食 品 化 学 はじめに 平 成 18 年 度 I 部 化 学 研 究 部 火 曜 日 班 普 段 何 も 考 えずに 色 々 食 べていると 思 うが 食 品 には 色 々な 酵 素 が 含 まれている 肉 と 一 緒 にパイナップルを 食 べるとよいと 聞 いたことがあるだろう それはパイナッ プルにブロメラインと 呼 ばれるたんぱく 質 分 解 酵 素 が 含 まれているからである 食 品 の 香 り 風 味 にも 酵 素 は 深 く 関 係 している そこで 火 曜 班 では 食 品 に 含 まれる 酵 素 に 注 目 し 酵 素 一 つ 一 つの 特 性 ではなく 実 験 を 通 して 酵 素 全 体 の 働 きについて 学 ぶ ことを 目 標 に 活 動 してきた 原 理 酵 素 について 酵 素 は 触 媒 として 働 く しかし 酵 素 が 触 媒 できる 反 応 物 質 は 決 まっており それぞ れ 固 有 の 反 応 物 質 にのみ 働 く この 反 応 物 質 のことを 基 質 と 言 う 多 くの 物 質 が 混 在 していても 特 定 の 基 質 を 識 別 して 働 く この 特 性 を 基 質 特 異 性 という 基 質 特 異 性 という 言 葉 は 有 名 だが 必 ず 一 つの 基 質 にのみ 働 くのではなく 色 々な 物 質 を 触 媒 できる ものもある また 酵 素 は 酸 化 反 応 加 水 分 解 反 応 など 触 媒 する 反 応 にも 特 異 性 を 持 っており 反 応 特 異 性 などと 呼 ばれ 他 の 特 異 性 とは 区 別 されている 酵 素 は 生 体 内 の 代 謝 と 関 連 して 反 応 の 調 節 制 御 に 有 効 な 働 きを 示 す 基 質 を 選 択 する 識 別 能 に 優 れ 代 謝 の 調 節 に 有 効 なことが 酵 素 の 顕 著 な 特 徴 である 酵 素 はアミノ 酸 以 外 の 構 成 要 素 を 持 っており それらは 共 有 結 合 性 ではなく 非 共 有 性 で 酵 素 に 結 合 し 酵 素 の 構 造 や 機 能 になくてはならない 重 要 な 働 きをする 原 子 や 原 子 団 であり 助 因 子 と 呼 ばれる 今 回 は 基 質 として 用 いたアスコルビン 酸 もそのひとつ である 共 有 性 のない 結 合 で 酵 素 に 取 り 込 まれているため 透 析 有 機 溶 媒 抽 出 など により 助 因 子 は 酵 素 から 外 すことができる 助 因 子 を 外 した 酵 素 は 通 常 触 媒 活 性 を 持 たない 純 然 たるたんぱく 質 で アポ 酵 素 と 呼 ばれる しかしその 高 次 構 造 はほぼ 完 全 に 保 たれることが 多 く 助 因 子 と 再 結 合 して 活 性 のあるホロ 酵 素 を 形 成 することがで きる アスコルビン 酸 について ビタミンCはアスコルビン 酸 ともよばれ 生 体 内 で 種 々の 酸 化 還 元 反 応 に 関 与 する 化 学 構 造 は L 型 の 六 炭 糖 誘 導 体 のラクトン 環 をもち 還 元 型 と 酸 化 型 がある 食 品 中 では 還 元 型 のアスコルビン 酸 および 酸 化 型 のデヒドロアスコルビン 酸 として 存 在 する アスコルビン 酸 は 酸 化 剤 によりデヒドロアスコルビン 酸 になるが 硫 化 水 素 のような 弱 い 還 元 剤 で 再 びアスコルビン 酸 に 戻 すことができる 体 内 でもこの 酸 化 還 元 反 応 は
