10. 身 近 な 食 品 の 化 学 = 牛 乳 からカゼインの 分 離 とタンパク 質 の 定 性 反 応 葉 緑 素 の 抽 出 と 銅 クロロフィルの 合 成 = 家 政 教 育 講 座 井 奥 加 奈 調 理 すること は もっとも 身 近 な 化 学 反 応 実 験 である たとえば ゆで 卵 を 作 る のは タンパク 質 が 加 熱 により 凝 固 変 性 する 性 質 を 持 つ からできる さらに ゆ で 卵 でも 卵 黄 と 卵 白 で 凝 固 温 度 が 異 なる から 温 泉 卵 や 半 熟 卵 ができる また 卵 白 は 88.4%が 水 分 10.5%がたんぱく 質 で 1) タンパク 質 はアルブミンやグロブリンなどから 構 成 さ れる つまり タンパク 質 は アミノ 酸 が 多 数 集 まった 高 分 子 化 合 物 (= 基 礎 領 域 )なのであるが 食 品 により そのアミノ 酸 組 成 比 は 異 なるので 性 質 も 異 なる(= 応 用 領 域 ) 理 科 を 生 活 へ 還 元 していくためには このよ うに 授 業 のなかで 基 礎 と 応 用 を 結 びつける 指 導 や 実 験 を 通 しての 理 解 が 必 要 であり それを 食 品 でやるな らば 理 科 のなかでの 食 育 として 十 分 といえるだろう ここでは 牛 乳 (スキムミルク)からカゼインを 分 離 し その 性 質 を 調 べながら 化 学 に 出 てくるタンパク 質 の 性 質 を 理 解 することを 目 的 とする また 牛 乳 を 原 料 として 酸 凝 固 によりカッテージチーズを 調 製 し 化 学 反 応 が 食 品 加 工 にも 応 用 されていることを 紹 介 する 1) 食 品 成 分 表 2010 より 食 品 番 号 12014 生 卵 白 の 値 食 品 成 分 表 では たんぱく 質 が 食 品 中 の 含 窒 素 化 合 物 量 として 定 量 されている( 粗 タンパク 質 )ので 純 粋 なタンパク 質 ( 物 質 名 )と 区 別 するため 平 仮 名 で 表 記 する 表 1 ゆで 卵 のバリエーション( 例 ): 卵 黄 の 凝 固 点 68 卵 白 の 凝 固 点 70 料 理 名 原 理 など かたゆで 卵 タンパク 質 の 加 熱 変 性 ( 加 熱 による 凝 固 ) 半 熟 ゆで 卵 ゆで 時 間 を 短 くすることで 卵 黄 に 熱 が 十 分 伝 わりにくくなる 温 泉 卵 60-80 程 度 の 温 度 で 卵 白 より 卵 黄 を 先 に 凝 固 させる ポーチドエッグ 食 酢 で 水 の ph を 下 げ 直 接 卵 白 を 凝 固 させる 塩 味 のついたゆで 卵 : 飽 和 食 塩 水 にゆでた 卵 を 浸 漬 させることで ゆで 卵 のタンパク 質 によるコロイド 浸 透 圧 により 塩 水 がゆで 卵 内 部 に 入 り 込 む 葉 緑 素 は 光 合 成 に 必 要 不 可 欠 である しかし 酸 や 加 熱 光 に 弱 く 緑 褐 色 になることも 多 い 自 分 で 調 理 する 場 合 は ゆでる 時 に 工 夫 することで 色 鮮 やかに 仕 上 げることができるが 工 業 的 には 安 定 な 銅 クロロ フィル( 銅 クロロフィリンナトリウム)を 用 いる 場 合 も 少 なくない そこで 簡 単 な 有 機 合 成 実 験 として クロロフィ ルの Mg 2+ を 酸 で 抜 いて H + で 置 換 した 後 に Cu 2+ で 置 換 することにより 銅 クロロフィルを 合 成 し 光 熱 酸 に 対 する 安 定 性 を 確 認 する また 合 成 着 色 料 としての 銅 クロロフィルの 色 をもとの 色 と 比 較 する 1
