AmoyDx TM EGFR 29 Mutations Detection Kit(Pre-load) 使用マニュアル 注 : この説明書は 英文添付文書の簡易訳です 製品に添付されている英文マニュアルも必ずご確認下さい 製品 : コード No. 品名 梱包単位 保存温度 輸送温度 AMADX-EG01 EGFR 29 Mutations Detection 12 テスト Kit - Pre-loaded 冷凍 (-20 度 ) 冷凍 (-20 度 ) 使用目的 : AmoyDx TM EGFR 29Mutations Detection Kit は Real-time PCR を用いて EGFR 遺伝子の全 29 種類の変異 (Exon18-21) を非常に高感度にかつ簡便検出するための研究用試薬です 検出可能なEGFR 変異の種類 変異名称 変異 exon 塩基の変化 Cosmic ID Ex18- G719A 18 2156G>C 6239 Ex18- G719S 18 2155G>A 6252 Ex18- G719C 18 2155G>T 6253 mutant-3 Ex19- E746_A750del (1) 19 2235_2249del15 6223 Ex19- E746_A750del (2) 19 2236_2250del15 6225 Ex19- L747_P753>S 19 2240_2257del18 12370 mutant-3 Ex19- E746_T751>I 19 2235_2252>AAT(complex) 13551 mutant-4 Ex19- E746_T751del 19 2236_2253del18 12728 mutant-5 Ex19- E746_T751>A 19 2237_2251del15 12678 mutant-6 Ex19- E746_S752>A 19 2237_2254del18 12367 mutant-7 Ex19- E746_S752>V 19 2237_2250>T(complex) 12384 mutant-8 Ex19- E746_S752>D 19 2238_2255del18 6220 mutant-9 Ex19- L747_A750>P 19 2238_2248>GC(complex) 12422 0 Ex19- L747_T751>Q 19 2238_2252>GCA(complex) 12419 1 Ex19- L747_E749del 19 2239_2247del9 6218 2 Ex19- L747_T751del 19 2239_2253del15 6254 3 Ex19- L747_S752del 19 2239_2256del18 6255 4 Ex19- L747_A750>P 19 2239_2248TTAAGAGAAG>C(complex) 12382 5 Ex19- L747_P753>Q 19 2239_2258>CA(complex) 12387 6 Ex19-7 L747_T751>S 19 2240_2251del12 6210-1 - 2012/12/26 Ver.1.0
Ex19-8 Ex19-9 mutant-3 mutant-4 mutant-5 Ex21- Ex21- L747_T751del 19 2240_2254del15 12369 L747_T751>P 20 2239_2251>C(complex) 12383 T790M 20 2369C>T 6240 S768I 20 2303G>T 6241 H773_V774insH 20 2319_2320insCAC 12377 D770_N771insG 20 2310_2311insGGT 12378 V769_D770insASV 20 2307_2308insgccagcgtg 12376 L858R 21 2573T>G 6224 L861Q 21 2582T>A 6213-2 - 2012/12/26 Ver.1.0
キット構成 : 内容 数量 8 連ストリップ *( プライマー分注済み ) 12 本 EGFR Taq Polymerase 45 ul EGFR Mixed Standard 250 ul * ストリップ 1 本で 1 サンプルです ストリップ構成 : 8 連チューブのうち チューブ 1~7 には各 EGFR 遺伝子変異 (FAM) と Internal Control(HEX/VIC) が入っています チューブ 8 は External Control(FAM) が入っています チューブ 1-7 は 蛍光色素 FAM を使用して EGFR 遺伝子の変異を検出し 蛍光色素 (HEX/VIC) を使用してインターナルコントロールを検出します インターナルコントロールは PCR の偽陰性を引き起こす可能性のある阻害物質の有無を確認します チューブ 8 は エクスターナルコントロールで FAM のみが入っています ストリップの種類は Real-time PCR の種類によって下記の違いがあります ABI StepOne: 各チューブの上にチューブ番号 (1~8) が記載されています ABI StepOne 以外の機種 : 番号は記載されておらず 1 番チューブ 8 番チューブに穴が空いています 1 番のチューブは左上隅に 8 番のチューブは右真ん中に穴が空いています チューブ 変異名 蛍光色素 1 19-Del FAM HEX/VIC 2 L858R FAM HEX/VIC 3 T790M FAM HEX/VIC 4 Insertions