行 われている この 可 逆 的 性 質 はCの 特 性 であって ビタミンCの 測 定 法 にもかかわ りのある 点 である 酸 化 が 進 むとデヒドロアスコルビン 酸 はすみやかにビタミン 効 力 を 持 たないジケトグロン 酸 へと 変 化 し その 後 シュウ 酸 とステレオン 酸 に 分 解 する アスコルビン 酸 はエンジオールグループがあり これはCとCの 間 の2 重 結 合 に 隣 接 して-Hがついているのでこの-HのHが 非 常 に 不 安 定 になり 離 れやすい つまり 酸 化 されやすいのである C C H H HC H H CH CH 2 H H HC CH CH 2 H H H 2 C 還 元 型 酸 化 型 ジケトグロン 酸 CH CH 2 H 食 品 中 のビタミンCを 定 量 する 方 法 としては ヒドラジン 比 色 法 やアスコルビン 酸 がインドフェノールと 反 応 することを 利 用 したインドフェノール 適 定 法 がある 今 回 は 後 者 を 用 いた 2,6-ジクロロインドフェノールの 酸 化 型 は 紅 色 であるが 酸 性 水 溶 液 中 ではア スコルビン 酸 によって 還 元 されて 無 色 に 変 わる CH H H H CH CH 2 H H Cl Cl N HC H CH CH 2 H H Cl Cl NH H アスコルビン 酸 2,6 ジクロロインドフェノール デヒドロアスコルビン 酸 ( 還 元 型 ) 紅 色 ( 酸 化 型 ) ( 酸 化 型 ) 無 色 ( 還 元 型 ) よって 一 定 量 のインドフェノール 溶 液 にアスコルビン 酸 を 滴 下 することにより 溶 液 の 色 の 消 える 点 を 終 点 とし 適 定 量 からアスコルビン 酸 量 を 求 めることができる インドフェノール 溶 液 は 保 存 中 に 変 化 しやすいため 試 料 の 測 定 と 同 時 に 標 準 のアス コルビン 酸 標 準 溶 液 で 検 定 する 必 要 がある 検 定 に 用 いるアスコルビン 酸 標 準 溶 液 も 変 化 を 受 けやすいので その 濃 度 をヨウ 素 酸 カリウム 標 準 溶 液 で 滴 定 して 求 めておく アスコルビン 酸 標 準 溶 液 濃 度 の 検 定 KI 3 + 5KI +6HP 3 3I 2 + 6KP 3 + 3H 2
C 6 H 8 6 +I 2 C 6 H 6 6 + 2HI アスコルビン 酸 デヒドロアスコルビン 酸 ( 還 元 型 ) ( 酸 化 型 ) カタラーゼ カタラーゼは 嫌 気 生 菌 を 除 いてほぼ 全 ての 生 物 に 分 布 しており 過 酸 化 水 素 を 水 と 酸 素 に 分 解 する 反 応 を 触 媒 する 今 回 はジャガイモと 納 豆 に 含 まれているものを 利 用 した 2H 2 2 2H 2 + 2 パーオキシターゼ パーオキシターゼはH 2 2 (またはCH 3 CH)の 存 在 下 で フェノール 類 ア ミン 類 などを 次 の 反 応 式 で 酸 化 触 媒 する H 2 2 +AH 2 2H 2 +A 今 回 の 実 験 ではパーオキシターゼはジャガイモに 含 まれており 以 下 の 反 応 を 触 媒 し ている + H22 +2H2 -トリジン トリジンブルー 実 験 1 アスコルビナーゼ < 目 的 > 酵 素 によってビタミン Cがどれだけ 酸 化 されるか 調 べる
< 試 料 > 大 根 人 参 < 試 薬 > メタリン 酸 ヨウ 素 酸 カリウム ヨウ 化 カリウム アスコルビン 酸 でんぷん 2,6-ジクロロインドフェノール < 操 作 > アスコルビン 酸 標 準 溶 液 濃 度 の 検 定 1 アスコルビン 酸 標 準 溶 液 5mlを 50ml 容 三 角 フラスコに 取 り ヨウ 化 カリウム 溶 液 0.5mlとでんぷん 溶 液 数 滴 を 加 えた 2 0.00017Mのヨウ 素 酸 カリウム 標 準 溶 液 で 滴 定 した 色 素 溶 液 の 検 定 1 色 素 溶 液 5mlを 50ml 容 三 角 フラスコに 取 った 2 アスコルビン 酸 を 滴 定 した 試 料 溶 液 の 調 整 1 大 根 をおろし 5,0gずつを2つのビーカーに 量 り 取 った 