Rational design of fluorescent hydrogen peroxide probe based on the umbelliferone fluorophore

Size: px

Start display at page:

Download "Rational design of fluorescent hydrogen peroxide probe based on the umbelliferone fluorophore"

みさきはまもり
5 years ago
Views:

1 Rational design of fluorescent hydrogen peroxide probe based on the umbelliferone fluorophore ウンベリフェロン発蛍光団に基づく蛍光過酸化水素プローブの合理的設計著者 :Lupei Du, Minyong Li, Shilong Zheng, Binghe Wang 雑誌 :Tetrahedron Letters 49 (2008) 紹介者 : 堀田隼 2011 年 7 月 1 日 1

2 蛍光分析法蛍光放射 A: 吸収 G: 基底状態 S 1 S 3 : 一重項励起状態 T 1 T 3 : 三重項励起状態 F: 蛍光 P: りん光 R: 無放射遷移 IV: 内部転換 IS: 項間交差電子のスピン : ±1/2, 分子全体のスピン量子数 : S, 多重度 : 2S+1 ある一定の構造をもつ分子は光を放出して励起状態から基底状態に戻る S 1 G T 1 G 蛍光 ( 寿命 :10-7 ~10-9 秒 ) りん光 ( 寿命 :10-6 ~10 秒 ) 一般に蛍光およびりん光は励起光よりも長波長域に現れる 2

蛍光強度蛍光強度は吸収した励起光の強度に比例 F Ia f (F: 蛍光強度, I a : 吸収した励起光の強度, f : 蛍光量子収率 ) ここで I a I 0 It (I 0 : 入射光の強度, I t : 透過光の強度 ) であり励起光の吸収は Lambert-beer の法則に従うので cl cl F I 0 (1 10 ) f ( log cl より It I 0 10 ) I

3 蛍光強度蛍光強度は吸収した励起光の強度に比例 F Ia f (F: 蛍光強度, I a : 吸収した励起光の強度, f : 蛍光量子収率 ) ここで I a I 0 It (I 0 : 入射光の強度, I t : 透過光の強度 ) であり励起光の吸収は Lambert-beer の法則に従うので cl cl F I 0 (1 10 ) f ( log cl より It I 0 10 ) I 0 ( : モル吸光係数, c: モル濃度, l: 液層の長さ ) この式を展開すると It F I 2 0(2.303 cl){1 (2.303 cl)/ 2 (2.303 cl) /6 } f ここで cl < 0.02 では第二項以下は無視できるので F I 0(2.303 cl) f 低濃度の範囲において蛍光強度 F は濃度 c に比例 ( 濃度が高くなると f の低下や蛍光の再吸収が起こる ) 3

4 蛍光量子収率 (fluorescence quantum yield) 蛍光量子収率吸収された光量子 1 個に対して放出される蛍光の光量子の数環境条件 ( 温度, 粘度など ) により変化基準物質と蛍光強度を比較し相対量子収率を求める f 1 f 2 F c F F 2 1c 1, F 2 : 波数表示でのピーク積分値 ( 面積 ) 1 化合物溶媒励起波長 (nm) 量子収率アントラセンエタノールクロロフィルa エタノールエオシン NaH 水溶液フルオレセイン NaH 水溶液硫酸キニーネ 0.1 M 硫酸ローダミンB エタノール蛍光分析に用いられる基準物質 4

5 励起スペクトルと蛍光スペクトル励起スペクトル l em : 519nm 蛍光スペクトル l ex : 340 nm 励起スペクトル蛍光波長 (l em ) を一定にして励起光側の波長を変化させて蛍光強度を測定量子収率が一定の波長範囲では吸収スペクトルに一致蛍光スペクトル励起波長 (l ex ) を一定にして, 蛍光側の波長を変化させて蛍光強度を測定吸収スペクトル ( 励起スペクトル ) と鏡像をなすことが多い他の装置で測定したスペクトルと比較するときは光量子計や基準物質により補正する 5

6 Introduction 活性酸素種 (RS) と生物学活性酸素種 (RS) ヒドロペルオキシド (RH) スーパーオキシド ( 2 ) ヒドロキシルラジカル ( H) 種々のペルオキシド様々な易酸化性細胞成分と反応 (NADH, たんぱく質, 核酸など ) 過酸化水素 (H 2 2 ) 多様な生物学的過程を調節するのに関係 ( 免疫細胞活性化血管再構築など ) 老化の作用物質 ( ミトコンドリア吸収によって産生される酸化的損傷の誘導物質 ) 利用可能な検出方法が制限されている 0 生物系における過酸化水素の重要性や挙動は十分に理解されていない 6

