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2009 1 Nature, Science, Am. J. Human Genet. 1 120 mer 2 DNA crna 120 mer crna DNA crna DNA 1 Publication Compendium p/n5990-7233en 2Nat Biotechnol. 2009 Feb;272:182-9. Epub2009 Feb 1. 120 mer 20 bp Deletion SNP InDel 57,000 120 mer crna DNA 1 5 crna DNA-DNA DNA-RNA PCR QC DNA 120 mer crna 1 2
2011 10 1. HiSeq2000, HiSeq1000, GAIIx, GAII SOLiD4, SOLiD3 plus, SOLiD3 SOLiD5500, SOLiD5500xl 454GS FLX Titanium, GS Junior PE 1, Multiplexindex fragment, PE, Barcodeindex Barcodeindex Long Single Read 1 SE 2IonTorrent, PacBio, MiSeq 2. DNA RNA 3. DNA gdna DNA RNA RNA Non-coding DNA RNA DNA RNA 1 4. Index 1 Index Index 5. XT gdna DNA Index Herculase II, AMPureXP 3
DNA DNA Non-Index Index XT Index Human All Exon V4 (51 Mb) Agilent 51 Mb Coding Human All Exon V4+UTRs (71 Mb) V4 UTR Human All Exon 50 Mb Sanger ICGC 50 Mb V4 Human All Exon v2 Broad Human All Exon v1 2009 9 CCDS Exons RefSeq V4 Human Kinome DNA 612 Kinase UTR Human Chr-X exon X X Mouse All Exon UCSC mm9 Reference Ensemble RefSeq Human All Exon V4+UTRs Human All Exon V4 Human All Exon 50 Mb Human All Exon v2 Mouse All Exon XT NEW NEW G7544 A-L G7542 A-L G7550 A-L G3370 A-L G3353 A-L G7500 A-L Developped with Agilent Agilent Sanger Broad RIKEN Number of genes covered 21,058 20.965 20,766 20,078 24,306 Number of exons 335,765 334,378 213,383 213,383 221,784 CCDS March 2011 March 2011 Nov 2010 Nov 2010 RefSeq March 2011 March 2011 Nov 2010 Nov 2010 GENCODE v6 v6 v4 v4 mirna v17 v17 v14 v14 Total 71 Mb 51 Mb 50 Mb 46 Mb 49.6 Mb 4
DNA, RNA DNA Human All Exon V4 V4+UTRs 50 Mb Human All Exon v2 Human All Exon v1 Human Kinome DNA 6.8 Mb Non-Index Index HumanAll Exon V4 NEW HumanAll Exon V4+UTRs NEW HumanAll Exon 50 Mb G7545A-L HumanAll Exon v2 G7543A-L HumanAll Exon v1 G3363A-L Human Kinome DNA G7563A-L XT Index RNA RNA-Seq Read Depth RNA RNA Read Depth 10~100 gdna SNP InDel Fusion Gene RNA Enriched Library Unenriched Library Target Enriched transcripts Non-Target Unenriched transcripts Non-Index Index XT Index Human Kinome RNA DNA Capture Human Kinome 612 Kinase DNA RNA gdna 5
earray 1 WEB earray 15 34 Mb 1 earray http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=29443 earray earray GeneSymbol GenBank ID Enrich DNA Target interval Bait Bait Group1 Library Bait Group2 ELIDEnrichment Library ID DNA RNA DNA DNA 34 Mb DNA Bait RNA 6.8 Mb 6
