技術論文 質量分析法 VITEK MS と生化学的性状による 臨床分離株同定の比較検討 服部 拓哉 ) 村上いつか ) 西山 秀樹 ) 美濃島 慎 ) ) 名古屋第一赤十字病院検査部 - 要 池上志乃富 ) 山岸 宏江 ) 鈴木真由子 ) 湯浅 典博 ) 愛知県名古屋市中村区道下町 - 旨 マトリックス支援レーザー脱離 イオン化 飛行時間型質量分析 MALDI-TOF MS 法による細菌名同定に関する報告 は多数あるが 最新の MALDI-TOF MS 装置である VITEK MS と従来の細菌名同定法を比較した報告は少ない 我々は臨 床分離株 株を用いて VITEK MS と細菌の生化学的性状に基づく菌名同定機器 VITEK の菌名同定結果を比較した VITEK MS の同定率は属レベルで.% 種レベルで.% VITEK の同定率は属レベルで.% 種レベルで.0%で あった 属レベルでは VITEK の方が VITEK MS より高い同定率を示したが 種レベルでは VITEK MS が VITEK より 有意に高い同定率を示した 腸内細菌科の株では検査手技に起因して VITEK MS で菌種が同定できないことがあった 手 技の向上及びデータベースの整備により VITEK MS の同定率は上がると考えられる キーワード 質量分析 MALDI-TOF MS VITEK MS VITEK ので わずかな菌量で迅速な細菌同定が可能であ 序 る ), ) 本法による細菌同定結果に関する研究はこれ まで多数報告され それらでは菌名同定に関して従 近年 細菌感染症において薬剤耐性菌や抗菌薬適 来法と比較して本法が優れていることが示される一 正使用の観点から 起因菌の迅速かつ正確な同定が 方 問題点も指摘されている ), ), 7) 我々の調べ得た ますます重要となっている これまで臨床細菌検査 限りでは 最新の MALDI-TOF MS 装置であるVITEK 室では形態学的及び生化学的手法により菌名を同定 MS Sysmex biomérieux と従来法による同定結果 してきたが こうした同定には数時間から数日を要 を比較した報告は Dubois らの報告のみであり 本邦 する 一方 S rrna 解析等の分子生物学的手法 からの報告は極めて少ない ) 今回我々は VITEK は正確な同定に優れているがサンプル処理が煩雑で MS が従来法に劣らない細菌同定能を有するかどう あり 多量の検体を扱う臨床細菌検査室での日常検 かを明らかにするため VITEK MS と生化学的性状 査には不向きである に基づく菌名同定装置 VITEK コンパクト Sysmex ) ) 年 マトリックス支援レーザー脱離 イオ biomérieux による同定結果の比較を行った ン 化 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry I 対象及び方法 MALDI-TOF MS 法が開発され 蛋白質解析技術 ) が臨床細菌検査にも応用されるようになった ) 本法 による細菌同定は生化学物質の反応を必要としない 対象 対象は 0 年 月 月の ヵ月間に当院細菌 平成 年 月 日受付 平成 年 月 日受理 7 7
検査室に提出された臨床材料分離株 株である カード を用いた 全ての分離株は 時間の培養後 あるいはコロニー VITEK MS 及び VITEK が複数菌名を表示した場 が微小な場合は肉眼で確認できる大きさになるまで 合や属レベルまでしか同定ができなかった場合 そ 発育させた後 菌名同定を行った 分離培養にはポ れ以上の追加同定検査は行わなかった アメディア羊血液寒天培地 栄研化学 チョコレー 結果の解釈 ト寒天培地 極東製薬 パールコアマッコンキー寒 VITEK MS と VITEK 各機器によって菌名が得ら 天培地 栄研 栄研化学 またはカンピロバクター れた場合に同定率と両者の一致率を計算したが 血液無添加選択寒天培地 関東化学 を用いた Table に示すように同定率と一致率を算出する際 菌名同定検査 の 例 外を設けた VITEK MS では Table 左列に MALDI-TOF MS 法として VITEK MS とその専用 示す Acromobacter denitrificans A. xylosoxydans など 解析ソフトである VITEK MS ver..0 が有するデータ の菌 種 は判 別 が で き な い た め 統 一 菌 名 と し て ベースを用いた 分離培養後 独立した一つのコロ Acromobacter denitrificans/xylosoxydans などの右列に ニ ー を 釣 菌 し タ ー ゲ ッ ト ス ラ イ ド Sysmex 示す菌名を採用した biomérieux に直接塗布した その上に専用の CHCA 統計解析 マトリックス試薬 Sysmex biomérieux を.0 μl 滴 VITEK と VITEK MS の同定率は属レベルと種レ 下して 室温で十分に乾燥させた 検体毎に ベルにおいてそれぞれ McNemar 検定により比較し Esherichia coli ATCC 7 を較正スポットに塗布し P < 0.0 を統計学的有意差ありとした 解析ソフト 較正及び内因性コントロールとして使用した 全て は EZR The R Foundation for Statistical Computing, の菌株に スポット測定を適用し 蟻酸による蛋白 Perugia, Italy を用いた 抽出処理は行わなかった 従来法として細菌の生化学的性状に基づいて細菌 II 結 果 名判定を行う VITEK コンパクトを用いた コロニー の性状もしくはグラム染色結果によってそれぞれに 適した同定カード GP GN NH ANC 及び YST Table VITEK MS と VITEK の同定率 VITEK MS に よ り 属 レ ベ ル で 株 同 定 率 VITEK MS では判別が不可能な菌種の一覧 候補菌名 統一菌名 Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans Achromobacter denitrificans/xylosoxidans Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus mycoides Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis/amyloliquefaciens Corynebacterium amycolatum Corynebacterium xerosis Corynebacterium amycolatum/xerosis Enterobacter cloacae Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae complex Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri Lactobacillus acidophilus/gasseri Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Lactobacillus casei/paracasei/paracasei subsp. paracasei Proteus vulgaris Proteus penneri Proteus vulgaris/penneri Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae subsp. Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis dysgalactiae/equisimilis 7