FAM HEX/VIC 5 G719X FAM HEX/VIC 6 S768I FAM HEX/VIC 7 L861Q FAM HEX/VIC 8 External Control FAM キット以外に必要な試薬 機器 : 内容 リアルタイム PCR その他 備考 ABI7300/7500/7900/StepOne(Applied Biosystems) Stratagene Mx3000P,Mx3005P (Agilent Technologies ) LightCycler480 I and II (Roche) BioRad-CFX96(Bio-Rad Laboratories) 注意 :LightCycler を使用する場合は Roche480 アダプター (cat No. B79480) を使用下さい LightCycler480 I をご利用の場合 蛍光補正が必要です LightCycler480 II をご利用で 蛍光値のクロスオーバーが見られる場合にも同様に蛍光補正が必要です 滅菌蒸留水 ( ヌクレアーゼフリー ) 無菌チューブ ( ヌクレアーゼフリー ) ピペット フィルターチップ等 - 3-2012/12/26 Ver.1.0
サンプルの種類 : 組織もしくは血液から抽出したヒト DNA を使用してください なお Thermo Fisher NanoDrop 1000 /2000 等を使用して サンプルが以下の値の範囲にあることを確認してください A260/A230 2.0 A260/A280:1.8 2.0 推奨 DNA 抽出キット パラフィン切片の場合 :Qiagen DNA extraction kit(qiagen 社 カタログ番号 :56404) 組織 血液サンプルの場合 :DNeasy Blood & Tissue kit(qiagen 社 カタログ番号 :69504 または 69506) 操作上の注意点 : EGFR mixed standard は 29 種類の変異を含むリコンビナント EGFR と ヒトゲノム DNA が入っています 保管する際は サンプル DNA と別の場所に保管し コンタミネーションしないよう注意して下さい テンプレートなし ( ネガティブコントロール 以下 NC) EGFR mixed standard( ポジティブコントロール 以下 PC) は 各テストの際には毎回測定してください 操作方法 : 1. ストリップ サンプル DNA 及び EGFR mixed standard を室温で溶かして下さい 軽く遠心しフタの裏についた溶液を落とします 2. サンプル用チューブ (N 本 )+2 本 (NC 用 PC 用 ) の計 (N+2) 本のチューブ ( ヌクレアーゼフリーの無菌チューブ ) を用意し 下記の通りサンプルを分注します サンプル用チューブ (N 本 ): 各サンプルDNA( 各 42.3ul) サンプルDNAの必要量はサンプルの種類によって変わります DNAの希釈は TE(pH8.0) を使用してください パラフィン切片由来 DNA 保存期間が3 年未満 :90 ng パラフィン切片由来 DNAで保存期間が3 年以上 :135 ng パラフィン切片以外 ( 新鮮組織 凍結病片 全血 ) 由来 DNA:18~45 ng ( 希釈例 ) パラフィン切片由来 ( 保存 3 年未満 ) の45ng/ulのDNAの場合 DNA 原液 2 ulを TE 40.3 ulで希釈調整して下さい PC 用チューブ (1 本 ):EGFR mixed standard(42.3ul) NC 用チューブ (1 本 ): 滅菌蒸留水 (42.3ul) 3. EGFR Taq Polymerase を冷凍庫から取り出し 軽く遠心しフタの裏の溶液を落とします 4. 2. で用意した各チューブに EGFR Taq Polymerase をそれぞれ 2.7ul ずつ分注します この時 余分な液がチップの先につかないように注意して下さい EGFR Taq Polymerase は使用後速やかに冷凍庫に保管して下さい 5. 各混合溶液がしっかり混ざるようにピペッティングします フタを閉め 各チューブを軽く遠心します 6. 各チューブの混合溶液を 5ul ずつ 各ストリップの 1 番 ~8 番のウェルに分注します コンタミネーションの影響を最小限にする為 NC 各サンプル PC の順番で分注してください サンプル数 10 検体の場合 1 2 3 4 5 6 7 8 NC ストリップ 1 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul サンプル 1 ストリップ 2 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul サンプル 2 ストリップ 3 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul - 4-2012/12/26 Ver.1.0
