北陸RI研究会誌第４号

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きみえたかひ
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1 ESR ESR ESR in vitro in vivo ESR. ESR ESR Electron Spin Resonance ESR ESR spectroscopy ESR EPR Electron Paramagnetic Resonance. ESR ESR ESR ESR. ESR ESR 3

2 h h g H h g H ESR. triplet oxygen 3 O 2 superoxide O 2 hydroxyl radical OH hydrogen peroxide H 2 O 2 singlet oxygen 1 O 2 4

3 . Superoxide dismutase SOD pulse radiolysis flash photolysis ESR Spin Trapping. ESR ESR ph... ESR ESR ESR spin/g ESR 10 µr M 5

２ラジカルの生成と消滅スライド８ラジカルの寿命が短いと再結合反応や不均化反応で非常に速く反応が進んで消えるわけですこれを拡散律速と考えますと二次速度定数は大体 1010 M 1s 1 ですこのラジカルの濃度が 10 8 M ぐら

３速いラジカルを生成する方法スライド９速いラジカルを作る方法をスライド９に示しますすなわち ①放射線の化学反応は放射線を当てながら直接 ESR を測定する ②同じように光化学反応で光反応を行いながら ESR の測定をする ③電気

スライド 10 短寿命ラジカルを測定するには速いラジカルを作る方法以外にラジカルの消滅速度を遅くして反応性を低くするという方法もあります一つは試料を 77 K 液体窒素温度や４K 液体ヘリウム温度のかたちで凍結して ESR

4 北陸地域アイソトープ研究会誌第４号 2002 年スライド 9 ２.３.４スライド７２.３.２ラジカルの生成と消滅スライド８ラジカルの寿命が短いと再結合反応や不均化反応で非常に速く反応が進んで消えるわけですこれを拡散律速と考えますと二次速度定数は大体 1010 M 1s 1 ですこのラジカルの濃度が 10 8 M ぐらいのときを考えますとそのラジカルの消失速度は 10 6 M 1s 1 ぐらいですスライド８したがってもし最低 10 8 M の濃度のラジカルを観測するためには消失速度より速くラジカルを生成すればいいわけです２.３.３速いラジカルを生成する方法スライド９速いラジカルを作る方法をスライド９に示しますすなわち ①放射線の化学反応は放射線を当てながら直接 ESR を測定する ②同じように光化学反応で光反応を行いながら ESR の測定をする ③電気化学的な酸化還元反応も電解還元を ESR の測定部位の上限で行ってラジカル生成を高める ④速い酸化還元反応ケミカルな酸化還元反応でラジカルを速く生成させるという方法で速いラジカルを作ることができますラジカル消滅速度を遅くする方法スライド 10 短寿命ラジカルを測定するには速いラジカルを作る方法以外にラジカルの消滅速度を遅くして反応性を低くするという方法もあります一つは試料を 77 K 液体窒素温度や４K 液体ヘリウム温度のかたちで凍結して ESR を測る方法ですただその場合はスペクトルが固体の ESR ということで少し厄介になるのですがそういうかたちでラジカルの寿命を延ばすことができますもう一つの方法としてスピントラップ法があります２.３.５通常の化学実験室で測定可能な方法スライド 11 通常の化学的な実験室でできる方法はスライド 11 のようにいくつかあります ① 迅速流通法 rapid flow method 速い酸化還元方法を使うもの ② 迅速混合急速冷凍法混ぜてすぐに液体窒素中に噴出して反応を止める方法 ③ スピントラップ法ここでは①と③についてお話します２.３.５.１迅速混合流通法スライド 12 スライド 12 は我々が使った迅速混合流通法の模式スライド８スライド 10 6

