原 著 中枢神経系感染症における Multiplex PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価 櫻井 慶造 1) 棟方 伸一 1) 二本柳 伸 2) 和山 行正 3) 中崎 信彦 1) 狩野 有作 1) 4) 久松 知子 1) 1) 北里大学病院臨床検査部 252-0

原 著 中枢神経系感染症における Multiplex PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価 櫻井 慶造 ) 棟方 伸一 ) 二本柳 伸 ) 和山 行正 3) 中崎 信彦 ) 狩野 有作 ) 4) 久松 知子 ) ) 北里大学病院臨床検査部 5-0375 神奈川県相模原市南区北里 -5- ) 北里大学病院感染管理室 3) 北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 4) 北里大学医学部臨床検査診断学 要 旨 中枢神経系感染症は大きく髄膜炎と脳炎に大別され 初期治療が患者の転帰に大きく影響するため 迅速かつ正確な診 断が重要である 我々は同時スクリーニング検査の Multiplex PCR 法 M-PCR 法 と PCR ラテラルフロー PCR-LF 法 法 を 用 い て 髄 液 か ら 8 種 類 の 細 菌 の S. pneumoniae H. influenzae N. meningitides L. Monocytogenes Group B Streptococcus S. aureus SA Coagulase-negative staphylococci species CoagNS methicillin-resistant Staphylococcus aureus と 7 種類のウイルスの VZV HSV- HSV- EBV CMV HHV-6 Enterovirus について臨床的評価を検討した その結 果 M-PCR 法と PCR-LF 法を用いた 3 例の髄液から原因細菌が 4 例.4% ウイルスが 3 例 8.7% 検出され た しかし 細菌培養が陰性の SA と CoagNS が 5 例認められ 偽陽性が起こる可能性があるために検査結果の解釈には 注意を要する M-PCR 法と PCR-LF 法は 専用の PCR 装置を必要とせず 従来法と比べて検出率が高く 短時間で報告 が可能なため 中枢神経系感染症の迅速診断に有用と考えられた キーワード 中枢神経系感染症 CNS infection 髄液 CSF Multiplex PCR 法 PCR ラテラルフロー法 迅速遺伝子検査 抗体検査の低力価の陽性判定は非特異反応や高 はじめに 抗体価の影響により 困難なことがあるため診断に 苦慮する場合が少なくない これらを解決するため 中枢神経系感染症は大きく髄膜炎と脳炎に大別さ に感染症遺伝子検査が開発され 臨床検査の場で活 れ 初期治療が患者の転帰に大きく影響するため 用されている ) Seeplex meningitis kit は Multiplex 迅速かつ正確な診断が重要である 髄膜炎は細菌性 PCR 法で細菌 5 菌種 ウイルス 7 種類を同時検出す 髄膜炎と無菌性髄膜炎に大別され 前者には細菌 ることが可能な市販キットである また 我々が開 後者にはウイルス 結核 真菌 寄生虫および非感 発した PCR ラテラルフロー法は 検査材料 検体 染性髄膜炎などが含まれる なお 脳炎はおもに無 から直接 MRSA methicillin-resistant Staphylococcus 菌性でありその多くはウイルスによる 髄膜炎にお aureus を検出することができる ) ける迅速診断は重要であり 日常検査として細胞算 今回我々は 中枢神経系感染症における Multiplex 定検査 分離培養検査および各種ウイルス抗体検査 PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝 が行われている しかし 分離培養検査は検査時間 子検査の臨床的評価を行ったので 報告する が長いことに加え 検出感度が低く ウイルス 平成 7 年 0 月 6 日受付 平成 8 年 月 7 日受理 医学検査 Vol.65 No. 06 59

HI Neisseria meningitides NM C 群 / Escherichia I 対象および方法 coli K Neisseria meningitides A 群 C 群 Y/W35 群が検出可能である なお 操作法 判定法は添付 書の指示に従った 対象 平成 5 年 4 月 日から平成 7 年 3 月 3 日に至 るまでの期間に 北里大学病院の神経内科を受診し ②各種ウイルス抗体検査 各種ウイルス抗体検査のうち Varicella-zoster virus た中枢神経系感染症の疑い患者から採取した髄液 VZV Herpes simplex virus HSV - HSV- 3 検体と血液 64 検体を対象とした なお 本研究 Cytomegalovirus CMV Human herpes virus-6 は北里大学医学部 病院倫理委員会の承認を得て患 HHV6 の および 抗体検査は ウイルス抗 者情報保護法の適応に準じた 体 EIA 生研 ウイルス デンカ生研 試 方法 薬による検査を北里大塚バイオメディカルアッセイ 分離培養検査 研究所 KOBAL に委託し その判定法は添付書の 滅菌スピッツで提出された髄液 3 検体は 3,000 指示に従った 髄液の判定は抗体価 0.5 以上を陽性 rpm 0 分間遠心集菌後 上澄みを捨てて全量 ml とした また Epstein-Barr virus EBV の およ の沈渣とした 得られた沈渣から染色標本を作製し