神 戸 女 子 短 期 大 学 論 攷 60 巻 49-54(2015) - ノート - ペトリフイルム TM を 用 いた 食 品 中 の 乳 酸 菌 数 測 定 逵 牧 子 中 村 智 英 子 Determination of Living Cells of Lactic Bacteria in Foods with Petri-film TM Makiko TSUJI Chieko NAKAMURA Abstract We examined the living cell number of lactic bacteria in foods by anaerobic culture with Petri-film TM (PFAC). As the reference medium,the de Man,Rogosa and Sharpe agar medium (MRSA) and an agar medium with bromocresol purple agar medium (BCPA) were used. When we determined the living cell number of lactic bacteria in various products of pickled vegetables (29 products),kimuchi (10 products),meats (13 products),the cell numbers determined with PFAC showed high correlations with those determined with MRSA and BCPA. キーワード:ペトリフイルム TM :Petri-film TM 食 品 中 の 乳 酸 菌 :lactic bacteria in foods 嫌 気 培 養 :anaerobic culture 相 関 :correlation 緒 言 乳 酸 菌 は, 主 に 糖 を 分 解 して 乳 酸 を 生 成 しエネルギーを 獲 得 するグラム 陽 性 細 菌 の 総 称 であ り,カタラーゼ 陽 性 で 嫌 気 条 件 でも 生 育 する 1) 乳 酸 菌 には Lactobacillus,Streptococcus, Lactococcus,Enterococcus,Pediococcus,Leuconostoc 等 の 属 が 含 まれる Streptococcus 属 の 選 択 培 地 と し て TATAC(Triphenyltetrazolium chloride-acridine orange- thallous sulphate-aesculin- crystal violet) 寒 天 培 地,Lactobacillus 属 の 選 択 培 地 と し て LBS (Lactobacillus selection) 寒 天 培 地,Lactobacillus 属,Bifidobacterium 属 及 び Streptococcus 属 を 検 出 する 培 地 として BL (Blood and Liver) 寒 天 培 地 などが 使 用 されている 2) が,これ らの 乳 酸 菌 の 測 定 に 使 用 される 培 地 は,いずれも 完 全 な 選 択 性 をもつわけではなく 常 に 例 外 が 生 じる 3,4) 複 数 種 類 の 培 地 の 併 用 により 生 菌 数 測 定 の 正 確 性 は 高 まるが,それでも 正 確 な 判 定 には 寒 天 平 板 培 地 上 に 形 成 されたコロニー 形 態 の 観 察 等 が 必 要 となり,これらの 判 別 には 経 - 49 -