5 11 A B F S C ESR OH OH SO 3 msec Rx 15 nitroxyl radical ESR 7

15 ESR 16 16 2-methy-2-nitrosopropane MNP

butylnitrone POBN 5- diethoxyphosphoryl -5-methyl-1-pyrroline-

6 15 ESR methy-2-nitrosopropane MNP 3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonate DBNBS 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide DMPO -phenyl-n-tert-butylnitrone PBN - 4-pyridyl-1-oxide -N-tert butylnitrone POBN 5- diethoxyphosphoryl -5-methyl-1-pyrroline- N-oxide DEPMPO DMPO diethoxyphosphoryl DEPMPO DMPO DMPO-OH adduct 15 G 1.5 mt N H POBN OH N OH dimethyl sulfoxide DMSO DMSO OH

7 C OH DMPO POBN DBNBS OH DMSO DBNBS 19 xanthine oxidasedmpo 19 SOD 20 ESR XA IC HisGlyGly IC µm GylHisGyl IC µm IC 50 HisGlyGly OH ESR OH OH OH

22 DMPO OH 22 22 OH OH OH 1-hydroxyethyl

hydroperoxy radical O 2 alkoxyl radical LO.

8 22 DMPO OH OH OH OH 1-hydroxyethyl radical OH IC 50 Compound 4 chalcom IC 50 E 10 OH. 23 vivo UV NO X SO X DEP reactive oxygen superoxide hydroxyl radical hydroperoxy radical O 2 alkoxyl radical LO. alkylperoxyl radical LO 2. NO 2 NO NO singlet oxygen hydrogen peroxide 24 10

北陸地域アイソトープ研究会誌第４号 2002 年ハイドロぺルオキサイド lipid hydroperoxide 次亜塩素酸イオン hypochlorite ion ClO オゾン ozone 鉄の酸素錯体 Fe-O2 complex がありこれらは活性ではありますが不対電子を持っていな

３酸素及び活性酸素種の関係スライド 25 スライド 25 は酸素から水へ至る経路をまとめたものです私たちが呼吸しますとミトコンドリア等で酸素を使ってエネルギーを作るわけです通常そういう状態では酸素から２電子ずつ電子が移動します酸素からペルオキシドそれからもう２電子が渡されて水になります

9 北陸地域アイソトープ研究会誌第４号 2002 年ハイドロぺルオキサイド lipid hydroperoxide 次亜塩素酸イオン hypochlorite ion ClO オゾン ozone 鉄の酸素錯体 Fe-O2 complex がありこれらは活性ではありますが不対電子を持っていないのでラジカルではありません３.３酸素及び活性酸素種の関係スライド 25 スライド 25 は酸素から水へ至る経路をまとめたものです私たちが呼吸しますとミトコンドリア等で酸素を使ってエネルギーを作るわけです通常そういう状態では酸素から２電子ずつ電子が移動します酸素からペルオキシドそれからもう２電子が渡されて水になります通常はスーパーオキサイドヒドロキシルラジカルにはならないと言われていますが最近の研究では酸素の３程度はスーパーオキサイドになると言われていますもちろんミトコンドリアの中には特にマンガンの SOD がたくさんあるのでどんどんスーパーオキサイドは消えていくと思います放射線の影響に関しては例えば放射線照射によスライド 25 り酸素分子 3O2 に電子 e が１つ入って不対の電子となりスーパーオキサイドができるあるいは水分子から一部ヒドロキシルラジカルがダイレクトに生成されることも知られています３.４活性酸素フリーラジカルの関与する病態スライド 26 活性酸素とフリーラジカルはいろいろな生体物スライド 26 11

10 26 DNA NO NO LDL SOD catalase glutathione peroxidase -S-glutathione-Stransferase antioxidative enzyme chelation transferrin lactoferrin ceruloplasmin C E carotenoid ubiquinol 27 12