び 抗体検査は 間接蛍光抗体法の VCA バーミー法 武藤化学 を用いてグラム染色による テスト MBL による検査を KOBAL に委託 顕微鏡検査を行った さらに 残りの沈渣を HK 半 し その判定法は添付書の指示に従った 髄液の判 流動培地に摂取し 35 5 日間増菌培養を行った 定は抗体価 以上を陽性とした HK 半流動培地に菌の発育を認めた場合は 5%ヒツジ 3 遺伝子検査 血液加寒天培地 チョコレート寒天培地および BTB DNA は髄液 00 μl から QIAamp MiniKit QIAGEN 乳糖加寒天培地 BBL を用いてサブカルチャーを を用いて抽出した RNA は髄液 00 μl から QuickGene 行った RNA tissue Kit S KURABO を用いて抽出した な また 血液培養検査で提出された血液培養ボトル 好気用 嫌気用各 本 の血液 64 検体は Bact ALERT 3D Sysmex を使用して 35 5 日間培養し お 各操作法は添付書の指示に従った ①Multiplex PCR 法 M-PCR 法 Seeplex Meningitis ACE Detection V.0 Seegene た そのうち 培養陽性となった血液培養ボトルか は Dual Priming Oligonucleotides 技術を活用した ら 3 ml 程度培養液を採取し グラム染色による顕 高感度で特異性が高い M-PCR 法である 4) DNA を 微鏡検査を行った さらに 5%ヒツジ血液加寒天培 材料とする細菌 5 菌種は SP HI NM GBS および 地 チョコレート寒天培地 BTB 乳糖加寒天培地お LM ウ イ ル ス 6 種 類 は VZV HSV- HSV- よび BHK 寒天培地 極東 を用いてサブカルチャー HHV-6 EBV CMV を添付書の指示に従い測定 を行った 培地上に発育した集落は CLSI Clinical し た Enterovirus EV は 抽 出 し た RNA を and Laboratory Standards Institute に 準 拠 PrimeScriptTM Revers transcriptase TAKARA を使用 3) した MicroScan WalkAway-96SI SIEMENS を使用し し添付説明書に従い cdna を作製した cdna を 各菌種用専用パネルを用いて菌種同定 薬剤感受性 M-PCR 法で増幅後 %アガロースゲル電気泳動 を行い 操作法 判定法は添付書の指示に従った エチジウムブロマイドにて染色を行い 各特異バン 抗原 抗体検査 ドを目視判定した ①脳脊髄膜炎起炎菌膜多糖抗原キット ②PCR ラテラルフロー法 PCR-LF 法 による MRSA 迅速検査法における髄膜炎起炎菌の検出は の検出 PASTOREX メニンジャイティス メニンゴ検査 PCR-LF 法は Staphyloccus aureus SA が保有す BIO RAD を用いた 本法は Streptcoccus pneumoniae る fema 遺伝子と MRSA の meca を同時に増幅し SP Listeria monocytogenes LM Group B probe スティックに金コロイド液で染色を行い そ Streptcoccus GBS Haemophilus influenzae b 型 の各バンドを陽性対照と比較して目視判定した ) 60 櫻井 他 中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

8.% であったが 顕微鏡検査とメニンゴ検査は II 結 果 すべて陰性であった 遺伝子検査 M-PCR 法と PCR-LF 法 の検出率 遺伝子検査を用いた微生物の検出率は 細菌が 患者背景および細胞数算定検査 髄液 3 検体に由来した患者の背景および細胞数.4% 4/3 ウイルスが 8.7% 3/3 であっ 算定検査を Table に示す 髄液 3 検体の内訳は た Figure 一 方 分 離 培 養 法 は 全 体 で 男性 63 検体 女性 60 検体であり 検査依頼時の 8.% 9/3 であったが 遺伝子検査法の対象菌で 年 齢は中央値 53. 歳 5 88 歳 細胞数の中央 は 4.% 5/3 と遺伝子検査法の検出率が.8 倍高 値が 88.3 cell/μl <,300 cell/μl 単核球の中央 かった 遺伝子検査法で検出された細菌は SA が 値 が 87.% 0 00% 多 核 球 の 中 央 値 が 5 検 体 35.7 % Coagrase-negative Staphylococci.5% 0 00% であった 蛋白の中央値が 83.7 mg/dl 4 640 mg/dl 糖の中央値が 65.7 mg/dl MRSA 7 9 64 mg/dl であった なお 分離培養検査 の陽性は 遺伝子検査の対象 5 検体の他に対象外の n 4 SP 7 4 菌 Propionibacterium acnes: n =, Enterococcus faesium: n =, Bacillus subtilis: n = を含む 9 例 SA 36 36 GBS 4 Table Patient characterstics (n = 3) Cases [mean (min max)] All Male Female Age CSF cells (cell/μl) Mononuclear cell (%) Polynuclear cell (%) CSF protein (mg/dl) CSF glucose (mg/dl) 3 63 60 53. (5 88) 88.3 (<,300) 87. (0 00).5 (0 00) 83.7 (4 