2 人 参 もおろし 約 3.0gを 一 方 のビーカーに 加 えガラス 棒 でよく 混 ぜた 水 分 が 少 なかったため 試 料 が 浸 る 程 度 にイオン 交 換 水 をいれ 15 分 放 置 した 3 両 方 のビーカーに5%メタリン 酸 40mlずつを 加 え よくかき 混 ぜてからブフナ ーロートでろ 過 した この 際 ろ 液 が 100mlになるようにイオン 交 換 水 を 加 えた 滴 定 色 素 溶 液 をダイコンのみは 5.0ml 人 参 も 含 むものは 1.0mlそれぞれビーカーにとり 試 料 溶 液 で 滴 定 した 実 験 2 アスコルビナーゼ < 目 的 > 時 間 による 酵 素 の 反 応 の 変 化 を 調 べる < 試 料 > 人 参 < 試 薬 > メタリン 酸 アスコルビン 酸 2,6-ジクロロインドフェノール < 操 作 > 酵 素 液 ビタミンC 液 の 調 整 1 ニンジンをすりおろし イオン 交 換 水 100mlを 加 え 吸 引 ろ 過 してろ 液 を 得 て 全 量 が150mlになるようにイオン 交 換 水 を 加 え これを 酵 素 液 とした
2 アスコルビン 酸 を 100mgとり 25mlのメスフラスコでメスアップした この 溶 液 をホールピペットで2mlとり 50mlのメスフラスコでメスアップし これをVC 溶 液 とした 試 料 溶 液 の 配 合 表 のように 配 合 した 表 1 溶 液 の 調 製 酵 素 溶 液 (ml) VC 希 釈 液 (ml) 水 (ml) H 3 P 4 液 (ml) PH A 50 25 25 0 7 B 50 25 0 25 2 C 50 25 25 0 7 Cの 溶 液 は 酵 素 液 を 60 で 10 分 ほど 加 熱 してからVC 溶 液 を 加 えた phはp H 試 験 紙 で 確 認 した ビタミンCの 残 存 率 を 調 べる 1 AからCの 溶 液 をビュレットに 入 れ 色 素 液 ( 実 験 1とほぼ 同 じ 濃 度 のもの)3ml を 試 験 管 に 取 ったものに 滴 下 しその 滴 下 量 を 記 録 した Cはビュレットが 足 りなかっ たためメスピペットを 用 いて 実 験 を 行 った 実 験 3 カタラーゼ < 目 的 > 酵 素 (カタラーゼ)の 最 適 ph 温 度 を 調 べる < 試 料 > ジャガイモ 納 豆 < 試 薬 > 3% 過 酸 化 水 素 水 二 酸 化 マンガン 硫 酸 水 酸 化 ナトリウム < 操 作 > 1 ジャガイモは 皮 をむき 5mm 角 にし 納 豆 は 半 分 にした 2 試 験 管 9 本 に3% 過 酸 化 水 素 水 を5mlずついれ 冷 水 (5~10 ) 温 湯 (30~40 ) 湯 (70~80 )の 層 につけておいた 3 2の 試 験 管 にジャガイモ 納 豆 二 酸 化 マンガンを 加 え 温 度 や 試 料 の 違 いにお ける 泡 の 出 方 の 違 いを 観 察 した 4 3で 酵 素 が 含 まれる 試 料 を 用 いたもので 一 番 泡 の 出 方 のよかった 温 度 に 試 験 管 9 本 を 入 れ ph2 7 10に 調 整 した3% 過 酸 化 水 素 水 を5mlずついれた 5 各 phの 溶 液 にジャガイモ 納 豆 二 酸 化 マンガンを 加 え phや 試
