FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF Vol. 32, pp. 47 51, 2004 FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF 2D-DIGE 21 DNA 2 Sypro Ruby 15 two-dimensional differential image gel electrophoresis; 2D-DIGE 2 3 1 2D-DIGE Typhoon LC/MS/MS Cy2 Cy3 Cy5 3 2 Cy2 Cy3 47
西川裕之 48 太田智彦 ら. 2 実験の流れ 左列はディファレンシャル二次元電気泳動により変動のあるタ ンパク質スポットを探索する実験系 右列はタンパク質スポット を質量分析計で同定する実験系 Step6 の二次元電気泳動は Step1 で調製したサンプルのタンパク濃度を 500 ug に上げて二次元電 気泳動で分離します Step7 の SYPRO Ruby 染色は分離した全タ ンパク質を可視化し質量分析の影響を与えない染色法です. 1 2D-DIGE の原理 (A) サンプルはそれぞれ 励起光の違う蛍光試薬で標識され 1 枚 の二次元電気泳動ゲルに展開されます その後 蛍光スキャ ナーにて読み取られ各励起光ごとに PC 上でゲルイメージフ ァイルが作成されます 1 枚のゲルに全てのサンプルを同時 に泳動するため これまでの二次元電気泳動での課題であっ されたゲルをイメージアナライザー Typhoon の蛍光 たゲル間の再現性 均一性が保たれます スキャナーモードで読みとるわけですが各蛍光試薬は (B) ゲルイメージ画像の例 T47D 細胞 乳癌細胞 をタキソテー 励起光が異なるので 1 枚のゲルに泳動出来るわけです ル処理する前後でのタンパク質の変化 左上 Cy2 標識した タンパク質 タキソテール処理前 右上 Cy3 標識したタン. 1 往来の二次元電気泳動法だとこれには 3 枚の パク質 タキソテール処理後 左下 タキソテール処理前後 ゲルが必要となり ゲルのゆがみ等で正確なタンパク のタンパク質を等量ずつ混合し Cy5 で標識 右下 3 を統 質スポットの比較が出来ませんでした しかし 2D 合 Overlay した画像 1 枚のゲルからこれらのゲルイメー DIGE システムだと全ての行程を同一条件で行うため ジが得られます 矢印はタキソテール処理後に減少したタン サンプル間の誤差がほとんど無くなります パク質 として癌組織 正常組織 両方のタンパク質を等量ず プロテオーム解析の全体の流れとしては 2D-DIGE つ混ぜ合わせ Cy5 で標識します この標識された 3 で変動のあるタンパク質スポットを検知し 質量分析 つのサンプルを 1 つにまとめてこれを二次元展開しま 計でそれが何であるかを同定する というものになり す 1 次元目は等電点電気泳動 2 次元目は SDS- ます PAGE polyacrylamide gel electrophoresis です 展開 ンパク質スポットの検知には サンプルの調製 蛍光 48. 2 このうち 2D-DIGE による変動のあるタ
2D-DIGE. 2 A ph8 9 ph 1. 2. PBS phosphate buffered saline 3. 1 ml 30mM Tris --ph 2M Thiourea 7M Urea 4 % CHAPS 10 4. 4 12000 g 10 5. ph ph 8 9 6. B Cy2 Cy3 Cy5 50 ug 400 pmol 1. 50 ug 2. 1 ul 400 pmol 3. 30 4. 10 mm 1 ul C /SDS-PAGE IPG ph SDS-PAGE 1. 2. 2x Sample Buffer 2M Thiourea 7M Urea 2 % Pharmalytes3-10 2 % DTT 4 % CHAPS 3. 450 ul 4. IPG 5. Drystrip Cover Fluid IPG 6. rehydration 12 500Volts-500Vhrs 1000Volts-1000Vhrs 8000Volts- 60000Vhrs 7. IPG SDS A 50mM Tris-HCl ph8.0 6M Urea 30 % Glycerol 2 % SDS 1 % DTT 15 8. SDS B 50mM Tris-HCl ph 8.0 6M Urea 30 % Glycerol 2 % SDS 2.5 % 15 9. IPG 0.5 % 600V-400mA-2.5W-30600V-400mA-100W-5 D 30 Cy2 1000 um 100 um 1. 30 Typhoon PC 2. 3. 49
西川裕之 50 太田智彦 ら. 4 DyCyder 4 つのモジュール DIA ゲル内変動解析 タンパク質スポットの検出と同一ゲル由 来のゲルイメージの数値化を行います BVA 生物学的変動解析 異なるゲル由来の複数ゲルイメージを マッチングし全体で見られるタンパク質スポットの変動デ ータを統計解析します BatchProcessor ゲルイメージの自動検出や複数のゲルのマッチ ングを行います XML Toolbox DyCyder で作成したファイルからデータを抽出し ます. 3 Typhoon の設定 (A) 蛍光スキャナー各種パラメーターの設定 1 スキャンエリア 2 蛍光スキャンモード選択 3 蛍光スキャンパラメーターのセ ットアップ 5 スキャン方向の設定 4 トレイ設定 6 サンプ ルプレスの選択 7 フォーカルプレーン 焦点 の設定 8取. 5 DyCyder DIA 画面 Image View ゲルイメージを表示 Histogram View タンパク質スポットをグラフ化して 表示 3D View タンパク質スポットを 3D 表示 Table View 各タンパク質スポットを数値化し一覧表 示 り込みピクセルサイズの設定 9 DIGE ファイルの命名形式の 選択 10 取り込み開始ボタン (B) 励起フィルターとレーザーの設定 Emission Filter リストから 適切な励起フィルターを選択します 最大 4 種類のフィルタ ーが選べます 励起フィルターを選択すると自動的に使用レ ーザーが表示されます また 励起フィルターとレーザーの 組み合わせを自分で選ぶことも出来ます のモジュールから構成され. 3-A 4. 読み込みソフトの Setup ボタンをクリックし励起 フィルターとレーザーの設定をします. 4 蛍光スキャナー で取り込んだゲルイメージからタンパク質スポットの 検出 数値化 スポットのマッチング及びタンパク質. 3-B 5. スキャンを開始します 発現解析を行います 今回は 4 モジュールの最初に行 う DIA モジュールの使い方の説明をします 残りの E 3 つのモジュールは主に複数枚のゲル イメージでは 本実験で最も重要なのが取り込んだゲルイメージの 無く実際のゲル を比較する場合に使用します 解析です Typhoon 蛍光スキャナー 附属の DeCyder というソフトを使用します DeCyder は 4 つ 1. PC から [DyCyder DIA] を立ち上げ [Fail/Create 50
2D-DIGE 7.. 6 Table View 3D View Table View 8. Table View. 6 Workspace] 2. [Type of Detection] 3. 4. [Process/Process Gel images] 5. [Process Gel images] Estimated no. of spots 2500 3000 OK 6. 4. 5 2D-DIGE 2D-DIGE LC/MS/MS 51