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れんかちづ
5 years ago
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LC/MS-TOF によるミジンコミジンコ飼育水中カイロモンの高感度分析高感度分析と同定横河アナリティカルシステムズ内田秀明徳島大院薬安元剛西上明則楠見武徳大井高 Page 1 水中でミシミシンコンコが放出放出するするカイロモンカイロモンを LC/TOF-MSで解明!

1 LC/MS-TOF によるミジンコミジンコ飼育水中カイロモンの高感度分析高感度分析と同定横河アナリティカルシステムズ内田秀明徳島大院薬安元剛西上明則楠見武徳大井高 Page 1 水中でミシミシンコンコが放出放出するするカイロモンカイロモンを LC/TOF-MSで解明!! ミジンココロニーへとへと形態変化し捕食者捕食者に抵抗 Hessen, D. O. and van Donk, E., Hydrobiologia, 127, (1993). カイロモン = 脂肪族硫酸エステル & 脂肪族硫酸アミドミジンコ飼育水飼育水から直接検出 & 同定できた Page 2 1

はじめに 1. 植物プランクトンがミジンコに捕食されにくくするため単細胞からコロニーに形態変化することが知られていたしかし微量であるため化合物は未解明であった 2. 我々は冷凍ミジンコメタノール抽出物から 24 化合物を単離した化学合成も組み合わせて活性本体が脂肪族硫酸エステル群であることを解明した 3.

2 はじめに 1. 植物プランクトンがミジンコに捕食されにくくするため単細胞からコロニーに形態変化することが知られていたしかし微量であるため化合物は未解明であった 2. 我々は冷凍ミジンコメタノール抽出物から 24 化合物を単離した化学合成も組み合わせて活性本体が脂肪族硫酸エステル群であることを解明した 3. 今回 LC/MS-TOF( 飛行時間型 LC/MS) を用いてオオミジンコ飼育水中からこれら活性物質の高感度直接検出を試みた Page 3 水環境中でのでのカイロモンカイロモン作用カイロモン魚変態ミジンコ Daphnia 動物プランクトン緑藻 Scenedesmus 植物プランクトン参考図書 : ミジンコ - その生態生態と湖沼環境問題 - 花里孝幸花里孝幸 Page 4 2

kg, frozen) 抽出と単離単離の概要 MeOH (20 L x 3) evaporation to 1/7 volume Aqueous suspension (9 L) Hexane (9 L) CH 2 Cl 2 (9 L) BuOH (9 L)

3 緑藻の形態変化 Scenedesmus gutwinskii var. heterospina (NIES-802) コントロール (10 日後 ) ( 捕食者無し ) Daphnia カイロモン (10 日後 ) ( 捕食者共存 ) 顕微鏡 200 倍写真 ( スケールは 50 µm) Page 5 Daphnia pulex (10 kg, frozen) 抽出と単離単離の概要 MeOH (20 L x 3) evaporation to 1/7 volume Aqueous suspension (9 L) Hexane (9 L) CH 2 Cl 2 (9 L) BuOH (9 L) Hexane Extract (42 g) BuOH Extract (18 g) Aqueous Extract (54 g) ODS column (MeOH/H 2 O = 1/1) HPLC (CAPCELLPAK C18, MeOH/H 2 O = 1/1) HPLC (CAPCELL PAK C18, 40% Acetonitrile/250 mmol NaClO 4 ) Active compounds CH 2 Cl 2 Extract (18 g) Page 6 3

3 mg) 20 (0.6 mg) 5 (10 mg) 13 (3.8 mg) 21 (1.

0 mg) 15 (0.8 mg) 8 (0.5 mg) 16 (0.5 mg) 23 (0.

