 5ppb A-S08 2ppb A-S08 2ppb

24 対数検量線への表記 3 濃度面積濃度面積二次曲線で得られる式は y=ax^2( 式 1) 式 1 の両辺を対数変換すると log(y)=log(a)+2log(x) ( 式 2) そこで log(y)=y log(x)=x log(a)=a と置き換えると Y=2X+A 式 (3) となり一次直線になります *JA あいちの永井様からの助言対数検量線にすると 2 次曲線も直線になる!

25 実際のデータによる各検量線直線検量線相関係数 = 濃度面積 A 対数検量線の相関係数が一番良好! 面積重み付き直線検量線検量線 :2 次曲線面積 ( 比率 )= *Q^ *Q 相関係数 = 検量線 : 対数面積 ( 比率 )= *Q^ 相関係数 = 次曲線検量線対数検量線 8 x10^n 相関係数 = 相関係数 = 相関係数 = 面積面積濃度 [ppb] x10^n 濃度 [ppb]

26 5 各検量線濃度面積 A High: A 1.2 Low: A 対数検量線の場合どの濃度においても面積 A に対して同じ比率での差で認識できる y = 18641x R² = y = x x R² = 直線検量線 2 次曲線検量線対数検量線

27 農薬残留研究会 GC/MS を用いた食品中残留農薬分析における検量線に関する検討株式会社アイスティサイエンス佐々野僚一谷澤春奈

28 目的厚生労働省が提示している食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドラインに従い比較検討している分析手法の妥当性評価を行っていたところ検量線の作成方法により回収率や精度の評価が異なることがわかった今回検量線の作成方法に着目し GC/MSを用いた食品中残留農薬分析における各種検量線の比較検討を行ったので報告する同じ前処理や測定でも検量線の作成方法により回収率や精度の評価が異なる!?

29 検量線の種類絶対検量線法内部標準法測定対象物質と内標準物質との物性の違いなどからその補正に関して問題視されることもあるが前処理工程や測定による影響を除去する手段として採用されている標準添加法 1) すべての検体について 2 回ずつ注入しなければならない,2) 添加した標準溶液の濃度よりも極端に高い濃度の農薬を検出した場合に誤差が大きくなり, 正確な試料濃度が求められない, などの理由により難しい面もあるが, マトリクスの影響を除去して測定する手段としては有用であると報告されているマトリックス検量線法前処理後の検液 ( マトリックス ) に標準液を添加して検量線を作成するためマトリックスの影響を除去して測定することが可能となるが標準液を添加する検液に測定対象農薬を含んでいないことが大前提となる

30 PEG 共注入検量線法検量線の種類標準液にマトリックスのかわりに PEG( ポリエチレングリコール ) を添加して検量線を作成する手法マトリックス検量線の欠点である残留農薬の影響を受けない [ クロマトクラム ] TIC : E E E+07 PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG 0.0E+00 R.T--> 10:00 15:00 20:00 25:00 30:00 35:00 効果マトリックスによる異常回収率の低減感度向上ピーク形状の改善カラム劣化の防止検量線の直線性の向上 PEG300 を使用ほとんどの農薬のリテンションタイムをカバーしているフラグメントイオンは主に 100 以下しか持たないため農薬のマススペクトルと重なりにくい標準溶液だけでなく最終試験溶液にも PEG 共注入マトリックスによる活性点の増大を PEG のコーティングにより防ぐことができる

31 実験方法添加回収試験 ( ほうれん草 : 添加濃度 0.01ppm) を行い同一の測定結果のピーク面積から次の各検量線を用いて定量しそれぞれの回収率を求めた A. 絶対検量線法 B. 絶対検量線法 (PEG 有 ) :A で作成した検量線用標準溶液に PEG300 を 20ug/mL になるように添加し再度検量線を作成 C. 内部標準法 (PEG 有 ) :Benfuresate を内部標準物質 (I.S.) として相対検量線を作成 D. マトリックス絶対検量線 (PEG 有 ) : 前処理後の検液に混合標準液を添加してマトリックス標準液を作成し検量線を作成 E. マトリックス内部標準法 (PEG 有 ) :Benfuresate を内部標準物質 (I.S.) として相対検量線を作成

32 添加回収試験 ( 回収率分布 ) 検量線種類検量線 A 検量線 B 検量線 C 検量線 D 検量線 E 溶液標準液標準液標準液マトリックスマトリックス PEG 添加の有無 PEG 無 PEG 有 PEG 有 PEG 有 PEG 有算出方法絶対検量線絶対検量線内部標準法絶対検量線内部標準法 50% 未満 % % % % 以上合計試料 ; ほうれん草添加濃度 ;0.01ppm 添加農薬成分数 ;114 成分

33 結果と考察標準液 - 絶対検量線のPEG 無とPEG 有を比較するとPEG 有の方が異常回収率 (120% 以上 ) の分布が少ないことがわかったまた標準液 - 絶対検量線法と標準液 - 内部標準法では内部標準法の方が異常回収率の分布がさらに少ないことがわかった PEG 有標準液とマトリックスではマトリックス検量線の方が良好な結果を得ることができたマトリックス検量線において絶対検量線と内部標準法の違いはあまり見られなかったが分取などの前処理での操作や機器での感度変動を考慮すると内部標準法を取り入れておく方が望ましいと考えられる今回の結果から妥当性評価を行う場合同じ分析手法でも検量線の種類が異なるとその評価まで大きく異なることがわかったまた今回比較検討を行った検量線ではマトリックス検量線が最も良い評価を得ることがわかった

34 今後の課題しかしマトリックス検量線は本当に最適なのだろうか? マトリックス検量線の問題点マトリックス検量線法はマトリックス標準液に測定対象農薬を含んでいないことが大前提となり実際の定量分析で検出された時の定量方法が問題となる標準添加法で定量マトリックス検量線法での妥当性評価を行った意味が薄れてしまいかねない今後の課題極性 PEG 共注入検量線法のように農薬を含んでおらずどのような測定対象物にも対応できるPEG 共注入検量線も有効のように思われるすなわちこのPEG 共注入を改良して PEGよりも効果があり農薬に影響を与えないPEGに代わる添加物質を探求することが必要なのかもしれない農薬を含んでいない測定対象検体と同じ種類の検体の抽出液でマトリックス検量線を作成その抽出液を常に準備しておかなければならない

35 今後の課題検量線の役割とは? 真の値はどこに?

表 1. HPLC/MS/MS MRM パラメータ表 2. GC/MS/MS MRM パラメータ表 1 に HPLC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し定量用のトランジション確認用のトランジションとコーン電圧を設定しています表 2 には GC/MS/MS

表 1. HPLC/MS/MS MRM パラメータ表 2. GC/MS/MS MRM パラメータ表 1 に HPLC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し定量用のトランジション確認用のトランジションとコーン電圧を設定しています表 2 には GC/MS/MS ACQUITY UPLC TM /MS/MS と GC/MS/MS によるベビーフード中の残留農薬の分析 No. 720007 20001436J 概要 EU の Baby Food Directive 2003/13/EC 1) ではベビーフード中の使用が禁止されている残留農薬について明示していますその濃度が 0.003mg/kg を超えているのかあるいは 0.004-0.008mg/kg