1 GHz in vivo ESR GHz 300 MHz NMR L L in vivo ESR X 50 100.

11 28 29 DNA repair enzyme phospholipid. 28 in vivo ESR. L ESR in vivo.. 29 in vivo ESR 29 X 9.1 GHz in vivo ESR GHz 300 MHz NMR L L in vivo ESR X in vivo 30 in vivo ESR 30 in vivo ESR.. in vivo 31 in vivo ESR.. in vivo in vivo ddy 20g 7.5 Gy 15 Gy 13

12 Gy LD 50 Carbamoyl- PROXYL 280 mm 50 µr E.. L ESR L-band ESR L 300 MHz L-band ESR.. ESR 36 NO N 10 NO 36 14

北陸地域アイソトープ研究会誌第４号 2002 年スライド 32 スライド 33 スライド 34 示しています

を測ると大体 10 分程度まではほぼ 100 戻りますしたがって大体 10 分までの減少はこういう還元系によることがわかります

プローブの消失の変化がどうなったかを調べたものですＸ線を当てない方より 15 Gy を当てると傾きが大きくなります

13 北陸地域アイソトープ研究会誌第４号 2002 年スライド 32 スライド 33 スライド 34 示していますニトロキシルラジカルを投与してから３分後 13 分後 35 分後にマウスから血漿を取り出しフェリシアン化カリを加えて ESR を測ると大体 10 分程度まではほぼ 100 戻りますしたがって大体 10 分までの減少はこういう還元系によることがわかります３.７.７マウス腹部のＸ線照射によるスピンプローブ消失の経時変化スライド 37 スライド 37 はマウス腹部のＸ線照射によるスピンプローブの消失の変化がどうなったかを調べたものですＸ線を当てない方より 15 Gy を当てると傾きが大きくなりますこの傾きから速度定数が求まるわけです放射線を当てないときの速度定数を求めた値と比較すると 7.5 Gy のときは照射直後ではかなり速度が速くなってきます１日後はまた元に戻 15

14 Gy Gy 25g 7.5 Gy Gy 15 Gy Gy 7.5 Gy 16

15 TBARS 41 TBARS E LDL 42 SOD GSH Peroxidase SOD Gy 15 Gy ESR.. Scid 45 17

16 Scid 46 Carbamoyl-PROXYL C.B- 17 Scid in vivo ESR 18

17 in vivo ESR.. HIMAC 50 HIMAC Heavy Ion Medical Accelerator in Chiba 1, LET Linear Energy 50 Transfer LET LET in vivo ESR.. in vivo ESR GOT TBARS 53 LET 60 kev/µm 15 kev/µm kev/µm 7.5 Gy GOT 7.5 Gy 19

18 TBARS 7.5 Gy GOT

19 TBARS OH DMSO 20 i.p. DMSO OH OH Gy 4 LET LET 60 kev 15 kev LET LET GOT LET Gy LET LET LET TBARS TBARS DMS 21

20 59 60 OH LET LET in vivo ESR NO 14 22

目次はじめに例 1) Superoxide の検出およびSuperoxide dismutaseによるsuperoxide 消去活性例 2) 過酸化水素の検出およびCatalaseによる過酸化水素消去活性例 3) OHラジカルのおよびクロロゲン酸による OHラジカル消去活性 1 頁 2 頁 3 頁

目次はじめに例 1) Superoxide の検出およびSuperoxide dismutaseによるsuperoxide 消去活性例 2) 過酸化水素の検出およびCatalaseによる過酸化水素消去活性例 3) OHラジカルのおよびクロロゲン酸による OHラジカル消去活性 1 頁 2 頁 3 頁化学発光を用いた活性酸素 / 抗酸化能例目次はじめに例 1) Superoxide の検出およびSuperoxide dismutaseによるsuperoxide 消去活性例 2) 過酸化水素の検出およびCatalaseによる過酸化水素消去活性例 3) OHラジカルのおよびクロロゲン酸による OHラジカル消去活性 1 頁 2 頁 3 頁 4 頁化学発光を用いた活性酸素 / 抗酸化能活性酸素の功罪