5 mg) 色をつけた物は新規化合物 Page 7 活性形態変化活性の評価方法細胞コロニー

4 ミジンコブタノール抽出物抽出物からから単離単離されたされたカイロモン脂肪族硫酸エステル脂肪族硫酸アミド 1 (88 mg) 9 (3.6 mg) 17 (8.0 mg) 2 (5.0 mg) mg 18 (0.4 mg) 3 (20 mg) (0.8 mg) 4 (4.8 mg) 12 (0.3 mg) 20 (0.6 mg) 5 (10 mg) 13 (3.8 mg) 21 (1.5 mg) 6 (90 mg) 14 (2.0 mg) 22 (0.1 mg) 7 (8.0 mg) 15 (0.8 mg) 8 (0.5 mg) 16 (0.5 mg) 23 (0.2 mg) 24 (1.5 mg) 色をつけた物は新規化合物 Page 7 活性形態変化活性の評価方法細胞コロニー ( コロニーあたりのあたりの細胞数 ) Colony Number of Cells 1-cell type cell type cell type cell type 1 8 Page 8 4

合成化合物と SDSの活性 5 4 OSO 3 Na Cell per colony 4 3 2 1

5 合成化合物と SDSの活性 5 4 OSO 3 Na Cell per colony SDS Positive cont. 3.2 (Daphnia water, 10% v/v) Negative cont. 1.0 OSO 3 Na NHSO 3 Na OSO 3 Na ng/ml 4 は 1 ng/ml で強い活性を示した 5 は 1000~10 ng/ml で強い活性を示した各化合物は活性の至適濃度を持つ SDS は中程度の活性を示した Page 9 メチレンブルー法によるによるカイロモンカイロモン濃縮冷凍ミジンコ (Daphnia pulex) 本体からから単離単離したしたカイロモンカイロモンは陰イオンイオン界面活性剤オオミジンコ (Daphnia magna) 飼育水中に本当本当に存在存在するか? メチレンブルー法で濃縮濃縮を試みる ( 環境水中陰イオン界面活性剤の定量分析に使われている ) R OSO 3 Na N Cl (H 3 C) 2 N S N(CH 3 ) 2 R OSO 3 N Na Cl (H 3 C) 2 N S N(CH 3 ) 2 参考文献 : 日本分析化学会北海道支部偏, 水の分析, 化学同人, 1981; pp Page 10 5

6 ミジンコ飼育水中飼育水中の脂肪族硫酸脂肪族硫酸エステルエステルの検出オオミジンコ飼育水 654 nm での比色法エバポレーターで 50 倍濃縮ろ過 Sample Blank 陰イオンイオン界面活性剤総量 8 ng/ml! ( ブランク 0.4 ng/ml) LC/MS-TOF 分析 DOWEX 50WX8-100 陽イオンイオン交換樹脂交換樹脂でメチレンブルーメチレンブルーを除去 Page 11 LC/MS-TOFの概要 Page 12 6

精度の高い精密質量測定精密質量測定 ESI イオン源正確に測定測定するためのするための手順 1 定期的にチューニング 2 測定前にキャリブレーション 3 測定中に内部標準物質内部標準物質によるマス軸校正分析用スプレーマス軸校正軸校正用リファレンススプレー複数の基準物質基準物質を用いていてマスマス軸を平行移動平行移動し長さもさも調整調整する m/z 100.0000 m/z 100.

7 精度の高い精密質量測定精密質量測定 ESI イオン源正確に測定測定するためのするための手順 1 定期的にチューニング 2 測定前にキャリブレーション 3 測定中に内部標準物質内部標準物質によるマス軸校正分析用スプレーマス軸校正軸校正用リファレンススプレー複数の基準物質基準物質を用いていてマスマス軸を平行移動平行移動し長さもさも調整調整する m/z m/z m/z m/z Page 13 効率的で選択的選択的な LC/MS 測定 ESI( エレクトロスプレーイオン化法 ) 誘導体化せずに高極性化合物測定可能 Negative ion mode フラグメンター電圧調整バックグラウンド低いので簡便な前処理だけで測定可能 [M-H] - だけでなく適度なフラグメントも併せて検出する Page 14 7

