研究用 Enforcement Cloning System pkf3 ( 製品コード 6086) E. coli TH2 Competent Cells ( 製品コード 9056) 説明書 v201610da
Enforcement Cloning System pkf3 は Hashimoto-Gotoh, T. らの enforcement cloning 法をシステム化したもので 特殊なベクターと大腸菌宿主を用いることで外来遺伝子の挿入されたクローンのみが生育してくるという非常に簡便なクローニングシステムです これにより従来のような煩雑な組換え体の選別が不要で 遺伝子ライブラリーの作製 PCR 産物のサブクローニング等の用途に威力を発揮します I.Enforcement Cloning System の原理 (A) rpsl + 遺伝子は タンパク質の生合成を行うリボゾーム粒子を構成するタンパク質の rpsl - 1 つである S12 をコードする遺伝子です ストレプトマイシン (Sm) はこのタンパク 質に結合し タンパク質合成の複合体形成 E. coli Host genome 反応を阻害し 生育阻害を引き起こすこと が知られています このrpsL 遺伝子に変 異を持つ大腸菌 (rpsl - ) は Sm 耐性を示し ます (A) Sm 耐性 しかし これらのrpsL 遺伝子の変異は野 生型遺伝子に対して劣性で Sm 耐性宿主 (B) (rpsl - ) であっても rpsl + 遺伝子を持ったプラスミドベクターなどにより形質転換し rpsl - rpsl + 正常な S12 リボゾームタンパク質を発現さ + せることにより Sm 感受性となります (B) また プラスミドベクターのrpsL 遺伝子中に外来遺伝子を挿入し Sm 耐性宿主 Transform Plasmid Vector (rpsl - ) を形質転換すると プラスミドベ クターのrpsL 遺伝子からは正常な S12 リボゾームタンパク質が発現しなくなるため 形質転換体は Sm 耐性となります (C) このことを利用し クローンのスクリーニングが不要となったクローニングシステムが Enforcement Cloning System pkf3 です rpsl - rpsl + つまり rpsl 遺伝子とクロラムフェニコー Sm 感受性 ル (Cm) 耐性を持つプラスミドベクター (C) pkf3 の rpsl 遺伝子中のマルチクローニン rpsl + グサイトに外来遺伝子を挿入し rpsl - 宿主 (Sm 耐性 ) である E. coli TH2 Competent Cells を用いて形質転換を行い Cm と Sm + 挿入したい外来遺伝子 を含むプレートに生育してくるコロニーを 選択するだけで容易に外来遺伝子が挿入さ れたクローンを得ることができます rpsl - + Transform Plasmid Vector rpsl - Sm 耐性 タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 2
II. 内容 Enforcement Cloning System pkf3 はプラスミドベクター pkf3 DNA と E. coli TH2 Competent Cells より構成されています Enforcement Cloning System pkf3(10 回用 )( 製品コード 6086) pkf3 DNA(0.5 μg/μl) 20 μl E. coli TH2 Competent Cells 100 μl 10 pbr322 DNA(0.1 ng/μl) 10 μl SOC Medium * 1 ml 10 E. coli TH2 Competent Cells( 製品コード 9056) E. coli TH2 Competent Cells 100 μl 10 pbr322 DNA(0.1 ng/μl) 10 μl SOC Medium * 1 ml 10 * SOC Medium の組成 : 2% Tryptone 0.5% Yeast extract 10 mm NaCl 2.5 mm KCl 10 mm MgSO4 10 mm MgCl2 20 mm Glucose III. 保存 pkf3 DNA :- 20 E. coli TH2 Competent Cells :- 80 IV. 製品説明 < pkf3 DNA > pkf3 DNA は phsg399 由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子とtrp プロモーター / オペレーターの下流に合成 rpsl 遺伝子を結合させた遺伝子をもつ enforcement cloning 用に構築されたプラスミドベクターです 合成 rpsl 遺伝子上にはアンバー変異と 39 種類の制限酵素切断部位をもつマルチクローニングサイトが設計されており より多くの制限酵素に対応することができます また マルチクローニングサイトが長いため 7 種類のシーケンスプライマーが設計されています タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 3