= 牛 乳 からカゼインの 分 離 とタンパク 質 の 定 性 = 1 目 的 タンパク 質 の 性 質 を 利 用 して 牛 乳 (スキムミルク)からカゼインを 分 離 する さらに 得 られた 化 合 物 がカゼ インであることを 証 明 するためにタンパク 質 の 定 性 反 応 とリン 定 性 反 応 を 行 う 身 近 な 生 活 への 応 用 として 牛 乳 からカッテージチーズを 調 製 し 食 生 活 は 最 も 身 近 な 化 学 反 応 の 場 であり 食 品 を 加 工 してよりおいしい 物 を 作 りだすのに 化 学 的 知 識 が 基 礎 となっていることを 紹 介 する 2 原 理 両 性 電 解 質 等 電 点 の 存 在 有 機 溶 媒 に 対 する 溶 解 性 結 晶 化 3 器 具 加 熱 装 置 ph 測 定 用 試 験 紙 (ph メーターでもよい) ろうと ろうと 台 ろ 紙 試 験 管 試 験 管 ばさみ ビ ーカー 光 学 顕 微 鏡 ガーゼ 温 度 計 なべ(ビーカーで 代 用 可 能 ) シャーレ(アルミ 皿 などでも 代 用 可 能 ) わりばし 4 試 薬 4-1) カゼインの 分 離 10% 酢 酸 4% 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 1% 硫 酸 銅 溶 液 メタノール ジエチルエーテル 4-2) タンパク 質 の 定 性 1:ビウレット 反 応 4% 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 1% 硫 酸 銅 溶 液 2:ニンヒドリン 反 応 1%ニンヒドリン 溶 液 ( 溶 媒 :メチルセロソルブ) 4-3) リンの 定 性 30% 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 (ビウレット 反 応 用 の 4%NaH でも 代 用 可 能 ) モリブデン 酸 アンモニウム 溶 液 25g のモリブデン 酸 アンモニウムに 300ml の 水 を 加 えて 溶 解 する これに 22% 硝 酸 溶 液 を 225ml 添 加 する ( 濃 硝 酸 75ml+ 水 150ml) 4-4) カッテージチーズの 調 製 普 通 牛 乳 食 酢 (レモン 汁 ) 市 販 カッテージチーズ( 対 照 ) 必 要 があれば 各 種 牛 乳 (スキムミルク 低 脂 肪 乳 や 特 濃 牛 乳 など) 豆 乳 ( 大 豆 タンパク)や 卵 白 溶 液 ゼラチン 液 など 別 のタンパク 溶 液 ( 食 品 レベルで)を 実 験 材 料 として 加 えても 良 い 2
5 方 法 5-1) スキムミルクからカゼインの 分 離 試 料 秤 量 (スキムミルク:4.0g) + 水 50ml 温 水 150ml 10% 酢 酸 沈 殿 生 成 (ph4.5~4.6) ph 試 験 紙 などで ph を 4.5~4.6 に 合 わせる 遠 心 分 離 (3000 回 転 10 分 ) もしくはガーゼ キムタオル 等 でろ 過 乳 清 :(1%のタンパク 質 と 乳 糖 水 溶 性 ビタミン Ca Na などを 含 む) 沈 殿 物 の 水 洗 浄 A(pH が 酸 性 を 示 さなくなるまで) 沈 殿 物 の 洗 浄 B( 不 純 物 除 去 ) メタノールとジエチルエーテルで 交 互 に 2 回 確 認 試 験 ( 定 性 反 応 ) ビウレット&ニンヒドリン 普 通 牛 乳 を 用 いる 場 合 