Table 臨床分離株 株の同定結果 VITEK MS による同定菌種名 Staphylococcus aureus Staphylococcus capitis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus simulans Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus raffinosus Enterococcus avium Enterococcus gallinarum Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis/oralis Streptococcus equisimilis/dysgalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus constellatus Streptococcus salivarius Streptococcus sanguis Aerococcus urinae Grobicatella sanguinis Esherichia coli Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Proteus vulgalis/penneri Morganella morganii Serratia marcescens Serratia liquefaciens Salmonella group Enterobacter cloacae complex Enterobacter aerogenes Citobacter freundii Citobacter amalonaticus Citobacter braakii Citobacter fermeri Citobacter koseri Citobacter youngae Kluyvera cryocrescens Raoultella planticola Acinetobacter baumannii complex Campylobacter jejuni Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Plesiomonas shigeroides Elizabethkingela meningoseptica Stenotrophomonas maltophilia Achromobacter xylosoxidans/denitrificans Aeromonas hydrophila/caviae Moraxella catarrhalis Corynebacterium jeikeium Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium amycolatum/xerosis Corynebacterium striatum Bacillus thuringiensis/cereus/mycoides Rothia mucilaginosa Pasteurella multocida No identification Total 菌株数 7 0 0 0 VITEK と結果が一致した菌種 種レベル 属レベル VITEK と属レベルでも 一致しなかった菌種 7 0 0 7
.% 種レベルで 7 株.% の菌名が同定 された 一方 VITEK により属レベルで 0 株 III 考 察.% 種レベルで 7 株.0% が同定され た 統計学的に属レベルでは VITEK が VITEK MS 今回我々は VITEK MS と VITEK を用いた臨床分 より有意に高い同定率を示し P = 0.0 種レベル 離株の同定結果を比較することで両法による菌名同 では VITEK MS が VITEK より有意に高い同定率を 定の違いを明らかにした MALDI-TOF MS 法と生化 示した P = 0.00 学的性状に基づく細菌名同定結果を比較した報告は 同定結果の比較 多数あるが ), ), 7) 最新の MALDI-TOF MS 装置であ VITEK MS で属レベルまで同定された 株のう る VITEK MS の同定能を従来法と比較した報告は少 ち VITEK の同定結果と属レベルで一致した菌株 ない ) MALDI-TOF MS 法による細菌名同定では は 7 株.% であった Table 属レベルで 蟻酸による蛋白抽出や スポット測定を行うことで も両者が一致しなかった 株 7.% のうち 株 より高精度の菌名同定を行えることが報告されてい は VITEK では Unidentified と表示され同定されな るが 我々は蟻酸処理を行わず スポット測定で実 かった 残りの 0 株.% の菌名を Table に示 施した これは日常検査においては簡便かつ低コス した Staphylococcus epidermidis VITEK MS と トの方法で細菌名同定を行うことが重要と考えたか Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris VITEK らである の組み合わせが 株 その他の不一致例は 株ずつ 今回の検討では 属レベルでは VITEK が VITEK であった VITEK MS で種レベルまで同定された 7 MS より 種レベルでは VITEK MS が VITEK より 株のうち VITEK による同定結果と種レベルまで それぞれ同定率が高かった 種レベルの細菌名同定 一致した菌株は 株.