7 RS の検出報告されているプローブフルオレセイン誘導体ローダミン誘導体ホスフィンに基づくプローブランタニド配位錯体メリットとデメリットがある蛍光を発する Chem. Commun. 2005, 理想的なプローブ興味のある RS に特異的膜障壁を透過でき水にある程度溶けるといった物理化学的特性を有する適当な RS と遭遇するとすぐに強くかつ簡単に検出可能な信号を発する適当な RS と遭遇すると信号が消えるのではなく発する容易に入手できる出発物質から簡単に合成される 7

8 本研究におけるプローブの設計戦略過酸化水素との反応部位アリールボロン酸のフェノールへの変換を利用 Ph H B H H Ph H B H H -H H B H Ph H 2 Ph H + B(H) 3 検出に用いる信号蛍光は検出可能な信号の中で感度が良い蛍光性発色団であるクマリン部位を選択本研究での過酸化水素検出スキーム Tetrahedron 1986, H Umbebelliferone(7-Hydroxycoumarin) 高い量子収率をもつ ( f = 0.79, 硫酸キニーネ基準 ) Photochem. Photobiol. Sci., 2003, 2, 毒性が低い 8

9 Results and Discussion プローブの合成 (a) Tf 2, DMAP, DCM, rt (b) PdCl 2 (dppf)/dppf, KAc, dioxane, 80ºC, 1.5h, microwave F 3 C S S CF3 trifluoromethanesulfonic anhydride (Tf 2, Tf : CF 3 S 2 ) N N 4-dimethylaminopyridine (DMAP) Fe P P 1,1 -bis(diphenylphosphino) ferrocene (dppf) 設計されたプローブ 1 は容易に入手可能な出発物質 (Umbelliferone) から高い全収率 (80%) で合成された 9

10 反応機構パラジウム触媒によるホウ素化 B Ar 還元的脱離 Ar B Pd(ll) L L trans/cis 異性化 Ar L Pd(ll) L B 金属交換 B B B L Pd(0) L Ar L Pd(ll) L Ac Ar-Tf 酸化的付加 L Ar Pd(ll) L Tf - Ac - Tf 10

11 化合物 1 による過酸化水素検出 1(5mM) の H 2 2 (100 mm) に対する 30 分後の蛍光応答 0.1 M phosphate buffer, ph 7.4, l ex = 332 nm 黒線 :H 2 2 添加前, 赤線 :H 2 2 添加後溶液の色の変化 H 2 2 添加前 ( 左 ) H 2 2 添加後 ( 右 ) 1 は過酸化水素の添加により 454nm で著しい蛍光の増大 ( 約 100 倍 ) を示す NMR や MS により Umbelliferone(2) が生成物であると確認 11

12 蛍光応答の過酸化水素濃度依存性 1(5mM) の蛍光スペクトル ( 室温, 30 分後 ) 0.1 M phosphate buffer, ph 7.4, l ex = 332 nm 454nm における蛍光強度の濃度依存性 40 mm 未満では過酸化水素の濃度に応じて蛍光強度が増大それ以上では横ばい 12

13 化合物 1 の RS に対する選択性 RS の濃度と調製法過酸化水素 (H 2 2 ):100 mm 次亜塩素イオン (Cl ) :1.5 mm tert- ブチルヒドロペルオキシド (TBHP):100 mm それぞれの水溶液を希釈スーパーオキシド ( 2 ):50 mm 固体の K 2 として添加 1(5 mm) の種々の活性酸素種 (RS) に対する蛍光応答室温, 454nm における蛍光強度 0.1 M phosphate buffer, ph 7.4, l ex = 332 nm ヒドロキシラジカル ( H):100 mm tert- ブトキシラジカル (t-bu ): 50 mm 100 mmのh 2 2 またはTBHPと 1 mmのfe 2+ との反応によって生成 Fenton 反応 H Fe 2+ Fe 3+ + H + H Cl, TBHP, t-bu と比べて H 2 2 に 100 倍高い感度を示す H と比べて H 2 2 に 6 倍以上の感度を示す 2 と比べて H 2 2 に 2 倍以上の感度を示す 13

14 Summary 過酸化水素に対する水溶性の蛍光プローブ 1 を設計し安価な出発物質から簡単に合成したプローブ 1 は 5 mm で過酸化水素との反応により非常に大きな蛍光強度の増大を示した他の RS と比べて過酸化水素に対して非常に良い選択性を示す 14

