Brilliant III Ultra-Fast QPCR & QRT-PCR Master Mix Series 技術資料 : どんなコンセプトで開発された試薬か? 本試薬キットの開発から完成までの流れを解説 リアルタイム PCR 法は遺伝子発現解析の方法としてスタンダードになってきました さらにウイルスや病因遺伝子の検出 メチレーション検出 ジェノタイピングなど様々なアプリケーションでも利用されています QPCR がポピュラーになるにしたがって アッセイのさらなるハイスループット化が求められています その要望に対応するためには 1プレート当たりの反応件数 (well 数 ) を増やすこと 反応時間の短縮化 この 2 点が挙げられると思います ここ数年 反応時間を短縮するために高速サイクリングに対応した試薬 プロトコール そして機器のシステムが開発されてきました これらの中には従来のプロトコールと比べ 50% 以上の高速化を実現したものもありましたが その中には無理に時間短縮をすることによって感度や再現性の低下が認められてしまうケースもあります これらの問題を解決するためにアジレント社では 得意なランダム変異導入法と CSR (Compartmentalized Self Replication) 法 (Ghadessy, F.J. et al., Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. PNAS, 2001, 98(8): 4552-7.) という最新の技術を用い 高速性能 というコンセプトによってスクリーニングを繰り返すことで 野生型 Taq DNA polymerase に7ヶ所の変異を導入した Taq ミュータント (Taq42 heptamutant) を開発するに至りました この新しくアジレントが開発した Taq ミュータントはヌクレオチドの取り込み率が2 倍であることに加えて NaCl や全血にある PCR 抑制因子に対する強い耐性を示すことも明らかになりました さらに独自に開発したケミカルホットスタートテクノロジーを採用することで Taq ミュータントを短時間で活性化することに成功しただけでなく 高感度化をも実現しました ここにその開発の経緯と性能試験の詳細をご紹介いたします
Part 1: 超高速性能を持つ Taq DNA polymerase のミュータントはどのように作られたのか? Part 2: Taq ミュータントの超高速サイクリング条件でのテスト 野生型 Taq と比較してみました CSR 法では 1 滴のオイル / サーファクタントのエマルジョン中の微細な水性コンパートメント中に大腸菌や PCR の材料がトラップされ その 1 滴の中で大腸菌によるリコンビナント酵素産生や PCR 反応が行なわれます Taq polymerase 遺伝子にランダム変異を導入したライブラリーを作成すると 個々の大腸菌は変異型の Taq polymerase を産生します 続いて行なわれる PCR 反応では変異型 Taq polymerae が自分自身をコードする遺伝子を増幅するようにデザインされています 高速サイクリング PCR という選択圧をかけてスクリーニングを行なうことで もしある変異型 Taq Polymerase が高速サイクリング条件化で活性をもてばその変異型遺伝子が増幅されますが 活性を持たない変異型 Polyemrase からは遺伝子が増幅されないということになります このサイクルを繰り返せば 高速サイクリング条件化で高い活性を持つ Taq Polymerase 遺伝子が濃縮されてくるはずです 10ng のヒトゲノム DNA 中のアルドラーゼ遺伝子 (286 bp) を 20ng の野生型 Taq および Taq ミュータント (4クローン) を用いて増幅実験を行ってみました PCR は Bio-Rad CFX96 を用い 1x 3min@95 C, 40x 10sec95 C/1sec@60 C の超高速サイクリングパラメーターで実施したところ 野生型の Taq では 14 サイクル以上の Cq 値の遅延が認められました スタンダードなサイクリングパラメーター (1x 3min@95 C, 40x 10sec95 C/60sec@60 C) では 野生型 Taq を含む全てでほぼ同等の Cq 値が得られました 今回 きわめて高速サイクリングの条件下での CSR 法を 5 回繰り返すことで 高速サイクリングでの増幅性能を持つミュータントを見つけることに成功しました さらにスクリーニングを重ねて有望なミューテーションをいくつか選択し それらを組み合わせた複数部位変異導入クローンライブラリを作成することで 最も高速な増幅性能を備えた Taq Polymerase ミュータントを得ることに成功しました Taq ミュータントには 確かに超高速サイクリングパラメーターでの増幅性能が備わっていることがわかります