% であった で MALDI-TOF MS 法が従来法に劣らないことは複 VITEK MS により菌種名が同定されなかった No 数の研究者により報告されており 我々の検討でも identification と表示された 0 株のうち 7 株 % 裏付けられた ), ) 我々の研究では属レベルでの同定 は VITEK では菌種名が同定された その内訳は 率は VITEK に比べて VITEK MS 法が劣ったが こ S. aureus S. hominis S. caprae Streptococcus れは VITEK MS と VITEK の菌名判定法の違いが一 agalactiae Corynebacterium coli 因と考えられる VITEK は種レベルまでの同定が Enterobacter cloacae complex Klebsiella oxytoca 困難な場合でも 属特異的な生化学的性状が得られ Citrobacter freundii C. koseri Kluyvera intermedia れば属レベルで候補菌名を表示するが VITEK MS K. ascorbata Campylobacter jejuni Pseudomonas はデータベースのデータ単位が菌種レベルなので aeruginosa P. putida E. cloacae complex のみ 株 属レベルでの候補菌名は表示せず No identification と その他はそれぞれ 株ずつ で 7%が腸内細菌科 表示することが一因であろう jeikeium E. グラム陰性桿菌であった この 0 株中 株 % は VITEK でも菌種名が同定されなかった Table VITEK MS と VITEK の同定菌名が一致しなかっ た菌種名 VITEK MS VITEK Staphylococcus epidermidis Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris Streptococcus pyogenes Micrococcus luteus/lylae 今回の我々の検討で同定菌名が一致しなかった 株中 VITEK では菌種が同定されなかった 株を 除いた 0 株 Table のうち 臨床的に重要な不 一致として S. pyogenes VITEK MS と Micrococcus luteus/lylae VITEK 及び C. jejuni VITEK MS と Neisseria cinerea VITEK の 株が挙げられる M. luteus/lylae と N. cinerea はヒトの常在菌の一種で Morganella morganii Proteus mirabilis あるが S. pyogenes と C. jejuni は通常 起因菌とみ Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca なされるのでこの不一致は臨床に与える影響が大き Enterobacter cloacae complex Raoultella planticola Klebsiella oxytoca 認め ランスフィールド抗原分類 セロアイデンス Campylobacter jejuni Neisseria cinerea Rothia mucilaginosa Granulicatella adiacens トレプトキット 栄研 では A 群に属したため M. 0 7 い 前者のコロニーは羊血液寒天培地上に溶血環を
luteus/lylae を否定した また後者のコロニーはカン 釣菌量が過剰だと良好なスペクトルを得られないこ ピロバクター血液無添加選択寒天培地に発育し グ とはこれまで報告されてきたが ), ) 我々の経験 ラム染色ではグラム陰性螺旋状桿菌が観察されたこ でも同様であった したがって 日常検査におい とから N. cinerea を否定した 従って両菌株ともに て MALDI-TOF MS 法 に よ る 同 定 結 果 が No VITEK MS での同定菌名が正しいことが確認された identification となった場合 釣菌量を減らして再検 残りの 株は どちらの同定菌名であってもそれが 査を行うことが推奨される ) こうした釣菌量の微 治療計画に影響を及ぼすことは少ないと推定される 調整は同定作業の経験の蓄積により習得されるであ このように同定結果を報告する際にはグラム染色や ろう コロニーの所見 発育培地を加味するべきである ) Risch らは 臨床菌株 株において従来法 VITEK 本研究では VITEK MS と VITEK で菌名が一致 しなかった菌株について S rrna 解析等を用いて もしくは API システム Sysmex biomérieux で S. 菌名同定は行っていない 臨床菌株には VITEK MS mitis/oralis と同定された菌が MALDI-TOF MS 法 VITEK それぞれのデータベースに収載されていな では S. pneumoniae と同定されたと報告した ) 事実 い菌種も存在することが推測される 一方のデータ S. pneumoniae と S. mitis/oralis は遺伝子学的に極めて ベースに収載されているが他方のデータベースに収 類似している ) 今回の我々の検討では VITEK MS 載されていない菌種では 菌名が一致しなかった可 で S. pneumoniae と同定された 株中 株は菌名が 能性がある 一 致 し 株 は VITEK で S. mitis/oralis 株 は MALDI-TOF MS 法による細菌名同定はこれまで VITEK で同定されなかった Dubois らは VITEK MS 微生物検査室が行ってきた同定法に比較していくつ を用いて S. pneumoniae 株 と S. mitis/oralis かの利点がある 同定に要する時間が極めて短縮さ 株 を 00%識別できたことから VITEK MS は S. れ 我々の検討では VITEK による細菌名同定は最 pneumoniae と他の α 溶血性連鎖球菌を区別すると報 短でも 時間 時間 を要したが VITEK MS 告した ) また Saffert らは S rrna 解析で K. では 検体あたり数分であった また 同定にかか oxytoca と同定された 株中 MALDI-TOF MS 法で るコストも従来の同定法より少ない 7), 0) Neville ら K. oxytoca と同定されたのは 株のみであり 残り の試算によると 検体あたり VITEK による平均 の 株は Klebsiella 属の他菌種と同定されたと報告 同定コストは Australian dollars AUD $0.00 であっ した 我々の検討では VITEK で K. oxytoca と同 たのに対し MALDI-TOF MS のそれは AUD$0. で 定された 株中 VITEK MS でも K. oxytoca と同定 あった 7) されたのは 株であった 残りの 株は Raoultella 我々の検討で VITEK MS は VITEK と同等以上の planticola R. ornithinolytica 及び No identification で 菌種同定能を有することが明らかになったが 同定 あった 以上の結果より これまでの MALDI-TOF 結果を確認する際にはグラム染色 発育培地及びコ MS 法を用いた研究で指摘された問題点の一部は ロニーの所見を加味することで 迅速性と精度を両 VITEK MS で改善される傾向にあることが示唆さ 立した臨床現場での運用が実現できるであろう れた 我々の検討では VITEK MS で菌名が同定されず IV 結 語 VITEK で菌種名が同定された菌株の 7%が腸内細 菌科グラム陰性桿菌であった これは MALDI-TOF VITEK MS は VITEK に比べて菌種レベルの同定 MS 法に特有の検査手技に起因すると考えられる 率は優れていたが その同定精度は検査担当者のサ MALDI-TOF MS 法は従来の細菌名同定法に比較し ンプル処理技術に影響を受ける サンプル処理手技 て同定作業に必要な手順が少なく複雑な知識を必要 の向上及びデータベースの整備により VITEK MS としないので簡便かつ迅速に同定結果が得られるが の同定能は上がると考えられる 慎重なサンプル処理が必要である ), ) MALDI-TOF MS 法で腸内細菌科グラム陰性桿菌を同定する際は 77
