はじめに 病原性大腸菌 O-157( 以下 O-157 と略す ) は 腸管出血性大腸菌 ( ベロ毒素産生性大腸菌 ) に属し O-157 感染は O-157 に汚染された飲食物を摂取するか 患者の糞便を何らかの理由で直接口にすることで起こる O-157 に感染した場合 無症状から死亡するケースまで

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1 平成 11 年 7 月 14 日 大腸菌 O-157 に対するもずく熱水抽出物の抗菌性に関する研究報告書 もずく熱水抽出物の顕微鏡写真 大腸菌 O-157 などの病原性細菌に対する海藻多糖類食品有効成分の 抗菌活性の解析 での島根大学との共同研究報告書より抜粋 株式会社海産物のきむらや

2 はじめに 病原性大腸菌 O-157( 以下 O-157 と略す ) は 腸管出血性大腸菌 ( ベロ毒素産生性大腸菌 ) に属し O-157 感染は O-157 に汚染された飲食物を摂取するか 患者の糞便を何らかの理由で直接口にすることで起こる O-157 に感染した場合 無症状から死亡するケースまで様々であるが 多くの場合 O-157 の産生するベロ毒素により 出血性大腸炎を起こす 激しい腹痛 水様性の下痢 血便を特徴とし 特に 小児や老人では 溶血性尿毒症症候群 (HUS) や脳症 ( けいれんや意識障害など ) などの重症合併症になる患者もおり 最悪の場合死亡する O-157 は細胞表面の血清型により 多くの種類に分類されているが 食中毒件数が多く 毒性の強いものは O-157:H7 である 1982 年 ( 昭和 57 年 ) にアメリカのオレゴン州で発生した集団食中毒の際に初めて報告されて以来 イギリス オーストラリア カナダ 中国 南アフリカなど世界各地で見つかっている わが国においては 平成 8 年 5 月 岡山県邑久町の小学校での集団食中毒 7 月には大阪府堺市の学病原性大腸菌 O-157 の電子顕微鏡写真 1 ) 校給食を中心とした食中毒など各地で O-157:H7 による集団食中毒が続発した これらの集団食中毒により多数の食中毒患者 死者が発生し大規模な被害が出た O-157 による食中毒の発生後 毎回のように原因食材の追及が行われ 原因食品等と特定 推定されたものは 国内では井戸水 牛肉 牛レバ刺しなど 海外では ハンバーガー レタス アップルジュースなどがある しかし O-157 が感染してから発病するまでの期間 ( 潜伏期間 ) が長く 少数の菌 ( 約 100 個 ) により感染が成立するため その特定は難しいようである 平成 9 年に学校給食施設の一斉点検及び食品等の汚染実態調査が実施されたが 衛生管理が不十分であるところが多く 関係者による早急な改善がもとめられた また 平成 10 年の 5 月から 6 月にかけて富山県 東京都 千葉県 神奈川県及び大阪府において北海道のイクラ業者のイクラ醤油漬けにより食中毒が発生した この際 製造者が故意に品質の悪い製品を販売した疑いが持たれ 返品の一部が再販売されていたことがわかり 衛生管理に対する姿勢が問われた これらの食中毒により食品全体に対して安全性が重視され さらに各食品メーカーの衛生管理に対する姿勢が求められるようになった 2) このように各食品メーカーが O-157 対策に追われる中 当社では食品メーカーの責任として当社製品中での O-157 の生育の可否を調査し 死滅することを確認した 3) 4 ) 当社で製造した 味付沖縄もずく ( ナガマツモ科オキナワモズクを調味液 ( 三杯酢 ) で調味したもの ) 味付糸もずく( モズク科モズクを同上調味 ) および 味付めかぶ( ワカメの胞子葉の千切りを同上調味 ) に O-157 を約 個 /g 混入させ 37 あるいは 10 で培養し 菌数を測定し 製品中での O-157 の生育の可否を調査した 当社製品中で最もはやく菌が死滅したのは 味付糸もずく であった この味付糸もずく用の調味液も抗菌性を示したが 味付糸もずく はその調味液よりもはやく菌が死滅した これはもずくにはアルギン酸 フコイダンなどの生理活性物質が存在するが その中のいずれかの成分が調味液中