Part 3: 高速性能のはどのようにして成立しているのか Taq42 ミュータントで調べてみました ( 生化学的性質の検討 ) 次に Taq42 ミュータントの生化学的性質を調べてみました M13 エクステンションアッセイ (Innis, M.A. et al., DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. PNAS, 1988, 85:9436-9440.) を用いて 60 および 70 でのヌクレオチドの取り込み率を野生型 Taq DNA polymerase と比較したところ Taq42 ミュータント は野生型 Taq に対して 1.6 倍の取り込み率があることがわかりました さらに Taq42 ミュータントは野生型 Taq に対する Steady-State kinetic パラメーターは 2.2 倍も高い触媒率定数 (catalytic rate constant (Kcat)) を示しました これらの結果は Taq42 が野生型 Taq に対してヌクレオチド非存在下では 28.5 倍も高いテンプレート-プライマー間の親和性 (Kd) を示すことになります しかし Taq42 ミュータントは dntps 存在下でのテンプレート-プライマー間の親和性 (Km) は野生型 Taq と同等の結果を示しています プロセッシビリティと 95 での半減期 (DNA 存在下 非存在下 ) の結果は下表に示します Part 4: Taq ミュータントには PCR インヒビターに対する耐性があった! a) 全血サンプルに対する耐性 20ng のヒトゲノム DNA もしくは全血をサンプルとして 20ng の野生型 Taq およびミュータント Taq で増幅実験を行いました ( ターゲット遺伝子は IGF (322bp)) サイクリングパラメーターは 1x 5min@95 C, 40x (20sec@95 C, 20sec@60 C, 60sec@72 C), followed by 1x 5min@72 C ライフテクノロジーズ社 9700 システムを利用しています Taq42 Taq2C2 Taq3B の3つのミュータント Taq は 10% の全血存在下での増幅が確認できましたが 野生型 Taq では 2% 以下の全血存在下ですら増幅が抑制されてしまいました
b) NaCl に対する耐性種々の濃度の NaCl 存在下で 10ng の野生型 Taq およびミュータント Taq で 10e5 コピーのプラスミド DNA の増幅を試みました ターゲット遺伝子は 165bp の GAPDH 遺伝子 サイクリングパラメーターはアジレント社 Mx3005P システムで 1x 5min@95 C, 40x (20sec@95 C, 20sec@60 C, 60sec@72 C) で実施しました 野生型 Taq と比べて Taq5A2 Taq42 Taq2C2 Taq3B のミュータント Taq4 種類では 高濃度の NaCl 濃度存在下での増幅が確認されました 性が高い新しいケミカル修飾法の開発に取り組み Taq42 をリバーシブルに不活化させ 加温することにより速やかに酵素を活性化させることが可能なケミカルホットスタート仕様の新しいマスターミックスを開発することに成功しました 下図に示すように アジレント社が新たに開発したケミカル修飾では 酵素を 5min@95 C 加熱することにより 100% のポリメラーゼ活性であることが示されています 3min@95 C の加熱ではホットスタート Taq42 は 90% の活性を示しています その後 60min@95 C の加熱により Taq42 の活性は半減し これは野生型 Taq DNA polymerase の公表されている半減期と一致していました 例えば 37.5mM NaCl 存在下では野生型 Taq は 17Cq 以上の抑制が認められたのに対して ミュータント Taq では Cq 値の抑制は 2.5 サイクル以下という結果でした このように Taq ミュータントには高速性能だけでなく PCR インヒビターに対する耐性も備わっていることがわかりました Part 5: 超高速化 そして高性能化をめざした挑戦! Faster-activating chemical hot start の開発一般的な高速サイクリング仕様の qpcr 試薬では 試薬調製時にポリメラーゼ活性を不活化させるために抗 Taq 抗体が用いられています マスターミックスをホットスタート仕様にするために抗 Taq 抗体を用いることは 酵素の活性化までの時間が短いため確かに高速化に繋がるかもしれませんが ケミカルホットスタート仕様に比べ アッセイの特異性に影響を与えてしまうことがあります (part 7 参照 ) アジレント社では 高い性能をキープした超高速化 qpcr 試薬を作るために 熱や ph の変化による感受 Part 6: ホントに速いのか?! Brilliant III の超高速性能テスト新製品の超高速サイクリング仕様の Brilliant III Ultra-Fast qpcr master mix の開発に際しては 高速性能を持つ Taq42 ミュータントの開発と高速活性化能を有するケミカルホットスタート法の開発という 2つのキーコンポーネントが存在していましたが 前述の検討により Faster-activating chemical hot start 仕様の Taq42 ミュータントが新製品の Brilliant III Ultra-Fast qpcr master mix シリーズで採用されることが決定されました いよいよ新製品 Brilliant III Ultra-Fast qpcr master mix というパッケージでの検証です 次に示すのはプラスミド DNA の2 倍希釈系列 (3 コピーから 1536 コピー ) を用い B7 遺伝子 (148bp)
