322 與田 順 一,他9名 4. 陽 性 群 お よ び 陰 性 群 に 分 け てKaplan-Meier法 で 生 存 曲 線 を 描 き,Log-rank testで 生 存 率 を 血 清p53抗 (112例)を よ び未 治 療 の 頭 頸 部 癌 患 者 対 象 と し た.血 を 分 離 し た 後,検 液 を 採 取 し,血 定 時 ま で に-40 イ ク ロ プ レ ー p53 Ab TI)(%)をHoubiersら Ab TI=(sample absorption)/(high control 陽 性 コ ン トロ ー ル と し てHeLA細 DNA 18型)お 胞(HPV- よ びCaSki(HPV-DNA 16型) を 用 い た. 結 1. titer index(sの 報 告6)に 従 物 で 遺 伝 子 変 異 の ス ク リー ニ ン グが 行 え た の は26例 ク ソ ン5お absorption-low absorption-low control は14例 control のPCRの absorption) 100. 果 p53遺 伝 子 変 異 の 検 出 PCR産 っ て 次 式 で 算 出 し た. s-p53 応 条 件 は 藤 永 ら の 報 告 に 準 じ て 行 っ た8). 白 を固 相 化 用 い たELISA法 p53-antibody 用 い て,PCR 異 的 プ ラ イマ ーの 設 定 と ト(p53-autoantibodies ELISA,Dianova,Hamburg)を で 行 っ た6)7).serum 清 で 保 存 し た. 体 価 の 測 定 は 野 生 型p53蛋 し た マ ノムの検 出 腫 瘍 組 織 か ら抽 出 し たDNAを PCR反 体 の 測 定 健 常 人(18例)お p53抗 HPVゲ を 行 っ た.HPV特 比 較 し た. 3. 口 咽 科11:3 中14例(53 8%)で よ び エ ク ソ ン7に 中1例(7.1%)で 結 果,183bpの 1a) SSCPを あ っ た.エ お け る遺 伝 子 変 異 あ っ た.エ ク ソ ン5 産 物 が 得 ら れ た(図 行 っ た 結 果,症 例21お (a) (b) (c) 図1 p53エ ク ソ ン5領 域 の 変 異の 検 索 p53エ ク ソ ン5領 域 のPCR反 応 結 果.183bpの 増 幅 産 物 が 得 ら れ た(図1a).得 ら れ たPCR 断 片 に つ い てSSCPを 行 っ た(図1b).症 例21と24で 変 異 が 疑 わ れ た が,塩 基 配 列 を 調 べ た 結 果, 症 例24で コ ド ン151CCC(Pro)か らYCC(Ser/Pro)の 変 異 が 確 認 され た(図1c). よ び24

324 4. 與田 HPVゲ ノ ム の 検 出 とp53蛋 順 一,他9名 口 咽 科11:3 白発 現 の 関係 中 咽 頭 癌 に お け るHPV-DNAの 例 中7例(26.9%)で 白 発 現 とHPV-DNAの た 結 果,p53蛋 は7例 関連性 につ いて検 討 し 白 発 現 は,HPV-DNA陽 中2例(28.6%)で HPV-DNA陰 陽 性 率 は26 あ っ た(図4).p53蛋 性例で あ る の に 対 し て, 性 例 で は19例 中14例(73.7%)で 両 者 の 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た(図5).p53 蛋 白 発 現 お よ びHPV-DNAの 有 無 に よって累 積5年 意差 を認めなか 生 存 率 を 比 較 し た が,有 図4 HPVゲ ノ ム の 検 出(PCR) 中 咽 頭 癌 に お け るHPV-DNAの 陽 性 率 は26例 例(26.9%)で あ っ た.MW:分 ン1:陽 性 コ ン トロ ー ル(HeLA細 子 量 マ ー カ ー,レ 胞(HPV-DNA18 中7 ー 型),レ ー ン2:陽 性 コ ン トロ ー ル(CaSki(HPV-DNA 16型)),レ ー ン3 9:症 例. っ た(図6). 