は 乳 脂 肪 除 去 の 目 的 でメタノールをアセトンに 変 える ( 最 初 にアセトンを 加 えると 量 によっては 有 機 溶 媒 による 変 性 を 起 こすので なお アセトンが 皮 膚 や 爪 に 触 れるとやはり 有 機 溶 媒 による 変 性 を 起 こして 白 くなるので 注 意 ) 定 性 反 応 を 行 う 場 合 に 乳 清 に 関 しても 同 様 の 試 験 を 実 施 する 1%でもタンパク 質 が 残 存 していることが 分 かる 5-2) タンパク 質 の 定 性 5-2-1:ビウレット 反 応 Biuret H 2 N NH NH 2 ジペプチド 以 上 が 必 要 Biuret-Cu NH HN Cu 2+ NH HN CH 3 H 3 C 試 料 採 取 (2ml) 4%NaH(2ml) 1%CuS4( 数 滴 ) 呈 色 紫 ~ 赤 紫 色 比 較 対 照 として グルタミン 酸 ナトリウム(アミノ 酸 )を 一 緒 に 行 う 3
5-2-2) ニンヒドリン 反 応 中 性 ~ 微 酸 性 H NH 2 α アミノ 酸 H + 2 着 色 物 質 + C2 +-CH H 加 熱 N H ( 着 色 物 質 ) 試 料 採 取 (2ml) 乳 清 は 溶 液 カゼインは 採 取 して 懸 濁 溶 液 にする 1%ニンヒドリン 溶 液 ( 数 滴 ) 加 熱 ( 温 水 から 熱 水 中 での 湯 浴 でよい) 呈 色 青 紫 色 5-3) リンの 定 性 反 応 牛 乳 に 含 まれるタンパク 質 の 80% 程 度 を 占 めるカゼインは セリン 残 基 にリン 酸 (リン 酸 カルシウム)を 含 むリンタンパク 質 であるから リンの 定 性 反 応 はカゼインの 定 性 反 応 として 有 用 である 試 験 管 に 試 料 を 採 取 する( 薬 さじ 小 さじ 1 程 度 ) 30%NaH( 約 3ml) 濃 アルカリ 溶 液 中 で 加 熱 してカゼインを 溶 解 する 4%NaH でも 加 熱 時 間 によっては 溶 解 する 一 度 冷 却 する(ガラスが 加 熱 されているので 急 冷 厳 禁 ) 撹 拌 モリブデン 酸 アンモニウム 溶 液 ( 約 1ml) 呈 色 (リンモリブデンブルー) 乳 清 はタンパク 質 含 有 量 が 少 ないので 呈 色 しにくい ガーゼなど 目 の 粗 いものでろ 過 す ると 乳 清 中 にカゼインの 微 細 粒 子 が 浮 遊 した 状 態 になり それが 濃 アルカリによって 溶 解 して 色 が 出 る 場 合 がある カゼインを 多 く 採 取 すると 呈 色 度 は 上 がるが 溶 解 しにくい 場 合 があるので 注 意 4
5-4) 牛 乳 からカッテージチーズの 調 製 チーズには 微 生 物 の 発 酵 により 熟 成 させて 作 るチーズ 酸 性 溶 液 にてタンパク 質 を 凝 固 させて 作 るチーズ がある カッテージチーズは 後 者 に 属 するチーズで クラッカーにのせて 食 べたりサラダやあえ 物 に 用 い たりすることが 多 い 市 販 品 もある < 原 理 > カゼインの 酸 凝 固 が 20 ph4.6 で 起 こる 方 法 牛 乳 の 殺 菌 (80 15 分 : 必 要 に 応 じて 時 間 変 更 可 ) スキムミルクでも 良 い 冷 却 (65 程 度 にする) 食 酢 またはレモン 汁 の 添 加 ph チェック 沈 殿 凝 固 はしやしゃもじで 切 るように 撹 拌 する 沈 殿 物 を カード と 称 する やっている 実 験 はカゼインの 分 離 と 同 じである ざるのうえにさらし(ガーゼ)をおき