670) 65.7 (9 64) CSF: Cerebrospinal fluid Bact n 4 Virus 9 n 3 n 3 70 n 86 LM 4 CoagNS Figure Detection of causative bacterial in clinical CSF samples Detection of causative bacterial in clinical cerebrospinal fluid (CSF). SA: Staphylococcus aureus (n = 5), MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus (n = ). CoagNS: Coagrase-negative Staphylococci (n = 3). LM: Listeria monocytogenes (n = ). GBS: Group B Streptococcus (n = ). SP: Streptococcus pneumonia (n = ). HHV6 3 EV 9 VZV 30 HSV 3 HSV 3 Figure Detection of causative microorganism by multiplex PCR method and PCR lateral flow method in clinical CSF samples Bact: Bacterial central nervous system infection. Virus: Viral central nervous system infection. : Negtive. 医学検査 Vol.65 No. 06 n 3 EBV Figure 3 Detection of causative virus in clinical CSF samples Detection of causative virus in clinical cerebrospinal fluid (CSF). VZV: Varicella-zoster virus (n = 7). EBV: Epstein-Barr virus (n = 5). HSV: Human simplex virus (n = 3). HSV: Human simplex virus (n = 3). HHV6: Human herpes virus 6 (n = 3). EV: Entero-virus (n = ). 6

Table Comparison between the detection of Bacteriological test and M-PCR, PCR-LF methods (n = 3) Bacteriological Test LM GBS SA MRSA CoagNS other 09 (4*) LM GBS M-PCR/ PCR-LF SP SP SA 3 ** MRSA CoagNS ** ** SP: Streptcoccus pneumonia, LM: Listeria monocytogenes, GBS: Group B Streptococcus, SA: Straphylococcus aureus, CoagNS: Coagrase-negative Staphylococci, MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus. *The frequency of non-target bacteria using M-PCR method and PCR-LF method: Propionibacterium acnes (n = ), Enterococcus faesium (n = ), Bacillus subtilis (n = ). **Detect in cerebrospinal fluid with M-PCR method positive or PCR-LF method positive, Bacteral culture test negative and Blood clture test positive: SA (/5), MRSA (/), CoagN (/3). Table 3 Comparison between the detection of Virus Antibody (EIA FA) test and Multiplex PCR method (n = 3) Anitbody (EIA FA) test with CSF M-PCR VZV EBV HSV HSV HHV6 00 VZV 4* EBV * HSV * HSV 3 HHV6 3** EV *** VZV: Varicella-zoster virus, EBV: Epstein-Barr virus, HSV: Herpes simplex virus, HSV: Herpes-simplex virus, HHV6: Human herpes virus 6, EV: Enterovirus. *VZV, EBV and HSV; M-PCR : anti-,. **HHV6; M-PCR : anti-, not tested. ***EV; M-PCR : antiev antibody not tested. CoagNS が 3 検体.4 % LM GBS が各 検 液 64 検体を加えると LM が 株中 株 GBS が 体 4.% MRSA が 検体 7.% SP が 検体 株中 株 SP が 株中 株 SA が 5 株中 株 7.% であった Figure また 抗体検査法は MRSA が 株中 株 CoagNS が 3 株中 株で陽性 8.