験 と 熟 練 を 要 する 5) 乳 及 び 乳 製 品 の 成 分 規 格 に 関 する 省 令 で 定 められた 乳 酸 菌 の 生 菌 数 測 定 用 の 公 定 培 地 は, BCP(Bromocresol purple) 加 プレートカウント 寒 天 培 地 (BCPA)であり, 好 気 培 養 また は 嫌 気 培 養 により 乳 酸 菌 数 を 測 定 する 乳 酸 菌 飲 料 の 成 分 規 格 基 準 では 乳 酸 菌 数 が10 6 cells/g 以 上, 発 酵 乳 の 成 分 規 格 基 準 では10 7 cells/g 以 上 と 規 定 され, 正 確 な 検 査 法 が 望 まれている BCPA は 食 品 衛 生 法 で 乳 酸 菌 飲 料 および 発 酵 乳 の 乳 酸 菌 数 測 定 培 地 に 限 定 されているが, 栄 養 要 求 性 の 高 い 乳 酸 菌 は 生 育 が 遅 いという 問 題 点 がある 6) MRS(the de Man,Rogosa and Sharpe) 寒 天 培 地 (MRSA)は, 好 気 培 養 または 嫌 気 培 養 により 乳 酸 菌 数 を 測 定 することが 可 能 であり,ほとんどの 乳 酸 菌 の 生 育 に 適 しているため, 欧 米 諸 国 では 食 品 の 乳 酸 菌 数 測 定 に 広 く 使 用 さ れ て い る 4) た だ し,MRSA を 用 い て 嫌 気 培 養 し た 場 合,ビ フ ィ ズ ス 菌 (Bifidobacterium 属 )が 生 育 する 可 能 性 があり,その 場 合 には 集 落 の 形 状 からも 乳 酸 菌 (Lactobacillus 属 )と 区 別 することが 困 難 となる 6) また, 食 品 に 混 入 したガス 産 生 乳 酸 菌 が 食 品 の 品 質 を 低 下 させる 場 合 があり,ガス 産 生 乳 酸 菌 数 の 測 定 も 必 要 となるが, 生 菌 数 測 定 用 の BCPA や MRSA を 用 いる 平 板 培 養 法 では,それ らを 正 確 に 判 定 することができない 一 方, 民 間 細 菌 検 査 所 や 本 校 の 食 品 衛 生 学 実 験 の 授 業 でも 使 用 している 生 菌 数 測 定 用 の 簡 易 検 査 キットは, 操 作 に 経 験 や 熟 練 を 必 要 とせず 簡 便 で あり, 一 般 細 菌 用, 大 腸 菌 群 用, 黄 色 ブドウ 球 菌 用 等 の 種 々の 細 菌 群 用 に 開 発 され 市 販 されて いるが, 乳 酸 菌 用 の 簡 易 検 査 キットは 開 発 されていない 一 般 細 菌 用 の 簡 易 検 査 キットとして 汎 用 されているペトリフィルム TM AC (PFAC)は,ゲ ル 状 培 地 を2 枚 の 透 明 プラスチックフィルムで 挟 み 込 んだ 形 状 で, 好 気 的 培 養 条 件 で 使 用 する 構 造 上 ガス 産 生 菌 の 検 出 も 可 能 である 本 研 究 では,PFAC を 本 来 の 使 用 法 とは 異 なる 嫌 気 条 件 で 使 用 することにより, 乳 酸 菌 数 及 びガス 産 生 菌 数 の 計 測 を 検 討 した 実 験 材 料 と 方 法 1) 使 用 培 地 BCPA( 日 水 製 薬, 東 京 ),MRSA(オキソイド, 英 国 ),および PFAC(スリーエムヘル スケア, 東 京 )の3 種 類 の 培 地 を 使 用 した 2) 供 試 菌 株 と 培 養 条 件 乳 酸 菌 の 標 準 菌 株 と し て Lactobacillus plantarum NBRC 15891T,Lactobacillus casei NBRC 15883T,Lactobacillus animalis NBRC 15882T を 使 用 した 培 養 条 件 は35 で48 時 間 または72 時 間 の 静 置 培 養 とした PFAC を 用 いる 場 合 は 嫌 気 培 養 を 行 い,BCPA および MRSA を 用 いる 場 合 は 好 気 培 養 を 行 った - 50 -