文献 ) Saffert RT et al. : Comparison of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli, J Clin Microbiol 0 ; : 7. ) Risch M et al. : Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria, Swiss Med Wkly 00 ; 0 : w0. ) Karas M, Hillenkamp F : Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 0,000 daltons, Anal Chem ; 0 : 0. ) Seng P et al. : Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, Clin Infect Dis 00 ; :. ) Sauer S, Kliem M : Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria, Nat Rev Microbiol 00 ; : 7. ) Cherkaoui A et al. : Comparison of two matrix-assisted laser 7) ) ) 0) desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level, J Clin Microbiol 00 ; : 7. Neville SA et al. : Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification, J Clin Microbiol 0 ; : 0. Dubois D et al. : Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology, J Clin Microbiol 0 ; 0 : 7. Bizzini A et al. : Performance of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory, J Clin Microbiol 00 ; :. Dhiman N et al. : Performance and cost analysis of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine identification of yeast, J Clin Microbiol 0 ; :. Technical Article Comparative study of bacterial identification using VITEK MS and VITEK in routine clinical microbiological analysis Takuya HATTORI ) Hideki NISHIYAMA ) Shinobu IKEGAMI ) Mayuko SUZUKI ) Itsuka MURAKAMI ) Makoto MINOSHIMA ) Hiroe YAMAGISHI ) Norihiro YUASA ) ) Department of Clinical Laboratory, Japanese Red Cross Nagoya Daiichi Hospital (-, Michishita-cho, Nakamura-ku, Nagoya -, Japan) Summary There have been many reports of bacterial identification using a matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) system. However, studies of the bacterial identification using the most recent MALDI-TOF MS system (VITEK MS) compared with that using a conventional biochemical identification system are scarce. We compared VITEK MS with VITEK (a conventional biochemical identification system) in the identification of clinical isolates. The identification rate at the genus level for VITEK MS (.%) was significantly lower than that for VITEK (.%); however, the identification rate at the species level for VITEK MS (.%) was significantly higher than that for VITEK (.0%). VITEK MS might fail to identify enterobacteria owing to inadequate sampling techniques in some cases or insufficient databases of these bacteria. It is necessary for bacterial identification using VITEK MS to take findings of Gram staining and bacterial colonies into consideration. The identification rate for VITEK MS will be increased by improving sampling techniques and upgrading databases. Key words: Mass spectrometry, MALDI-TOF MS, VITEK MS, VITEK (Received: January, 0; Accepted: May, 0) 7