% 0/3 M-PCR 法は 8.7% 3/3 からウ であった Table 髄液のウイルス抗体は VZV が イルスを検出し 検出率は M-PCR 法が.3 倍高かっ 7 例中 3 例 EBV が 5 例中 3 例 HSV- が 3 例中 た M-PCR 法で検出されたウイルスは VZV が 7 例 HSV- が 3 例中 3 例で陽性であった これら髄 検体 30.4% EBV が 5 検体.7% HSV- 液の抗体検査が陰性の 7 例 あるいは医師からの検 HSV- および HHV-6 が各 3 検体 各 3.0% EV が 査オーダがない HHV-6 の 3 例 EV の 例から M- 検体 8.7% であった Figure 3 PCR 法でウイルスが検出された Table 3 3 遺伝子検査と分離培養検査および抗原 抗体検査 との比較 III 考 察 遺伝子検査法で対象遺伝子が検出された検体のう ち LM が 株中 株 GBS が 株中 株 SP が 中枢神経系感染症は迅速な感染診断と治療が患者 株 株で分離培養検査が陽性であった さらに 血 の転帰に大きく影響する疾患であり 特に急性化膿 6 櫻井 他 中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

性髄膜炎や HSV 脳炎は迅速的な病態の鑑別, 病原体の同定を行い適切な治療が重要である 中枢神経系感染症が疑われる患者の日常検査では, 髄液検査と血液培養検査が行われる 髄液は可能な限り抗菌薬投与前に採取することが重要で, 髄液からの起炎菌の検出が髄膜炎の確定診断となる 髄液の白血球が増加しているにもかかわらず, 原因菌が検出されない場合は, 無菌性髄膜炎, 特にウイルス性髄膜炎が疑われる 感染診断の Gold standard は髄液検査で特に, 細胞数増多, 細菌顕微鏡検査, ウイルス抗体検査での 抗体の有無が重要である 一方, 臨床現場において, 髄液の細菌顕微鏡検査の感度は低く, 細菌培養, 薬剤感受性試験に加えてウイルスの特異 抗体, ペア血清の抗体価変動による感染ウイルスの特定は迅速性に問題がある また,HSV 脳炎や細菌性髄膜炎の診療ガイドラインが諸学会から報告されているが 5 )~ 7 ), 診療の現場においては感染診断に苦慮する場合が少なくない 8 ) また,HSVE(herpes simplex virus encephalitis) の診断では, 高感度 PCR 法でも急性期に陰性を呈する場合もあり, 臨床的に HSVE を疑う場合にはアシクロビル治療は継続し, 5 本邦 ) 6 ), 7 および欧州 ) では繰り返し検査することがガイドラインでも推奨されている 近年, 遺伝子診断技術の向上により, ウイルス感染症は迅速に診断されるようになってきた ) 我々は, 病因微生物の細菌とウイルスについて臨床材料から分離培養することなく直接, 微生物に特異的な遺伝子を検出する M-PCR 法と PCR-LF 法を用いて, 従来法との比較検討を行った 中枢神経系感染症が疑われた髄液 3 検体から細菌が 4 例 (.4%), ウイルスが 3 例 (8.7%) 検出された 国立感染症研究所感染症情報センターの感染症発生動向調査 (ISDW) では,006 年から 0 年の細菌性髄膜炎の起炎菌は, HI, SP に次いで,Streptcoccus agalactiae,sa,lm,coagns が上位を占めている 一方, 今回は HI や SP はほとんど認めず,LM,GBS や SA が検出された この原因として ISDW サーベーランスは, 対象患者の 80% が 0~9 歳であるが, 今回の調査では, 平均が 53 歳 (5~83 歳 ) であり, 対象年齢の差異が影響していると考えられた また, 無菌性髄膜炎に関しては, 対象患者の約 70% が 0~ 歳の ISDW サーベーランスでは, 原因ウイルスと して EV と Mumpus virus(mv) が報告されている さらに,Hosoya ら 9 ) は福島県内の小児無菌性髄膜炎 45 例の髄液を解析した結果,PCR 法では EV が 5 例,MV が 4 例,VZV が 例,CMV が 例検出され,EV と MV が多くを占めていたことを報告している 我々の調査では EV や MV がほとんど認めず, ヘルペス属の VZV,EBV,HSV,HSV,HHV6 が検出され, 対象年齢の違いが影響していると考えられた また,Gregoire ら 0 ) は VZV の中枢神経系感染症との関係について,PCR 法を用いることにより陽性が 44% であったが, 主に発疹後の最初の 7 日間以内に採取された検体では 6.5% で陽性であったと報告された これらより, 中枢神経感染症を感染診断する際には, 急速な高齢化社会における中高年層の宿主側の変化に繋がっていると考えられた 今回の検討では, 中枢神経系感染症が疑われる症例で顕微鏡検査およびメニンゴ検査が陰性で, 細胞数が正常な髄液から遺伝子検査法により 5 例のウイルスが検出された Hase ら ) は, 髄液細胞数増多がないというだけで髄膜炎を否定できるわけではなく, 敗血症や髄膜炎の兆候がある時は抗菌薬の開始が重要であると報告している ) 今回用いた遺伝子検査法は, 約 4 時間で報告が可能であり, 医師が感染性髄膜炎や脳炎を想起するが感染診断の判定が待てない時期の早期診断に役立つ可能性が示唆された 培養法が陰性を示し,PCR-LF 法で SA,MRSA,CoagNS が検出された髄液では, 中枢神経感染症との関係が低いこと,PCR 法では死菌の遺伝子も検出してしまうことから, 採取時の検体コンタミネーションなどにより偽陽性結果が示唆された Richter ら 3 ) は, Corynebacteria, Propionibacterium sp., CoagNS, Streptcoccus viridians,bacillus sp. などの皮膚汚染菌が条件により重篤な感染症を引き起こし得ることもあるが, 血液培養 セットのみで検出された場合は, 患者の皮膚, 検体採取時に使用した器具類, 採取者の手指, 環境から検出された臨床的に有意でないコンタミネーションと判断することが報告されている このように高感度な遺伝子検査を用いて細菌性髄膜炎を判定する際は, 髄液採取時の皮膚汚染菌などのコンタミネーションによる偽陽性結果に注意して判定することが必要である 医学検査 Vol.65 No. 06 63