3) 供 試 食 品 食 品 中 の 乳 酸 菌 の 生 菌 数 を 前 述 の3 種 類 の 培 地 で 測 定 し, 得 られた 結 果 を 比 較 検 討 するため, 漬 け 物 キムチ(39 例 ) 食 肉 (13 例 )の 計 52 例 を 検 査 対 象 とした 4) 乳 酸 菌 数 測 定 法 乳 酸 菌 標 準 株 を 普 通 ブイヨンの10ml に 接 種 し,35 で24 時 間 培 養 後, 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 希 釈 し,PFAC,BCPA 及 び MRSA を 用 いて 生 菌 数 を 測 定 した PFAC を 用 いる 場 合 には,ア ネロパック ケンキおよび 嫌 気 指 示 薬 ( 三 菱 ガス 化 学, 東 京 )と 共 に, 接 種 した PFAC を 嫌 気 培 養 用 ナイロン 袋 に 入 れ,35 で48 時 間 嫌 気 培 養 後, 発 育 した 赤 色 コロニーを 計 測 した 漬 け 物 キムチ, 及 び 食 肉 中 の 乳 酸 菌 数 試 験 は, 試 料 の10gを 滅 菌 ストマッカー 袋 に 入 れ, 滅 菌 生 理 食 塩 水 90ml を 加 えて,ストマッカーで30 秒 間 処 理 したものを 試 料 液 とした これら の 試 料 を 用 いて, 前 述 の 標 準 菌 の 場 合 と 同 様 に,3 種 類 の 培 地 を 用 いて 生 菌 数 測 定 を 行 った BCPA を 用 いる 生 菌 数 測 定 は, 乳 及 び 乳 製 品 の 成 分 規 格 に 関 する 省 令 に 従 い 形 成 された 黄 色 コロニーを 乳 酸 菌 として 計 測 し,MRSA を 用 いる 場 合 にはすべてのコロニーを 乳 酸 菌 とし て 計 測 した PFAC を 用 いる 場 合 は 赤 色 コロニーを 乳 酸 菌 として 計 測 し,ガス 産 生 菌 数 も 肉 眼 で 観 察 して 計 測 した また,すべての 菌 数 測 定 は6 連 で 行 った(n=6) 結 果 乳 酸 菌 標 準 株 の 生 菌 数 を3 種 類 の 培 地 で 測 定 した 結 果 を 表 1に 示 した L. plantarum,l. casei, 及 び L. animalis のいずれの 場 合 も, 使 用 した 培 地 にかかわらず 生 菌 数 に 有 意 差 は 見 ら れず,PFAC を 用 いる 嫌 気 培 養 法 は, 乳 酸 菌 測 定 が 可 能 と 思 われた 漬 け 物 キムチ(39 例 )の 乳 酸 菌 生 菌 数 を3 種 類 の 培 地 で 測 定 した 結 果 を 表 2に 示 した ま た, 各 培 地 で 測 定 した 生 菌 数 の 相 関 性 を 図 1に 示 した PFAC は,MRSA や BCPA を 用 いて 測 定 した 生 菌 数 と 同 様 の 結 果 を 示 した PFAC と MRSA で 測 定 した 乳 酸 菌 数 の 相 関 係 数 は0.98,PFAC と BCPA の 間 の 相 関 係 数 は0.98であった また,BCPA と MRSA で 測 定 した 時 の 乳 酸 菌 数 の 相 関 係 数 は0.96であった 一 方,PFAC に 発 育 したコロニーの 周 辺 にはガスの 蓄 積 が 見 られ( 図 2),ガス 産 生 菌 の 計 測 が 容 易 であった( 表 2) 続 いて, 食 肉 13 例 の 乳 酸 菌 生 菌 数 を3 種 類 の 培 地 で 測 定 した 結 果 を 表 3に 示 した また, 各 培 地 で 測 定 した 生 菌 数 の 相 関 性 を 図 3に 示 した 食 肉 の 場 合 も, 培 地 の 種 類 にかかわらず, 生 菌 数 はほ ぼ 同 様 の 結 果 となった 各 培 地 で 測 定 した 乳 酸 菌 表 1. 異 なる 培 地 で 測 定 した 乳 酸 菌 生 菌 数 菌 株 培 地 生 菌 数 (log CFU) L. plantarum PFAC 7.52±0.04 " MRSA 7.56±0.12 " BCPA 7.51±0.10 L. casei PFAC 7.64±0.17 " MRSA 7.45±0.19 " BCPA 7.43±0.19 L. animalis PFAC 7.77±0.24 " MRSA 7.74±0.43 " BCPA 7.76±0.32-51 -