15 補足過酸化水素とボロン酸過酸化水素の性質 H 2 2 は強い求核性をもつ RY + H 2 2 H 2 S 4 RH + HY (Y=H, Halogen) R' H R" R ホウ素の性質 H 2 2 /NaH R' R" H R R' R" R R 2 B R = R 2 B R R 2 B R B- 結合は二重結合性を有するため強い空の p 軌道をもっているので求核試薬の攻撃を受けやすいボロン酸の過酸化水素による酸化 ( 塩基性条件 ) は定量的に進行する 15

16 スーパーオキシド ( 2 ) 酸素分子の 1 電子還元型, ラジカルでありアニオンでもあるラジカル的求核的に反応を起こす RX + 2 R 2 + X Y Y + 2 R R スーパーオキシドの不均化 R + RX RR + X H + H H + H 2 pk a (H ) = 4.68 H 2 + H + k H k 2 H 2 + H 2 H k 1 = M -1 s -1 k 2 = M -1 s -1 不均化反応は酸性下では速く塩基性下ではおそい 1 mmの 2 が生成したときのpH 7での平均寿命は5 秒 16

17 スーパーオキシド ( 2 ) スーパーオキシドとボロン酸の反応の検討 PBE PH B H PBE 対応するフェノール (PH) X/X : スーパーオキシドの発生 CAT : 過酸化水素の分解 2H 2 2 2H SD : スーパーオキシドの不均化 H + H PBE の対応するフェノールへの変換は CAT の添加で抑制 PBEの酸化は 2 ではなくH 2 2 が原因 Free Radic. Biol. Med. 2009, 47,

18 次亜塩素酸イオン (Cl ) Cl と PBE との反応では対応するフェノールの他に塩素化物が生成塩素化物プローブ 1 の Cl に対する低感度は塩素化物の生成が原因かもしれない H 2 2 との反応 ( 数時間 ) に比べて Cl ( 数秒 ) との反応は速い pk a の差が原因 H 2 2 (11.7), Cl (7.47) TBHP の低反応性も pk a が原因 Free Radic. Biol. Med. 2009, 47,

19 B ヒドロキシラジカル ( H) 極めて高い反応性をもつラジカル, 求電子的性質を有する H どうしの反応 H + H H 2 2 k = M -1 s -1 1 mm の H が生成した時の寿命は約 200 ms プローブ 1 の H に対する応答はこの過酸化水素によるものかもしれない H の反応性水素引き抜き反応, 二重結合や芳香核への付加などが拡散律速に近い速度で起こる Bu Bu t B B + Bu t Bu + B Bu B Bu Bu B Bu プローブ 1 と H との反応が低蛍光応答の原因かもしれない 19

20 20

21 蛍光と化学構造蛍光の発現には平面構造をとることが有利 C C C フルオレセイン ( 蛍光性 ) フェノールフタレイン ( 無蛍光性 ) 置換基の影響置換基の種類蛍光波長蛍光強度 -R, -S 3 H 影響なし影響なし -H, -R, -NH 2, -NHR, -NR 2 長波長シフト増加 -I, -Br, -Cl, -F, -SH 長波長シフト減尐 -CH 長波長シフト著しく減尐 -CN 影響なし増加 -N 2, -N 消失 21

22 反応機構トリフラートへの変換 F 3 C S S CF 3 + RH F 3 C S R N H F 3 C S R + N S CF 3 N N H DMAP は HCl の捕捉の役割を担う N N + F 3 C S S CF 3 N N S CF 3 + S H R R S CF 3 CF 3 DMAP により活性種が効率的に生成 22

23 マイクロ波による加熱誘電率の高い溶媒は大きく温度が上昇誘電率の小さい溶媒はほとんど温度が上昇しない 23

24 活性酸素種の電子配置 p x * p y * p x * p y * p x p y p x p y s x s x 2s 2 2s 1 1s 1 1s 2 基底状態酸素 ( 三重項 ) 2s 2 2s 1 1s 1 1s 2 スーパーオキシド ( 2 ) 24

25 J. Am. Chem. Soc. 2005, 127,

26 26

27 27

28 28

29 29

New Color Chemosensors for Monosaccharides Based on Azo Dyes

New Color Chemosensors for Monosaccharides Based on Azo Dyes New olor hemoenor for Monocchride ed on zo Dye 著者 : Nicol Diere nd Joeph R. Lkowicz 雑誌 : rg.lett. 1, 3 (4), 3891-3893 紹介者 : 堀田隼 1 年 1 月 7 日ボロン酸の性質 1 ci-ジオールと環状エステルを形成する環状エステルを形成するとボロン酸の酸性度が高まる btrct