サンプル 10 ストリップ 11 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul PC ストリップ 12 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 分注する際には チップの先がチューブの溶液に付かないように壁面上部から流します 7. チューブにシールを張り 軽く遠心して分注した溶液を確実にチューブ下に落としてください この作業を行わないと しっかりと溶液が混ざりませんので必ず遠心を行ってください 8. チューブをリアルタイム PCR にセットして 下記のプログラムで測定を行ってください 測定機器の設定では 必ず Calibration Fluorescence のチェックを外して下さい また PC NC サンプルのウェルを同時に設定して下さい リアルタイム PCR 条件 結果の解析 検出限界 ( 閾値 Threshold) と増幅曲線の交点を Ct(Threshold Cycle) といいます サンプルの陰性 陽性を決定する Ct 値は 数多くのバリデーションに基づいています まず チューブ 1~7 の HEX/VIC シグナルで インターナルコントロールの増幅の状態を確認してください HEX/VIC FAM シグナルのどちらかが検出されていれば問題ありません HEX/VIC FAM シグナルがどちらも検出されなかった場合 そのデータは無効となりますので再検査を行って下さい 次に チューブ 8 の FAM シグナルで エクスターナルコントロールの増幅の状態を確認してください 1. パラフィン切片の場合 Ct 値は 15~21 ですが パラフィン切片以外のサンプルは 13~ 19 となります 2. 1. の条件よりも Ct 値が小さい場合 DNA を入れすぎの可能性がありますので DNA 量を減らして再検査を行って下さい 3. 1. の条件よりも Ct 値が大きい場合は DNA に PCR 阻害物質が含まれている可能性がありますので 再度 DNA を抽出し直して再検査を行って下さい インターナル / エクスターナルコントロールの値が問題ないことを確認した後 各サンプルの - 5-2012/12/26 Ver.1.0
FAM の Ct 値を確認します Ct 値に応じて 強陽性 弱陽性 陰性に分けられます 詳細は次ページの判定表をご覧下さい 弱陽性の場合は さらに Ct 値を算出して陰性もしくは陽性を決定します Ct は下記の式で求められます Ct = FAM ( 各 1~7 番チューブ )Ct 値 - external control FAM(8 番チューブ )Ct 値 判定表 Tube# 1 2 3 4 5 6 7 変異 19-Del L858R T790M Insertion G719X S768I L861Q 強陽性 Ct 値 <26 <26 <26 <26 <26 <26 <26 変異 % >5% >5% >5% >5% >5% >5% >5% Ct 値 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 26~29 弱陽性 Ct 値 <11 <11 <7 <9 <7 <8 <8 変異 % 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 1~5% 陰性 Ct 値 29 29 29 29 29 29 29 参考文献 1. Herbst RS, 2004. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59 (2 Suppl): 21 6. 2. Zhang H, Berezov A, Wang Q, Zhang G, Drebin J, Murali R, Greene MI, 2007. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies. J. Clin. Invest. 117 (8): 2051 8. 3. Oda K, Matsuoka Y, Funahashi A, Kitano H, 2005. A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling. Mol. Syst. Biol. 1: 2005.0010. 4. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al., 2004. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 350 (21): 2129 39. 5. Seth D, Shaw K, Jazayeri J and Leedman PJ, 1999. Complex post-transcriptional regulation of EGFreceptor expression by EGF and TGF-α in human prostate cancer cells. Br J Cancer 80(5-6):657-69. 6. PaoW, Miller VA, Politi KA, Riely GJ, Somwar R, Zakowski MF, Kris MG and Varmus H, 2005. Acquired resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib is associates with a second mutation in the EGFR kinase domain. Plos Medicine 2(3):1-11. 株式会社ベリタス 105-0013 東京都港区浜松町 1 丁目 10-14 住友東新橋ビル3 号館 5 階 TEL 03-5776-0078 FAX 03-5776-0076 技術的なお問い合わせは :TEL 03-5776-0040 E-mail techservice@veritastk.co.jp - 6-2012/12/26 Ver.1.0