考 察 癌 抑 制 遺 伝 子p53は ヒ ト癌 の 中 で 最 も高 率 図5 に異 常 が認 め られ る1).中 咽 頭 癌 に お け るp53 遺 伝 子 エ ク ソ ン5お よ び7領 域 の 変 異 に つ い て 検 索 を行 っ た結 果,エ CCC(プ ロ リ ン)か ク ソ ン5領 域 コ ドン151 らTCC(セ リ ン)の HPV-DNAの 有 無 とp53蛋 白発現 の 関係 p53蛋 白 発 現 は,HPV-DNA陽 性 例 で は7例 中2例 (28.6%)で あ る の に 対 し て,HPV-DNA陰 性 例 で は19 例 中14例(73.7%)で 両 者 の 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た. ミス セ ン ス変 異 が 見 つ か っ た.し か し,今 回,遺 伝 子 変 異 の 検 索 が 可 能 で あ っ た の は26例 中14例 (53.8%)で,十 分 な検 索 が 行 え た とは言 い が た い.材 料 と して ホル マ リ ン固 定 パ ラフ ィ ン包 埋 組 織 を用 い た た めPCRで 目的 のDNAの 増 幅 が効 率 良 く得 られ な か っ た こ と が原 因 と考 え られ た.一 般 に,p53遺 突 然 変 異 で,さ 伝 子 変 異 の80%は らに そ の90%は 点 ミス セ ンス 変 異 図6 で あ る と言 わ れ て い る9).し た が っ て,癌 細 胞 で は,変 異 遺 伝 子 に よ っ て コ ー ドされ る変 異 蛋 白 が作 られ る.変 異p53蛋 白 は,野 HPV-DNAとp53蛋 関連 白発 現 の有 無 と予 後 との p53蛋 白発現 お よびHPV-DNAの 有無 に よっ て累 積 5年 生存 率 を比 較 した が,有 意 な差 を認 め なか っ た. 生 型 に比 べ て 半 減 期 が 長 く,細 胞 内(核 内)に 異 常 蓄 積 組 織 で のp53蛋 され る こ とが知 られ て い る.今 回 の 中咽 頭 癌 に し て の 報 告 が 多 い5)8). お け る検 索 で は62%に 過 剰 発 現 が 認 め られ た. 上 咽 頭 癌 で 同様 に行 っ た検 索 で は,p53蛋 現 は63.6%と しか し,p53蛋 白発 中咽 頭 癌 に比 べ て 大 差 な か っ た5). 白 発 現 の 有 無 と予 後 に 関 して は, 上 咽 頭 癌 で は有 意 差 を認 め な か っ たが,中 咽 頭 癌 で はp53蛋 白 発 現 例 は 累 積5年 生 存 率 が有 一般 に 白過剰発 現 は予後不 良因 子 と,変 異 蛋 白 の 免 疫 原 性 は 高 い た め,宿 主 の 免 疫 応 答 が 惹 起 され る こ と が 推 測 さ れ る. 健 常 人 に お い て は,末 梢 血 か らp53蛋 (ペ プ チ ド)に 対 す る 細 胞 傷 害 性T細 白断 片 胞(CTL) が 誘 導 され る こ と が 報 告 さ れ て い る10)11).し か し,現 在 ま で,担 癌 生 体 に お け るp53に 意 に 低 か っ た5).中 咽 頭 癌 に お い て はp53蛋 るCTLの 白 発 現 が予 後 因 子 と して 重 要 と考 え られ た.癌 る 液 性 免 疫 応 答 に 関 し て は,血 報 告 は な い.一 方,p53蛋 清p53抗 対 す 白に対す 体 の

1 ) Levine AJ, Momand J, Finlay CA:The p53 tumour suppressor gene. Nature 351:453-456, 1991.