カードを 取 り 出 して 酸 味 を 除 去 する 目 的 で 軽 く 水 中 でふりあらいして 軽 く 絞 る シャーレ(アルミ 皿 )のうえにおいて 試 食 する 市 販 品 を 試 食 対 照 としても 良 いし カゼインの 実 験 の 時 に 合 わせて 試 料 としても 良 い 試 食 する 場 合 は 使 い 捨 てドンブリや 使 い 捨 てスプーンなど 実 験 器 具 を 使 わないようにしてくだ さい 家 庭 科 と 連 携 できればそれが 一 番 やりやすいと 思 います ( 原 理 は 化 学 で 教 えておいて 実 践 は 家 庭 科 で 実 習 してもらう 化 学 の 先 生 は TA で 入 る ) =クロロフィルの 抽 出 と 銅 クロロフィルの 合 成 = 1 目 的 植 物 からクロロフィルを 抽 出 して 銅 クロロフィルを 合 成 し 銅 クロロフィルともとのクロロフィルの 加 熱 ph 光 ( 日 光 )に 対 する 安 定 性 を 確 認 する 2 試 薬 葉 野 菜 (ホウレンソウなど) エタノール 硫 酸 銅 酢 酸 または 食 酢 炭 酸 水 素 ナトリウムまたは 重 曹 ジエチルエーテルまたは 酢 酸 エチル 5
3 器 具 など 加 熱 装 置 ビーカー 試 験 管 ばさみ or 軍 手 ピンセット or わりばし 試 験 管 駒 込 ピペット はさみ 試 験 管 たて 蒸 発 皿 ドライヤー 4 方 法 3-1 クロロフィルを 抽 出 せずにクロロフィルの 性 質 をみる 1) 柔 らかい 葉 を 準 備 する この 間 に 湯 せんできるよう 沸 騰 水 を 調 製 する 2) そのまま or 大 きくちぎって 試 験 管 に 入 れて 試 薬 を 3ml ずつ 入 れる A) 蒸 留 水 ( 対 照 ) B) 10%CuS4 C) 食 酢 (4% 酢 酸 )もしくは 希 塩 酸 D) 4% 重 曹 もしくは 4%NaH 3) A から D を 湯 せんする (5-10 分 ) ビー 玉 で 軽 くふたをしても 良 い それぞれの 試 験 管 に 入 れた 試 料 を 割 りばしで 取 り 出 して 観 察 する 本 法 は 簡 便 だが B の 色 の 変 化 は 試 料 により 見 にくい 場 合 もあるので 予 備 実 験 が 必 要 である B 液 に 漬 ける 前 に 軽 く 加 熱 しておくと 良 い 場 合 もある 後 述 する 方 法 では 酢 酸 銅 を 用 いたが この 方 法 で 酢 酸 銅 はうまく 使 えない クロロフィルが 細 胞 内 に 存 在 するためと 考 えられる 3-2 クロロフィルの 抽 出 1) 前 日 もしくは 前 の 時 間 に 適 当 な 野 菜 の 葉 を 熱 エタノールに 漬 け そのまま 遮 光 しながら 放 冷 する ク ロロフィルが 抜 けて 白 い 葉 っぱができる 溶 液 は 適 宜 濃 縮 する エタノールは 70 前 後 に 加 熱 (IH ヒーター ハロゲンヒーター アルミブロックなどで 加 熱 する 湯 せんも 良 いが 炎 を 消 して 湯 せんすること)する 湯 せんの 場 合 は トールビーカーやコニカルビーカーに 葉 っぱを 入 れ シャーレなどで 軽 く 蓋 を し 冷 めるまで 湯 せんする 共 栓 付 きの 器 具 は 2) エタノール 溶 液 に 水 を 1/3~ 同 量 添 加 し 2 本 の 試 験 管 に 分 けて 入 れる 3) 少 量 の 希 塩 酸 を 加 えて 温 め クロロフィルをオリーブ 色 にする ( 片 方 のみ:うまくいかない 場 合 は 10N 程 度 の 塩 