DNA 34 Mb 15 15 DNA ELID Non-Index DNA Capture MP1 <200 kb 1 DNA Capture MP2 200 kb - 499 kb 1 DNA Capture MP3 500 kb - 1.49 Mb 1 DNA Capture MP4 1.5 Mb - 2.99 Mb 1 DNA Capture MP0 3.0 Mb- 6.8 Mb 1 Index DNA Capture 2ELID Blend 13.6 Mb 2 DNA Capture 3ELID Blend 20.4 Mb 3 DNA Capture 4ELID Blend 27.2 Mb 4 DNA Capture 5ELID Blend 34.0 Mb 5 RNA XT Index 77 65 77 RNA ELID RNA Capture MP1 <200 kb 1 RNA Capture MP2 200 kb - 499 kb 1 RNA Capture MP3 500 kb - 1.49 Mb 1 RNA Capture MP4 1.5 Mb - 2.99 Mb 1 RNA Capture MP0 3.0 Mb- 6.8 Mb 1 Non-Index Index XT Index 7
実験プロトコル わかりやすい実験プロトコル DNA 断片化からアダプタ付きライブラリ調製 によるハイブリダイゼーション キャプチャされた DNA の 回収 増幅 精製までの全ステップが わかりやすい日本語プロトコルで提供されています 詳細は http://agilentgenomics.jp にアクセスしてください 断片化 ライブラリ調製およびキャプチャ後のステップに バイオアナライザと定量 PCR による QC ステップが入り 安心して実験を進めることができます 実験プロトコル QC ステップ バイオアナライザ DNA1000 キット 断片化DNAの サイズ確認 gdnaもしくは mrnaを目的 サイズに断片化 xt キット またはNGSキット バイオアナライザ DNA1000 キット アダプタ付きDNA ライブラリのサイズ 確認と定量 アダプタ付き DNA断片 ビオチン化 crna ベイトライブラリ 溶液中で24時間 ハイブリダイゼーション ストレプトアビジン 磁性ビーズ バイオアナライザ バイオアナライザ 高感度DNAキット キャプチャされたDNA のサイズ確認と定量 キャプチャされたDNA だけを回収 濃縮 サイズ確認と定量後 シーケンシングへ 8 リアルタイム定量PCR QPCR NGS ライブラリ定量キット DNAライブラリの ハイスループット定量
抜きん出たキャプチャ性能 SNP, InDel を高精度 高感度に検出 右図は Human All Exon シリーズの性能 比較データです V4 および V4+UTRs のキットでは ベイトデザインアルゴリズムの改良により キャプ チャの基本性能が大幅に向上しており より少な いシーケンス量で これまでと同等のカバレッジ を得ることが可能です のキャプチャベイトは 120 mer の長 さの高品質ビオチン化 crna を使用しています DNA ではなく 長い RNA オリゴを使用している ため ターゲットの gdna に 20 bp 近くの Deletion が存在しても 良好なアレルバランスでキャプチャ することができます PNAS に報告された乳がん サンプル中の BRCA 遺伝子のさまざまな変異の検 出例を下図に示します SNP や InDel があっても 高いキャプチャ性能を示す は 次世代 シーケンサによる多数の臨床検体の変異解析に威 力を発揮します Excellent allelic balance Delection up to 19dp Allele 2 10bp deletetion Allele 1 "#$#%&'! 0.5 Allelic Balance post-capture 0.5 Reference: Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jul 13;107 28 :12629-33. 最新のデータ 英文プロトコル 論文や Webcast は 下記のアジレント社英語 WEB サイトにてご覧いただくことができます http://www.genomics.agilent.com 9
PCR QC DNA RNA DNA-Seq, RNA-Seq, ChIP-Seq QC DNA DNA1000 dsdna 25-1000 bp, 0.1-50 ng/µl High Sensitivity DNA dsdna 50-7000 bp, 5-500 pg/µl RNA6000 5-500 ng/µl RNA6000 250-5000 pg/µl QPCR NGS Mutant Taq Brilliant III Ultra-Fast NGS DNA Standard Primer 1 84 PCR G4880AQPCR NGS G4881AQPCR NGS 10
96 Bravo DNA 96 6 192 NGS AVADIS-NGS GUI NGS GUI GeneSpring AVADIS-NGS GeneSpring GO Pathway DNA-Seq SNP/InDel Variation Large Structural Variation RNA-Seq Exon SNP/InDel ChIP-Seq PICSMACS GeneSpring NGS AVADIS-NGS 11
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