8 分析条件 HPLC Instrument : Agilent 1100 Instrument : Agilent TOF Column : ZORBAX XDB-C18 Ionization : ESI MS i.d. 2.1 x 50 mm, 3.5µm Nebulizer : 3.5 x 10 5 Pa(N 2 ) Mobile phase : A=10mM CH 3 CO 2 NH 4 Drying gas : 10 L/min, 350 C (N 2 ) B=CH 3 CN Polarity : Negative Gradient (min.): Vcap : 5000 V (B%) Fragmentor : 250 V Post time : 5 min. (0.5 ml/min.) Scan : m/z 50~1100 Flow rate : 0.3 ml/min. Transients/scan : 10,000 Column temp. : 40 C References : m/z & Injection vol. : 10 µl Page 15 Intensity, cps 2.0e5 1.0e e4 2.0e4 標品のマスクロマトグラム各標品 [M H] - マスクロマトクラム (22 以外 100 ng/ml x 10µL 注入 ) 22 SDS m/z 97 マスクロマトクラム選択的検出可能 R-OSO 3 H m/z Time, min m/z 209 m/z 237 m/z 223 NHSO 3 H m/z 237 m/z 223 m/z 250 Page 16 8

標品の精密質量測定結果 No. [M-H] - m/z 理論値 m/z 測定値構造式 5 C 8 H 17 O 4 S 209.0853 209.0857 10 C 9 H 19 O 4 S 223.1009 223.1011 7 C 9 H 19 O 4 S 223.1009 223.1013 22 C 11 H 24 NO 3 S 250.1482 250.

9 標品の精密質量測定結果 No. [M-H] - m/z 理論値 m/z 測定値構造式 5 C 8 H 17 O 4 S C 9 H 19 O 4 S C 9 H 19 O 4 S C 11 H 24 NO 3 S C 10 H 21 O 4 S C 10 H 21 O 4 S SDS C 12 H 25 O 4 S NHSO 3 H Page 17 ミジンコ飼育水分析結果 ( 飼育水換算 200 倍濃縮 x 10µL 注入 ) 1.00e6 TIC 5.00e5 Intensity, cps 0 2.5e4 1.5e m/z 97 マスクロマトクラム m/z 237 マスクロマトクラム 4 SDS Time, min Page 18 9

10 ミジンコ飼育水飼育水からから得られたられた化合物化合物の MS スペクトル m/z フラグメンター電圧電圧を高めに設定するとすると生じるじるフラグメント m/z m/z から計算される実験式 ( 計算条件 :C 0~20 H 0~45 N 0~5 O 0~5 S 0~5 ) 候補 1: HO 4 S ( 誤差 0.1 mamu) 候補 2: C 4 HOS ( 誤差 -15 mamu) 候補 3: HO 2 S 2 ( 誤差 18 mamu) m/z から計算される実験式 ( 計算条件 :C 0~20 H 0~45 N 0~5 O 0~5 S 0~5 ) 候補 1: C 10 H 21 O 4 S ( 誤差 0.3 mamu) = 化合物 4の [M-H] - に一致候補 2: C 11 H 17 N 4 S ( 誤差 -1.0 mamu) 候補 3: C 14 H 13 S ( 誤差 2.3 mamu) Page 19 まとめ 1. ミジンコ本体から単離されたカイロモンをミジンコ飼育水から簡便な前処理だけで LC/MS-TOF を用いて同定できた 2. マス軸校正用内部標準物質を同時に測定することで精度の高い精密質量測定が可能であった 3. カイロモンの存在が推定されている例はあるが化学的に直接検出同定された例は稀である 4.SDS 等が自然界の微生物に及ぼす影響を簡単に迅速に分析できる Page 20 10

LC/TOF-MS MS ( )

LC/TOF-MS MS ( ) LC/TOF-MS MS () (TOF-MS) MS) LC/MS 1. 2. Agilent 1100 LC/TOF-MS MS ~0.25ppm / C ambient Compound Exact mass Positive Negative Purine 121.050873 TFA 112.985587 Hexakis(1H, 1H, 3H 922.009798 966.000725 1)