Nco I-EcoT14 I-(Dsa I) (Spe I) PshB I (Spe I) Hpa I Pvu II Sac I-Ban II Nsp V Bal I-(Eae I) ApaL I 1.5 Xho I-(Ava I) Hgl E II 2.0 amber Sph I ori Nde I Mlu I Bst1107 I-(Acc I) EcoR I 0/2246 POtrp Aor51H I Fsp I pkf3 2,246 bp Spl I Hind III rpsl + 4am BstP I-EcoO 65 I Nhe I BspM I 0.5 Sca I Ssp I Sse8387 I-Pst I Fba I Not I-Eco52 I-(Eae I) Bgl II Sma I-(Ava I) BamH I Kpn I Sac II-(Dsa I) Xba I Acc III Ava II Sal I-(Acc I) Cla I Pvu I Stu I 1.0 cat-5 図 1. pkf3 のクローニングサイト *:Fba I, Cla I は dam methylase の影響を受ける タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 4
pkf3 Primer F1 PshB I (Spe I) Hpa I (Spe I) (Dsa I) EcoT14 I Nco I Pvu II Nsp V Ban II Sac I pkf3 Primer F2 (Eae I) Bal I (Ava I) Xho I Sph I Nde I Mlu I (Acc I) Bst1107 I Fsp I EcoR I Aor51H I Hind III Spl I BstP I EcoO65 I pkf3 Primer R4 Sse8387 I Pst I BspM I pkf3 Primer F3 Fba I (Eae I) Not I Eco52 I Bgl II (Ava I) Sma I BamH I pkf3 Primer R3 (Dsa I) Kpn I Sac II Xba I Acc III Ava II (Acc I) Sal I Cla I Pvu I pkf3 Primer R2 Stu I Nhe I pkf3 Primer R1 ( ) 内の酵素は pkf3 DNA を複数カ所切断する * 印の酵素は dam methylase の影響を受けるため dam + の DNA は切断されない pkf3 DNA( 製品コード 3100) は dam によりメチル化されている pkf3 Sequencing Primers: pkf3 Primer F1 * 5' - GTGAG CGAGG AAGCG GAAGA A - 3' pkf3 Primer F2 * 5' - TAAAG TGGCC AAATC TAACG - 3' pkf3 Primer F3 * 5' - TGCAG GAACA CTCTG TTATC - 3' pkf3 Primer R1 * 5' - GATAA TAAGC GGATG AATGG CAGA - 3' pkf3 Primer R2 * 5' - GGACG TTTTA CACCG TATTT C - 3'l pkf3 Primer R3 * 5' - CAGGT TGTGT CCTTC ACCAC CTAT - 3' pkf3 Primer R4 * 5' - TTCGG TTTCT TCGGA GTAGT AGTG - 3' *: カスタム合成注文にて承ります 詳細に関しては 受託窓口までお問い合わせください (TEL: 077-565-6999) タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 5
< E. coli TH2 Competent Cells > TH2 株は遺伝子組み換えの当初より汎用され 遺伝的形質も安定した HB101 株由来で HB101 の trp リプレッサータンパク質をコードする遺伝子 trpr に変異 (trpr624) を持った株です rpsl20 supe44 trpr624 であり pkf3 を用いた enforcement cloning に適した host strain です Genotype supe44, hsds20(r B - m B - ), reca13, ara-14, proa2, lacy1, galk2, rpsl20, xyl-5, mtl-1, thi-1, trpr624 形質転換効率 1 ng の pbr322 DNA を用いて形質転換した場合 10 7 transformants/1 μg DNA 以上の効率が得られました V. 