料 の 違 いにおける 泡 の 出 方 の 違 いを 観 察 した 実 験 4 パーオキシ ゼ < 目 的 > じゃがいもに 含 まれている 酵 素 の 温 度 の 違 いによる 触 媒 機 能 を 調 べるとともに 酵 素 の 反 応 特 異 性 について 学 ぶ < 試 料 > ジャガイモ < 試 薬 > -トリジン 二 塩 酸 塩 3% 過 酸 化 水 素 水 < 操 作 > 1 ジャガイモの 皮 をむき5mmの 厚 さに 輪 切 りした 2 3% 過 酸 化 水 素 水 10mlをビーカーにとり -トリジン 塩 酸 塩 を 少 量 加 えて 撹 拌 し 溶 解 させた 3 2の 溶 液 をジャガイモの 切 り 口 の 上 に2~3 滴 落 とし 反 応 を 観 察 した 4 60 のお 湯 に 別 のジャガイモを 10 分 つけ 水 を 切 り2の 溶 液 を2~3 滴 落 とし 反 応 を 観 察 した 5 4のジャガイモを 切 り 断 面 にも2の 溶 液 を 滴 下 した 実 験 1 結 果 表 2 色 素 溶 液 の 検 定 回 数 ヨウ 素 酸 カリウム 標 準 溶 液 のア ス コル ビン 酸 標 準 濃 度 滴 定 値 (ml) (mg/ml)
1 2.85 0.0502 2 1.49 0.0262 表 3 試 料 溶 液 回 数 標 準 溶 液 滴 定 値 (ml) 色 素 溶 液 1mlに 対 するアスコルヒ ン 酸 量 (mg) 1 1.75 0.0176 2 3.9 0.0205 表 4 滴 定 回 数 大 根 のみ (mg%) 大 根 と 人 参 (mg%) アスコルビン 酸 残 存 率 (%) 1 1.74 0.998 57.3 2 1.15 0.662 57.6 実 験 2 経 過 時 間 (h) 表 5 適 下 量 とアスコルビン 酸 残 存 率 A 試 料 滴 下 量 (ml) 残 存 率 (%) B 試 料 滴 下 量 (ml) 残 存 率 (%) C 試 料 滴 下 量 (ml) 残 存 率 (%) 0 0.72 100.0 0.52 100.0 0.49 100.0 1 4.62 15.6 0.78 72.2 0.52 94.6 2 5.22 13.8 0.65 80.0 0.56 87.6 3 6.36 11.3 0.60 86.6 0.58 84.3 4 5.64 12.8 0.64 81.3 0.65 75.8 5 6.10 11.8 0.72 72.2 0.72 67.7 アスコルビン 酸 残 存 率 =(0 時 間 の 適 下 量 / 経 過 時 間 の 滴 下 量 ) 100
100.0 アスコルビン 酸 残 存 率 /% 80.0 60.0 40.0 20.0 ph7( 非 加 熱 ) ph2( 非 加 熱 ) ph7( 加 熱 ) 0.0 0 1 2 3 4 5 経 過 時 間 /h 実 験 3 温 度 の 違 いで 比 較 する 実 験 では どの 溶 液 からも 気 体 が 発 生 しており その 度 合 いは ジャガイモでは 温 湯 > 冷 水 > 湯 であり 二 酸 化 マンガンは 湯 > 温 湯 > 冷 水 だった 納 豆 は 軽 くて 気 体 の 発 生 ですぐ 浮 き 上 がってしまったため 違 いがあまりよく 観 察 できな かった phの 違 いで 比 較 する 実 験 ではジャガイモはpH7で 最 もよく 反 応 していた 二 酸 化 マンガンでは 差 が 見 られなかった 実 験 4 加 熱 前 のジャガイモにトリジンの 溶 液 を 滴 下 したところ 色 が 青 く 変 わり 気 体 が 発 生 していた 加 熱 後 のジャガイモの 時 も 色 は 青 く 変 化 したが 気 体 の 発 生 は 少 なかった 切 断 面 に 滴 下 すると 加 熱 前 同 様 に 気 体 が 発 生 した
考 察 実 験 2の 結 果 でAとCを 比 較 するとCの 分 解 能 はAに 比 べてかなり 悪 く 加 熱 によ りアスコルビナーゼの 構 造 が 変 化 したと 考 えられる 同 様 にAとBを 比 べると 酸 性 ではアスコルビナーゼの 働 きが 抑 えられていることが 分 かった しかしアスコルビナ ーゼの 働 きが 酸 性 では 弱 いのか 構 造 が 壊 れてしまっていたのかが 分 からなかったの で 最 後 に 中 性 に 戻 して 実 験 し 確 かめる 必 要 があったと 思 われる また 実 験 2で 時 間 の 経 過 とともにアスコルビン 