IV 結 語 M-PCR 法と PCR-LF 法は 専用の PCR 装置を必 要とせず 分離培養検査やウイルス抗体検査と比べ て検出率が高く 短時間で報告が可能なため 中枢 神経系感染症の迅速診断に有用と考えられた しか し 偽陽性が起こる可能性があるために検査結果の 解釈には注意を要する 文献 ) 大楠 清文 他 感染症診断における遺伝子解析技術の適 応 日本臨床微生物学会 008; 8: 63 76. ) Nihonyanagi S et al.: Clinical usefulness of multiplex-pcr lateral flow in MRSA detection: A novel, rapid genetic testing method, Inflammation, 0; 35: 97 934. 3) Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance Standards for Antimicrobial-Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement (M00-S0), CLSI, Wayne PA, 00. 4) Shin SY et al.: Evaluation of the Seeplex Meningitis ACE Detection kit for the detection of common bacterial and viral pathogens of acutebmeningitis, Ann Lab Med, 0; 3: 44 49. 5) 日 本 神 経 感 染 症 会 ヘ ル ペ ス 脳 炎 の ガ イ ド ラ イ ン Neuroinfection, 005; 0: 78 87. 64 6) Cinque P et al.: The role of laboratory investigation in the diagnosis and manarement of patients with suspected herpes simplex encephalitis: A consensus report, The EU Concerted Action on Virus Meningitis and Encephalitis, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 996; 6: 339 345. 7) Linde A et al.: Specific diagnostic methods for herpesvirus infections of the central nervous system, a consensus review by the European Union concerted Action on Virus Meningitis and Encephalitis, Clin Diabn Virol, 997; 8: 8 04. 8) Diederik van de B et al.: Clinical features and prognostic factors in adults with bacterial meningitis, N Engl J Med, 004; 35: 849 859. 9) Hosoya M et al.: Application of PCR for various neurotropic viruses on the giagnosis of viral meningitis, J Clin Virol, 998; : 7 4. 0) Gregoire SM et al.: Polymerase chain reaction analysis and oligoclonal antibody in the cerebrospinal fluid from 34 patients with varicella-zonster virus infection of the nervous system, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 006; 77: 938 94. ) Hase R et al.: Bacterial meningitis in the absence of cerebrospinal fluid pleocytosis: A case report and review of the literature, Can J infect Dis Med Microbiol, 04; 5: 49 5. ) 中野 有也 他 初回髄液検査で髄液細胞増多を伴わなかっ た細菌性髄膜炎 例の検討 小児感染免疫 00; : 5 55. 3) Richter S et al.: Minimizing the workup of blood culture contaminants: Implementation and evalution of a laboratory-based algorithem, J Clin Microbiology, 00; 40: 437 444. 本論文に関連し 開示すべき COI 状態にある企業等はありません 櫻井 他 中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