使用方法 (1) pkf3 DNA 約 1 μg を制限酵素で切断し フェノール クロロホルム抽出 エタノール沈殿を行い pkf3 DNA 制限酵素断片を回収する (2) pkf3 DNA 制限酵素断片 (35 fmol 約 50 ng) にインサート DNA(35 350 fmol) を加えた DNA 溶液を調製し DNA Ligation Kit Ver.1 Ver.2.1( 製品コード 6021/6022) あるいは DNA Ligation Kit <Mighty Mix>( 製品コード 6023) のプロトコールに従い 16 30 分間反応させる (3) 反応液の一部 (20 μl 以下かつ 10 ng 以下 ) を使用直前に氷中で融解した E. coli TH2 Competent Cells 100 μl と 14 ml 丸底チューブ ( ファルコン ラウンドチューブ等 ) 中で穏やかに混和する (4) 氷中 30 分間放置する (5) 42 で 45 秒間インキュベートする (6) 氷中 1 2 分間放置する (7) あらかじめ 37 に保存しておいた SOC Medium を最終 1 ml になるよう加える (8) 37 で 1 時間振とうする (160 225 rpm) (9) L-broth プレート ( クロラムフェニコール 12 μg/ml ストレプトマイシン 50 μg/ml を含む ) に適当量 * をまく (10) 37 で一晩放置する *: 直径 9 cm のプレートの場合 100 μl 以下にしてください タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 6
製品に関する注意 1. コンピテントセルの運搬は ドライアイス / エタノールに入れて行ってください 2. 14 ml 丸底チューブ (BD 社 Code. 352059 または 352057 等 ) の他 1.5 ml マイクロ遠心チューブを用いても形質転換は可能ですが 効率が若干悪くなることがあります 3. 100 μl のコンピテントセルを用いる場合 形質転換に使用する DNA の量を 高純度なもので 10 ng 以下にしないと 効率は悪くなります 4. スケール ( コンピテントセルの量など ) を変えたり 他のチューブを用いて形質転換を行うときは 最適の条件を検討する必要があります ( 例えば エッペンドルフチューブを用いるときは 42 で 60 秒間インキュベートしてください ) 5. 回復培養は SOC Medium の他 L - broth φ b - broth でも構いませんが 若干効率が悪くなることがあります < L - broth > 10 g Bacto tryptone 5 g Bacto yeast extract 5 g NaCl/1 L water を 1 N NaOH で ph7.5 前後に調整し オートクレーブする <φ b - broth > 5 g Bacto yeast extract 20 g Bacto tryptone 5 g MgSO4 7H 2O/1 L water を 1 N KOH で ph7.5 前後に調整し オートクレーブする 6. 希釈の必要なときは V. 使用方法 -(7) で加えた培地で希釈してください 7. 一度融解したコンピテントセルを再度凍結保存することはお勧めしません やむを得ず必要な場合は ドライアイス / エタノール中で凍結させ - 80 で保存してください ただし 形質転換効率は 1 オーダー以上低下する可能性があります 8. pkf3 plasmid を増やす際に配列の欠失や挿入変異が起こる場合があることが確認されていますので できるだけ購入された pkf3 plasmid をそのままご使用ください どうしても増やす必要のある場合は クロラムフェニコールで選択をかけ Sup free 株 ( 例 :MV1184 など ) で増やすことは可能です VI. 使用上の注意 Enforcement Cloning System において注意すべき点は exonuclease の混入です 特に pkf3 の切断に使用する制限酵素の純度が非常に重要になってきます つまり 制限酵素に exonuclease が混入していると pkf3 の制限酵素切断末端より exonuclease による消化が起こり rpsl 遺伝子に deletion が生じて正常な S12 リボソームタンパク質が発現しなくなり インサートが挿入されていなくても Sm 耐性としてコロニーを形成するため バックグラウンドとして insertion 効率低下の原因となります タカラバイオの制限酵素は この pkf3 を用いた Enforcement Cloning System を利用した exonuclease の検出を QC に取り入れていますので 高い純度を保証しており 安心してお使いいただけます VII. 参考文献 1)Toba-Minowa, M., and Hashimoto-Gotoh, T. Gene. (1992) 121: 25-33. 2)Hashimoto-Gotoh, T., et al. Gene. (1993) 137: 211-216. タカラバイオ ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 7
VIII. 関連商品 pkf3 DNA( 製品コード 3100) IX. 注意 本製品は研究用試薬です ヒト 動物への医療 臨床診断には使用しないようご注意ください また 食品 化粧品 家庭用品等として使用しないでください タカラバイオの承認を得ずに製品の再販 譲渡 再販 譲渡のための改変 商用製品の製造に使用することは禁止されています ライセンスに関する情報は弊社ウェブカタログをご覧ください 本説明書に記載されている会社名および商品名などは 各社の商号 または登録済みもしくは未登録の商標であり これらは各所有者に帰属します v201610da