3 の食酢と共存することでより高い抗菌性を示したと考えられた また 平成 9 年には国立感染症研究所等により牛舎やと蓄場でのハエ類の O157 等の保菌の有無等を調査した結果では O157 等を保有するハエ類が確認された 2) そのためハエ類による O157 等の感染 伝播の可能性が考えられた これらのことからさらに O-157 による食中毒の予防や治療に対し関心が高まり 食品などに使用できる O-157 に対して有効かつ安全な抗菌性物質の開発が望まれた しかし 本研究においてもずくのみでは O-157 に対し抗菌性を示さず またもずくのままの状態ではさまざまな調味など食品への使用が困難であった しかし今回の研究でもずく熱水抽出物に処理することにより O-157 に対し抗菌性を示すことが明らかになった また 粉末の状態にすることで調理方法にかかわらず食品など広い範囲での使用が考えられる 表 1.O-157 による食中毒の発生状況 2 ) 年次 有症者数 無症者数 入院者数 死亡者数 平成 8 年 名 1475 名 1795 名 12 名 平成 9 年 1576 名 685 名 782 名 3 名 平成 10 年 1409 名 657 名 677 名 4 名 * 平成 11 年 169 名 72 名 72 名 1 名 * 平成 11 年 6 月 6 日現在 方法 (1) もずく熱水抽出物の製造方法表面に付着した異物を除去した湿潤状態のもずく ( モズク科モズク ;Nemacystus decipieus)100g を蒸留水 100ml とよく撹拌した これをオートクレーブを使用し 100 で 1 時間加熱した その後 ろ過により残さを除き この抽出液を電気透析により脱塩を行った これは 卓上電気透析装置マイクロ アシライザー S3 ( 旭化成 ) で電極液に硫酸ナトリウムを用い 電導度が 1mS/cm 以下になるよう脱塩を行った 脱塩した熱水抽出液をそのまま使用することも可能だが 必要に応じて凍結乾燥法により粉末にした 脱塩した熱水抽出液を容器側面に広がるよう凍結させ減圧し 室温 ( 約 20 ) で約一日間かけ水分を除去し もずく熱水抽出物を 1.5g 得た つまり この方法でもずく 100g 当たり約 1.5g のもずく熱水抽出物を得ることができた (2) もずく熱水抽出物の O-157 に対する抗菌性実験今回の実験でも今までと同様 島根大学生物資源科学部と共同の研究で行った O-157 は指定伝染病菌であるため実験を行うに当たっては特定の設備を整えなければならなかったが 島根大学遺伝子実験施設の P3 レベル実験室を使って実験を行った P3 レベルとは 病原微生物等の物理的封じ込めレベルの 1 つである 通常の実験室で一般外来者の入室制限のないものを P1( 大腸菌 K-12 株等を扱う ) 実験室を実験区域と限定し 実験中の一般外来者の入室を制限するものを P2(O-157 等の病原性大腸菌等を扱う ) 実験室を二重ドアで外部と隔離し 登録者以外の入室を禁止したものを P3( エイズウイルス等を扱う ) 実験室島根大学遺伝子実験施設が外部と完全に隔離され 実験室内では気密服の着用を義務づけ

4 られているものを P4( エボラウイルス等を扱う ) としている もずく熱水抽出物にすることにより O-157 に対する抗菌性があるかを調べるため 以下のように実験を行い もずく熱水抽出物水溶液ともずくとの菌体数の変化を比較した まず コントロールとして M9 最少培地 当社で製造さ 表 2. 各培地の ph 培地 ph M9 最少培地 7.2 味付糸もずく 4.0 調味液 4.0 もずく 5.4 もずく熱水抽出物水溶液 (6.0%) 4.8 れた 味付糸もずく その調味液 もずくともずく熱水抽出物水溶液の 5 種類を培地として使用し もずく熱水抽出物水溶液の濃度は 6.0% に調製し もずくはもずくと蒸留水を 2:1 の割合で混合した 各培地の ph を測定したところ M9 最少培地が ph7.2 味付糸もずく が ph4.0 調味液が ph4.0 もずくが ph5.4 もずく熱水抽出物水溶液(6.0%) が ph4.8 であった その後 O-157 を実験的に大量に混入させ ( 約 個 /g になるよう混入 ) 37 で保存した LB 培地 (Luria-Bertani's Broth 大腸菌の培養に使用する培地 1 リットルの組成 : ポリペプトン 10g イーストエクストラクト 5g NaCl 10g;pH7.0) で一晩培養した O-157 を各培地 99g に対し 1ml 加え 各試料培地とした 本実験で用いた O-157 は島根県衛生公害研究所より Escherichia coli O-157:H7 を頂いた 菌体数の測定は植菌後 時間後に食品衛生検査で一般的に行われている方法 5) に準ずる方法 ( 平板培養法 ) で行った 時間ごとに各試料培地から 1ml 抜き取り 滅菌した生理食塩水 9ml に加え 希釈した 希釈した液より 1ml 取り さらに生理食塩水 9ml に加えて希釈する方法で適当な倍率 ( 寒天培地で培養したとき コロニーが 30~300 個出る倍率 ) まで希釈し LB 寒天培地 ( 組成は液体の LB 培地と同じで Agar を 15g 添加 ) で培養後 コロニー数を計測した 結果および考察各試料培地に O-157 を一定数混入させて 37 で培養すると M9 最少培地は時間の経過ごとに菌が増殖し 24 時間後には 個 /g まで増殖した もずくは M9 最少培地よりも遅く 24 時間目で 個 /g まで増殖した 味付糸もずく 調味液は徐々に菌数が減少し 味付糸もずく は 14 時間後 調味液は 16 時間後に死滅した そしてもずく熱水抽出物水溶液 (6.0%) はもっとも早く菌が減少し 10 時間後には菌が死滅した ( 表 3 図 1 図 2) なお 図 1 は表 3 の結果の大腸菌数を対数で表示し 図 2 は表 3 の結果の大腸菌数を表示した 以上の結果より もずくのみでは O-157 に対する抗菌性が見られなかったが もずく熱水抽出物に処理することにより O-157 に対する抗菌性が現れることが分かった また もずく熱水抽出物水溶液は 6.0% では 味付糸もずく や調味液など ph の低い酢よりも強い抗菌性を示した ( 表 2 表 3) ヤクルト本社の中央研究所は沖縄産のもずくから抽出したフコイダンは胃潰瘍の治療効果があり もずく以外のフコイダンでは効果がないと報告した 6) もずく等と同じ褐藻類であるフシスジモク等から大腸菌に対する抗菌性物質の存在が確認された 7) ことや 今回の実験結果より もずく中に含まれる多糖類などの成分が加熱されることにより物理的な変化もしくは化学的な変化などの何らかの変化をしたものが O-157 に対し抗菌性を示すようになったと考えられる また このもずく熱水抽出物は O-157 に対する抗菌性を有した食品や飼料への利用が可能であると考えられる 具体的にはジュース 清涼飲料水などの各種飲料 クッキーやケーキなどの菓子類など機能性食品への利用が考えられる この水溶液には粘性があるため増粘 安定 保存などの効果を有する食品への利用なども期待できる また O-157 に対する抗菌性を有した牛などの家畜の飼料として用いることも可能と考えられる