Original Article Clinical evaluation of the Multiplex PCR method and PCR lateral flow method in central nervous system infection by rapid genetic detection test Keizou SAKURAI ) Shin NIHONYANAGI ) Nobuhiko NAKAZAKI ) Tomoko HISAMATSU ) Shinichi MUNEKATA ) Ikumasa KAZUYAMA 3) ) 4) Yusaku KANOU ) Department of Clinical Laboratory, Kitasato University Hospital (-5-, Kitasato, Minami-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 5-0375, Japan) ) Department of Infection Control, Kitasato University Hospital 3) Kitasato-Otsuka Biomedical Assay Laboratories Co, Ltd. 4) Department of Laboratory Medicine, Kitasato University School of Medicine Summary Infections of the central nervous system are roughly divided into meningitis and encephalitis. The initial treatment for such diseases considerably affects the patient s outcome; hence, rapid and correct diagnosis is crucial. We simultaneously used multiplex polymerase chain reaction (M-PCR) and PCR-Lateral Flow (PCR-LF) analyses for the screening examination and clinically evaluated eight bacterial species, namely, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Listeria monocytogenes, Group B Streptococci, Staphylococcus aureus (SA), coagulase-negative staphylococci species (CoagNS), and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and seven viruses, namely, varicella-zoster viruses, herpes simplex virus (HSV)-, HSV-, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, human herpes virus-6, and enterovirus collected from patients cerebrospinal fluids. In total, 4 (.4%) and 3 (8.7%) samples of causative bacteria and viruses, respectively, were detected in 3 samples of cerebrospinal fluid. However, there is a possibility of false-positive results as five SA and CoagNS were detected although the samples were culture-negative for these species. Hence, the results need to be carefully interpreted. M- PCR and PCR-LF analyses did not require dedicated PCR devices, had detection rates that were higher than those of other analytical methods, and yielded results within a short span of time. Therefore, M-PCR and PCR-LF analyses may be effective for the quick diagnosis of central nervous system infections. Key words: CNS infection, CSF, Multiplex PCR, PCR lateral flow, rapid genetic detection test (Received: October 6, 05; Accepted: January 7, 06) 医学検査 Vol.65 No. 06 65