生 菌 数 の 相 関 係 数 は, 培 地 の 組 合 せにかかわらず0.99となった 表 2. 漬 け 物 キムチ 中 の 乳 酸 菌 生 菌 数 試 料 番 号 食 品 生 菌 数 (logcfu) ガス 産 生 菌 PFAC MRSA BCPA (logcfu) 漬 け 物 1 野 沢 菜 5.5 5.8 5.6 5.5 2 大 根 2.9 2.0 3.0 2.3 3 キュウリ 4.8 4.6 4.7 4.3 4 沢 庵 3.7 3.5 3.9 3.7 5 白 菜 7.5 7.5 7.3 7.3 6 白 菜 8.2 8.2 8.2 8.2 7 キュウリ 7.2 7.3 7.3 7.2 8 赤 カブ 4.6 5.0 5.0 4.6 9 ナス 5.5 5.6 5.4 5.5 10 キュウリ 7.0 7.1 7.0 6.9 11 沢 庵 5.3 5.5 5.2 5.3 12 野 沢 菜 8.0 8.1 8.0 8.0 13 茄 子 4.9 4.9 5.2 4.9 14 キュウリ 7.2 8.2 8.1 7.0 15 沢 庵 8.2 8.0 8.0 8.0 16 大 根 4.8 5.1 4.8 4.6 17 沢 庵 5.8 5.6 5.5 5.6 18 白 菜 4.9 4.9 4.9 4.9 19 茄 子 4.8 4.9 4.9 4.7 20 キュウリ 7.0 7.1 7.2 7.0 21 カブラ 4.9 4.8 4.7 4.7 22 白 菜 7.2 7.0 7.0 7.0 23 白 菜 7.9 8.0 7.1 7.9 24 キュウリ 8.2 7.9 8.1 8.2 25 沢 庵 5.2 5.4 5.3 5.1 26 白 菜 6.9 6.7 6.7 6.7 27 キュウリ 7.3 7.0 7.0 7.3 28 大 根 5.8 5.7 5.2 5.7 29 赤 カブ 5.3 5.4 5.2 5.3 キムチ 30 白 菜 6.4 6.4 6.2 6.4 31 大 根 3.7 3.1 3.3 3.4 32 白 菜 4.3 4.4 4.2 4.4 33 大 根 3.7 3.1 3.1 3.5 34 白 菜 5.0 5.0 5.4 5.0 35 白 菜 4.9 5.2 5.1 4.9 36 大 根 5.0 5.3 5.2 5.0 37 大 根 4.3 4.0 3.9 4.0 38 白 菜 3.5 3.3 3.4 3.4 39 大 根 3.6 3.1 3.1 3.3-52 -
図 1. 異 なる 培 地 で 測 定 した 漬 け 物 中 の 乳 酸 菌 生 菌 数 の 相 関 性 図 1. 異 なる 培 地 で 測 定 した 漬 け 物 中 の 乳 酸 菌 生 菌 数 の 相 関 性 発 生 ガス 試 料 番 号 表 3. 食 肉 中 の 乳 酸 菌 生 菌 数 生 菌 数 (logcfu) 食 肉 PFAC MRSA BCPA 図 2.PFAC で 観 察 されるガス 産 生 菌 1 豚 8.8 8.7 8.5 2 鶏 5.2 4.8 5.1 3 牛 6.9 7.0 7.0 4 豚 4.4 4.5 4.5 5 牛 6.6 6.7 6.8 6 豚 3.9 3.9 3.8 7 豚 4.5 4.5 4.5 8 牛 6.9 6.8 6.9 9 豚 5.5 5.6 5.7 10 鶏 4.9 4.5 4.9 11 牛 5.5 5.9 5.9 12 豚 6.1 6.3 6.3 13 鶏 5.2 5.0 5.0 図 2.PFAC で 観 察 されるガス 産 生 菌 図 3. 異 なる 培 地 で 測 定 した 肉 類 の 乳 酸 菌 生 菌 数 の 相 関 性 図 3. 異 なる 培 地 で 測 定 した 肉 類 の 乳 酸 菌 生 菌 数 の 相 関 性 - 53 -
考 察 食 品 中 の 乳 酸 菌 数 を3 種 類 の 培 地 を 用 いて 測 定 した 食 品 としては 乳 酸 菌 の 存 在 が 知 られて いる 漬 け 物 キムチ, 及 び 食 肉 類 を 使 用 した これらの 食 品 に 存 在 する 標 準 的 な 乳 酸 菌 として L.plantarum,L.casei,L.animalis を 用 いた L.plantarum は 乳 酸 生 産 量 が 多 く, 漬 け 物 の 品 質 低 下 を 引 き 起 こす 主 要 な 乳 酸 菌 であり,L.casei は 乳 製 品 や 漬 け 物 に 見 られる 主 要 乳 酸 菌 で15 程 度 の 冷 温 でも 良 く 生 育 する 7) L.animalis は 動 物 の 小 腸 等 から 分 離 される 乳 酸 菌 で 肉 類 等 にしばしば 混 入 する 