酸 の 残 存 率 が 減 るはずであるがpH 2の 溶 液 では 増 えてしまった これはビュレット 内 の 溶 液 を 撹 拌 せずに 最 初 の2 時 間 実 験 を 行 ってしまったせいだと 思 われる ph2の 溶 液 はろ 過 したにも 関 わらずニンジ ンと 思 われる 沈 殿 がみられた そのため 最 初 の 一 時 間 は 多 くの 酵 素 に 触 れている 部 分 を 滴 定 したためアスコルビン 酸 がよく 分 解 されているが 2 時 間 目 以 降 は 酵 素 とあま り 触 れていない 部 分 を 実 験 に 用 いてしまったため 分 解 されたアスコルビン 酸 が 10% 以 上 元 に 戻 ったように 見 える 結 果 が 出 てしまった 定 期 的 に 攪 拌 しておかなかった 事 が 失 敗 の 原 因 といえる しかしAの 溶 液 で 分 解 率 が 上 下 した 原 因 はこれだけではなく ジケトグロン 酸 まで 酸 化 されていないのであれば デヒドロアスコルビン 酸 は 弱 い 還 元 剤 でも 元 のアスコルビン 酸 に 戻 ることが 出 来 るので 可 逆 反 応 により 元 に 戻 ったとい うことも 考 えられる 空 気 中 の 二 酸 化 炭 素 が 溶 け 溶 液 が 酸 性 になり アスコルビン 酸 が 安 定 になったためこのような 現 象 が 起 きた 可 能 性 もある しかし 一 方 でアスコルビン 酸 は 中 性 やアルカリ 性 の 条 件 下 では 空 気 中 の 酸 素 に 酸 化 されやすくなるため 今 回 の 実 験 は 溶 液 が 常 に 外 気 にさらしたため それによりAと Bの 溶 液 は 酵 素 以 外 の 要 因 で 分 解 されてしまった 可 能 性 もある よって 最 初 のうちは 溶 液 が 中 性 だったため 酸 素 により 多 く 分 解 され 数 時 間 後 は 若 干 酸 性 になったため 可 逆 反 応 が 起 こり 分 解 能 が 下 がったと 考 えられる 今 回 は1 時 間 おきで 実 験 を 行 ったが 酵 素 の 反 応 は 速 いのでもっと 測 定 の 間 隔 を 短 く して 実 験 を 行 うべきであった 実 験 1は 酸 性 中 で 実 験 しており 実 験 2の 結 果 より 時 間 をかけてもアスコルビン 酸 はあまり 酸 化 されないと 考 えられるが 放 置 時 間 が 短 いのにもかかわらず 40%ほど 分 解 されたという 結 果 がでてしまった これは 試 料 の 滴 定 の 際 にニンジンの 色 があり
終 点 がうまく 見 極 められてなかったと 考 えられる 実 験 4では 一 度 加 熱 した 試 料 を 用 いても 加 熱 前 同 様 に-トリジンの 色 が 変 化 し ているコトからパーオキシ ゼは 熱 に 強 いということが 分 かった 発 生 した 気 体 はカ タラーゼの 作 用 により 生 じた 酸 素 だと 思 われるが これは 加 熱 後 の 試 料 では 発 生 量 が 減 ったためカタラーゼは 熱 により 失 活 したと 考 えられる じゃがいもはパーオキシ ゼとカタラーゼの 両 方 の 酵 素 が 含 まれており 両 酵 素 とも 過 酸 化 水 素 を 分 解 し 水 を 発 生 させる 反 応 を 触 媒 すると 言 える しかしカタラーゼの 多 くが 失 活 し パーオキシタ ーゼが 残 っている 状 態 では 酸 素 の 発 生 は 抑 えられておりパーオキシターゼは 2H 2 2 2H 2 + 2 は 触 媒 しないことが 分 かる これは 反 応 特 異 性 によるものである と 考 えられる 参 考 文 献 西 山 隆 造 身 近 なライフサイエンスの 実 験 オーム 社 飯 盛 和 代 食 品 化 学 実 験 ノート 建 社 大 西 正 健 酵 素 科 学 哲 学 出 版