酸 を 一 滴 垂 らしてもよいが 後 で 洗 浄 して 抜 く 時 に 回 数 を 要 する ) 4) 変 化 させた 方 にジエチルエーテルを 適 量 加 え タッチミキサーにかけて 分 配 する ジエチルエーテル 層 にも 塩 酸 が 含 まれているため 2 回 水 洗 浄 する 上 層 がジエチルエーテル 層 なのでシェイクした 後 に 駒 込 ピペットで 上 層 部 を 採 取 する 程 度 で 良 い ph 試 験 紙 で 水 層 を チェックしても 良 い 火 気 厳 禁 必 ず 火 気 と 換 気 を 確 認 すること 5) ジエチルエーテル 層 を 蒸 発 皿 に 集 めて 軽 くドライヤーをかけながら 濃 縮 する ジエチルエーテルの 蒸 気 に 注 意 すること ドラフト 内 で 行 うか 換 気 の 良 いところで 行 う ジエチ ルエーテルは 沸 点 が 低 く 極 性 が 高 く 水 と 二 層 に 分 かれるので 使 いやすいが 酢 酸 エチルな どでも 良 い 火 気 厳 禁 必 ず 火 気 と 換 気 を 確 認 すること 6
6) エタノールを 蒸 発 皿 に 加 えて 溶 解 し 試 験 管 に 2 等 分 した 後 1/3~ 同 量 の 蒸 留 水 を 加 える この 試 験 管 の 片 方 に 酢 酸 銅 を 微 量 ( 薬 さじの 小 さい 方 で 1/4~1/5 程 度 ) 加 えて 加 熱 する 銅 クロロフィルの 完 成 対 照 として 酢 酸 銅 のみの 試 験 管 を 作 る この 合 成 法 では クロロフィルが 抽 出 されているので 硫 酸 銅 より 酢 酸 銅 の 方 がきれいな 色 になる 野 菜 試 料 によって 発 色 は 異 なる 一 週 間 日 光 に 暴 露 しても 褪 色 しない 参 考 :クロロフィルの 抽 出 < 別 法 > 当 日 や 前 日 などに 手 早 く 抽 出 できる 試 薬 :ジエチルエーテル エタノール 無 水 硫 酸 マグネシウム 海 砂 試 料 野 菜 ジエチルエーテルは 古 くないものを 使 ってください 器 具 : 分 液 ろうと 包 丁 or はさみ まな 板 (なくても K) 駒 込 ピペット スポイト 栓 試 料 ビン 乳 鉢 乳 棒 薬 さじ = 方 法 = 1) 野 菜 を 切 り 刻 んで ジエチルエーテル 混 合 溶 媒 (ジエチルエーテル:エタノール=1:1 v/v)ととも に 乳 鉢 に 入 れる 必 要 に 応 じて 海 砂 を 少 量 入 れる ジエチルエーテルが 蒸 発 しやすいので 手 早 く やること 溶 媒 が 足 りなくなってきたら 適 宜 追 加 して 濃 い 溶 液 をつくる 火 気 厳 禁 必 ず 火 気 と 換 気 を 確 認 すること 適 宜 保 護 メガネや 保 護 手 袋 をし ドラフト 中 で 行 ってください 2) 磨 砕 後 駒 込 ピペットで 分 液 ろうとに 移 し 入 れる これに 蒸 留 水 を 注 いで 軽 く 振 り 有 機 溶 媒 層 を 洗 浄 する 水 層 が 透 明 になるまで 洗 浄 する 火 気 厳 禁 必 ず 火 気 と 換 気 を 確 認 すること 3) 上 から 有 機 溶 媒 層 をとり 必 要 があれば 濃 縮 して 試 料 ビンに 移 す 無 水 硫 酸 マグネシウムを 試 料 ビ ンに 入 れて 乾 燥 させる ( 密 栓 して 冷 凍 保 存 可 能 ) = 主 な 参 考 文 献 = 水 谷 令 子 藤 田 修 三 編 食 品 学 実 験 書 医 歯 薬 出 版 (1995) 橋 本 俊 二 郎 編 食 品 学 実 験 講 談 社 (2010) 7