8) これら3 種 類 の 標 準 株 を 用 いて,3 種 類 の 培 地 で 乳 酸 菌 数 を 測 定 したところ, 有 意 な 違 いは 見 られず,PFAC は 乳 酸 菌 測 定 に 利 用 可 能 であると 思 われた 次 に, 漬 け 物 キムチ 中 の 乳 酸 菌 数 を 測 定 したところ,PFAC は 公 定 法 の BCPA と 同 様 の 生 菌 数 を 示 した また,PFAC を 用 いて 同 時 にガス 産 生 菌 を 計 測 することも 可 能 であった 漬 け 物 キムチに 関 する 消 費 者 からの 苦 情 の 主 要 原 因 の 一 つはガス 産 生 であり,これらの 食 品 の 微 生 物 学 的 な 品 質 管 理 に PFAC が 極 めて 有 効 であると 考 えられた 食 肉 の 乳 酸 菌 測 定 では 3 種 類 何 れの 培 地 を 用 いても, 計 測 された 乳 酸 菌 数 はほぼ 同 様 であっ た 顕 微 鏡 観 察 において,ビフィズス 菌 特 有 の 不 定 形 細 胞 は 観 察 されなかったため, 嫌 気 性 菌 の 詳 細 は 不 明 である しかし, 全 体 として,PFAC は 食 品 の 乳 酸 菌 測 定 に 有 用 であると 考 えら れた 文 献 1) 日 本 食 品 衛 生 協 会, 食 品 衛 生 検 査 指 針 ( 微 生 物 編 ),349-360(2004). 2) 光 岡 知 足,ヒトフローラ 研 究. 腸 内 細 菌 学 雑 誌,19: 179-192 (2005). 3)Talwalkar,A. and Kailasapathy,K. Comparison of selective and differential media for the accurate enumeration of strains of Lactobacillus acidophilus,bifidobacterium spp. and Lactobacillus casei complex from commercial yoghurts. Int. Dairy J.,14:143-149 (2004). 4)Ashraf,R. and Shah,N.P. Selective and differential enumerations of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,streptococcus thermophilus,lactobacillus acidophilus,lactobacillus casei and Bifidobacterium spp. in yoghurt A review,int. J. Food Microbiol.,149:194-208 (2011). 5)De Casteele,S.V.,Vanheuverzwijn,T.,Ruyssen,T.,Assche,P.V.,Swings,J.,and Huys,G. Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters. Int. Dairy J.,16:1470-1476 (2006). 6) 厚 生 労 働 省, 食 品 衛 生 検 査 指 針 ( 微 生 物 編 ), 日 本 食 品 衛 生 協 会,349-360(2005). 7) 森 地 敏 樹, 微 生 物 の 分 離 法, 各 種 微 生 物 群,R&D プランニング,435-444 (2001). 8)Hayes1,M.,Stanton1,C.,Slattery1,H.,O'Sullivan1,O.,Hill,C.,Fitzgerald,G.F. and Ross, R.P. Casein Fermentate of Lactobacillus animalis DPC6134 Contains a Range of Novel Propeptide Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors. Appl. Environ. Microbiol.,73:4658-4667(2007). - 54 -