を増幅させてみた結果です 用いた試薬は新開発の Brilliant III Ultra-Fast SYBR qpcr マスターミックスとスタンダードタイプの Brilliant II SYBR マスターミックスの2 種類で 定量システムはライフテクノロジーズ社の StepOnePlus を利用しました Brilliant III SYBR マスターミックスでは スタンダードサイクリングの Brilliant II に対して~60% の高速化が示されています ( 図 A および図 B) また 超高速サイクリングで行われた Brilliant III SYBR マスターミックスでのスタンダード曲線解析の結果 ( 増幅効率 :98.1% RSq:0.994) は スタンダードなサイクリングで行われた Brilliant II SYBR マスター ミックスの結果 ( 増幅効率 :95.4% RSq: 0.997) と比べてほぼ同等の性能を示しています Cq 値についてもほぼ同等の結果 (±1Cq) を示しました 下図 C および D では cdna サンプルの 10x 希釈系列 (0.05pg から 500ng) について GAPDH (151bp) を増幅させて同様の比較検討した結果を示します Brilliant III SYBR マスターミックスの結果 ( 増幅効率 :91% RSq:0.998) は Brilliant II SYBR マスターミックスの結果 ( 増幅効率 :93.8% RSq:0.996) と Cq 値についても ±1Cq とほぼ同等の性能を示しました A B C D
Part 7: Brilliant III Ultra-Fast マスターミックスのプライマーダイマーや非特異的増幅の検討 Faster-activating chemical hot start の成果次にプラットフォームを Bio-Rad 社の CFX96 また他社試薬キットとの比較実験をしてみました ヒトゲノム DNA の 10 倍希釈系列 (5pg から 50ng) について Numb 遺伝子 (305bp) を増幅させた結果を示します 新開発の Brilliant III SYBR マスター ミックスを抗体ホットスタート仕様の B 社試薬と比較してみると 融解曲線解析では B 社試薬で低濃度領域にプライマーダイマーが多く認められ したがって standard curve 解析から得られた増幅効率は 110.8% とプライマーダイマーの影響を受けていることが推察されました (Brilliant III では 92.2%) 増幅曲線解析では B 社試薬では Brilliant III SYBR マスターミックスに比べて4Cq 値以上の遅延が認められました 次に 融解曲線解析でプライマーダイマーが認められたサンプルについてバイオアナライザーで PCR 産物のサイズを調べてみました 右にゲルイメージを示します B 社試薬では 目的の PCR 産物ではない低分子の PCR 産物 (=プライマーダイマー) が生成されていることが分かります
さらに確認のため 抗体ホットスタート仕様の T 社 SYBR premix 試薬を用いて比較検討を行いました サンプルはヒトゲノム DNA の 10 倍希釈系列で Numb-1 遺伝子 (305bp) の増幅をライフテクノロジーズ社 StepOnePlus で行った結果です 増幅曲線解析では Cq 値に大きな差がないことは前述の結果とほぼ同様でしたが プライマーダイマーの有無に大きな差が認められました T 社試薬では プライマ ーダイマーが低濃度領域の再現性や増幅効率に影響していることがわかります プライマーダイマーについては プライマー配列に依存するところが大きいので 一概に述べることは困難ですが ここに示す比較結果は他社のマスターミックスキットに比べて Brilliant III にプライマーダイマーの生成や非特異的増幅が少ないだろうことを示唆しています Brilliant III T 社 SYBR premix R 2 = 0.996 Eff: 90% R 2 : 0.979; Eff: 95%
Part 8: Brilliant III qpcr master mix の Agilent Mx3000P/Mx3005P での性能試験 Agilent Mx3000P/Mx3005P QPCR システムは 残念ながらサーマルシステムが超高速サイクリングに対応していませんが Mx3000P/Mx3005P システムでも Faster-activating chemical hot start の成果が得られるか 試してみました Agilent 社のラボでマイクロアレイによる遺伝子発現解析の確認作業に用いている SLC 遺伝子と POLR 遺伝子について Brilliant III および Brilliant II で比較検 討した結果を示します テンプレートは PCR 産物の希釈系列を用い サイクリングパラメーターは 1x 3min@95 40x (5sec@95, 20sec@60 ) + dissociation curve analysis いずれもプライマーダイマーは認められなかったのでプライマーダイマーの生成については比較できませんでしたが いずれの定量結果でも Brilliant III のダイナミックレンジは1オーダー広く 高い増幅効率が示されました Brilliant II に比べて 特に低濃度領域で高い増幅性能が示されたことになります SLC 遺伝子 POLR 遺伝子