5 表 3. 大腸菌 O-157 に対するもずく熱水抽出物等の増殖抑制効果 (37 ) 時間 M9 最少培地味付糸もずく調味液もずく もずく熱水抽出物水溶液 (6.0%) ( 個 /g) 8 7 残存大腸菌数 (log/g) M9 最少培地 味付糸もずく 調味液 もずく もずく熱水抽出物水溶液 (6.0%) 時間 (h) 図 1. 大腸菌 O157 に対するもずく熱水抽出物等の増殖抑制効果 (37 )

6 味付糸もずく 残存大腸菌数 調味液 もずく熱水抽出物水溶液 (6.0%) 時間 (h) 図 2. 大腸菌 O157 に対するもずく熱水抽出物等の増殖抑制効果 (37 ) 謝辞 病原性大腸菌 O-157 の菌株をご分与下さいました島根県衛生公害研究所 もずくの抽出等の実験への ご協力頂きました鳥取産業技術センターに深く感謝します 本研究担当者 監督 : 島根大学生物資源科学部 教授松田英幸 実施者 : 島根大学遺伝子実験施設客員研究員 ( 株 ) 海産物のきむらや開発研究室研究員 川本仁志

7 当社と島根大学の共同の研究内容 1. バイオテクノロジーによる海藻類の品質保持と発酵制御に関する応用的研究 (1994 年 ) 三木康成 ( 株式会社海産物のきむらや開発研究室研究員 ) 松田英幸 ( 島根大学農学部生物資源科学科教授 ) 2. 遺伝子工学による有用生理活性物質の発酵生産 (1995, 1996 年 ) 朱旭芬 ( 島根大学生物資源科学部生命工学科 ) 松田英幸 ( 島根大学生物資源科学部生命工学科教授 ) 3. もずくの抗菌作用と免疫強化能に関する発酵学的研究 (1996 年 ) 矢倉美代 ( 株式会社海産物のきむらや開発研究室研究員 ) 松田英幸 ( 島根大学生物資源科学部生命工学科教授 ) 4. 大腸菌 O-157 などの病原性細菌に対する海藻多糖類食品有効成分の抗菌活性の解析 (1997 年 1998 年 ) 川本仁志 ( 株式会社海産物のきむらや開発研究室研究員 ) 松田英幸 ( 島根大学生物資源科学部生命工学科教授 ) 参考文献 1) 国立予防衛生研究所細菌部腸管出血性大腸菌とは ( インターネット ). 2) 厚生省 O-157 食中毒関連情報 ( インターネット ). 3) 抗菌組成物 出願番号特願平 海産物のきむらや (1997). 4) ( 株 ) 海産物のきむらや大腸菌 O-157 に対する天然海藻多糖類食品の抗菌性に関する研究報告書 (1997). 5) 食品衛生検査指針微生物編 (1990) 厚生省生活衛生局監修社会法人日本食品衛生協会. 6) 日本経済新聞 ( ). 7) 林隆章ら : 北海道立衛生研究所報, 34, 97 (1984).

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