3 ) Mashiyama S, Murakami Y, Yoshimoto T et al: Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene 6:1313-1318, 1991. 4 ) Orita M, Suzuki Y, Sekiya T et al:rapid and selective detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5:874-879, 1989. 6 ) Houbiers JGA, van der Burg SH, van de Watering LMG et al:antibodies against p53 are associated with poor prognosis of colorectal cancer. Br J Cancer 72:637-641, 1995. 7 ) Werner JA, Gottschlich S, Benedikt JF et al:p53 serum antibodies as prognostic indicator in head and neck cancer. Cancer Immunol Immunother 44: 112-116, 1997. 10 ) Houbiers JGA, Nijman HW, van der Burg SH et al:in vitro induction of human cytotoxic T lymphocyte responses against peptides of mutant and wild-type 11 ) Ropke M, Hald J, Guldberg P et al:spontaneous human squamous cell carcinomas are killed by a human cytotoxic T lymphocyte clone recognizing a wild-type p53-derived peptide. Proc Natl Acad Sci USA 93:14704-14707, 1996. 12 ) Crawford LV, Pim DC, Bulbrook RD:Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Tnt J Cancer 30: 403-408, 1982. 13 ) Soussi T.:The humoral response to the tumor suppressor, gene-product p53 in human cancer: implications for diagnosis and therapy. Immunol Today 17:354-356, 1996. 14 ) Davidoff AM, Dirk Iglehart J, Marks JR:Immune response to p53 is dependent upon p53 /HSP70 complexes in breast cancers. Proc Natl. Acad Sci USA 89:3439-3442, 1992. 15 ) Labrecque S, Naor N, Thompson D et al:analysis of anti-p53 antibody response in cancer patients. Cancer Res 53:3468-3471, 1993. 17 ) Clayman GL, El-Naggar AK, Roth JA et al:in vivo molecular therapy with p53 adenovirus for microscopic residual head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 55:1-6, 1995. 18 ) Barnes DM, Hanby AM, Gillett CE, et al:abnormal expression of wild type p53 protein in normal cells of a cancer patient. Lancet 340:259-263, 1992. p53. Eur J Immunol 23:2072-2077, 1993.

Multifactorial analysis of p53 alteration in mesopharyngeal carcinoma Junichi Yoda 1), Shinji Tamura 1), Ikuharu Takano 2), Yumi Kagawa 1), Shin Takei 1), Yoshihiko Hirohashi 1), Kazuma Yamauchi 1), Tetsuhiro Takano 1), Tadahito Saito 1), Noboru Yamanaka 1) 1 ) Department of Otorhinolaryngology, Wakayama Medical College 2 ) Department of Otorhinolaryngology, Hashimoto Municipal Hospital Mutations in the p53 gene are the commonest genetic alteration in human cancer. We investigated the p53 status in 26 mesopharyngeal carcinomas by using different methodologies. A single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products (PCR- SSCP analysis) was used to detect mutations of the p53 gene in formalin-fixed paraffin-embedded tumor specimens. Two of 14 mesopharyngeal carcinomas showed mobility shifts in exon 5. The samples were examined further by direct sequencing. Results showed that one had a single-base substitution (codon 151:CCC to TCC). Immunohistochemical staining for the detection of p53 protein was performed. In normal tissues, p53 protein is present in such low quantities that it is not readily detectable by immunohistochemical techniques. Numerous studies have shown that p53 protein accumulation, which is detected by immunohistochemical staining, is a consequence of its stabilization, usually the results of point mutations. Significant p53 overexpression was observed in 15 of 26 tumors (62%). No association was found between p53 overexpression and any of the following factors:site, histological differentiation, clinical stage, tumor stage, clinical response. In clinical stages III and IV, a five-year overall survival of patients with p53 overexpression was 0%, showing apparent contrast to 41.7% for the negative patients. Immunohistochemical detection of p53 protein can be used as a clinical marker predicting the prognosis of mesopharyngeal carcinomas. A p53 antibody in the sera of mesopharyngeal carcinoma patients was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Forty percent of the patients were positive for p53 antibody. Nevertheless, not all tumors with p53 accumulation lead to the production of detectable p53 antibodies. Serological analysis is advantageous because it does not require tumor sample. Futhermore, it can be used for the follow-up of patients. It is reported that E6 protein from high-risk human papilloma virus (HPV/type 16, 18) can induce the degradation of p53 and inactivate its function. We assessed HPV-DNA in mesopharyngeal carcinomas by PCR. Seven of 26 patients (26.9%) showed positive for HPV-DNA. An inverse correlation was observed between HPV-positive cancer and p53 overexpression. Key words:p53, mesopharyngeal carcinoma, human papilloma virus (HPV), prognosis