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しのぶおなか
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1 広島大学新技術説明会 8/20 大阪胃癌診断のための高感受性血清腫瘍マーカー広島大学大学院医歯薬学総合研究科分子病理講師大上直秀教授安井弥

2 研究背景胃癌は近年減少してきているとはいえ尚最も頻度の高い癌の一つでありこの克服は現代社会の最大の課題である分子病理学研究室では胃癌の発生進展のメカニズムを解析し胃癌の病態解明を行っているさらにそこから得られた知見をもとに胃癌の診断治療に有用な標的分子を同定し実際の診断治療への有用性について検討している

3 従来技術とその問題点現在癌の確定診断には主として病理形態学的診断が用いられいるしかし多数の検体に対して病理形態学的診断を行うことは困難であり血液検査等の簡便な方法で癌の存在を調べる検査が必要とされている既に実用化されている胃癌の血清腫瘍マーカーとして CEA CA19-9 があげられるが陽性率は 10-20% 程度で早期の癌を検出するのに不適切であるさらに偽陽性も多いことが問題点として指摘されている従って感受性の高い血清腫瘍マーカーの開発が必要とされている

4 Serial Analysis of Gene Expression Velculescu et al. Science 270:484, 1995 cdna マイクロアレイとともに代表的な網羅的遺伝子発現解析法 (1995 年 Kinzler らが考案 ) CATG 下流の 10-12bp の tag を sequence することによりその出現頻度と種類を解析し NCBI の database により対応する遺伝子を知ることができる定量性再現性に優れる未知の遺伝子の解析が可能現在までに約 300 種類の組織あるいは細胞の SAGE library が登録されておりそれらのデータと direct に比較することができる

7 89 1 2 3 5 4 6 15 胃癌関連遺伝子の同定 Sample Histology clone tag W226T W246T W226T tub1 (Early cancer) 2,592 43,908 W246T tub1

(Scirrhous type) 2,441 34,660 Total 5 samples 11,635 137,706 38,903 unique tags P208T P208L NCBI Gene Expression Omnibus: GEO

(78.3%), CDH17 (73.9%), APOC1 (67.4%), COL1A2 (58.7%), YF13H12 (52.2%), CEACAM6 (50.0%), APOE (50.0%), REGIV (47.

0139) Lymph node metastasis FUS (P =0.0416), APOE (P =0.0006) Stage YF13H12 FUS (P =0.0414), COL1A1 (P =0.0156), COL1A2 (P =0.

0125) T/N ratio >10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 8 9 10 11 12 1314 1 6 71 18 9 1 20 21 2 23 24 25 2627 YF13H12 protein expressed in

5 胃癌関連遺伝子の同定 Sample Histology clone tag W226T W246T W226T tub1 (Early cancer) 2,592 43,908 W246T tub1 (Advanced cancer) 2,867 32,174 P208T por1 (Primary tumor) 2,701 11,582 P208L por1 (LN metastasis) 1,034 15,382 S219T por2 (Scirrhous type) 2,441 34,660 Total 5 samples 11, ,706 38,903 unique tags P208T P208L NCBI Gene Expression Omnibus: GEO accession: GSE545 (SAGE Hiroshima gastric cancer tissue) S219T Frequently overexpressed genes (tumor/normal ratio>2) COL1A1 (78.3%), CDH17 (73.9%), APOC1 (67.4%), COL1A2 (58.7%), YF13H12 (52.2%), CEACAM6 (50.0%), APOE (50.0%), REGIV (47.8%), S100A11 (41.3%), FUS (41.3%) Invasion Real time RT-PCR analysis in 46 GC samples CDH17 (P=0.0060), APOE (P =0.0139) Lymph node metastasis FUS (P =0.0416), APOE (P =0.0006) Stage YF13H12 FUS (P =0.0414), COL1A1 (P =0.0156), COL1A2 (P =0.0395), APOE (P =0.0125) T/N ratio > YF13H12 protein expressed in thyroid T/N ratio > CDH Oue N, Yasui W, et al. Cancer Res, 2004.

6 胃癌特異的遺伝子の探索 Normal tissue Liver Kidney Heart Colon Brain Bone marrow Skeletal muscle Lung Small intestine Spleen Spinal cord Stomach Pancreas Leukocyte Gastric cancer Candidate gastric cancer specific genes REG4 OLFM4 MIA DKK4 MMP10 DEF5 ATE1 BRD4 ETS2 TRAG3 MLL4 CCT3 GPP34R LMO6 HORMAD1 胃癌の SAGE ライブラリーと生命維持に重要な 14 の臓器 ( 心臓肝臓等 ) の SAGE ライブラリーを比較し胃癌の SAGE ライブラリーのみで発現している遺伝子を抽出した抽出された 54 遺伝子すべてについて realtime RT-PCR 法で遺伝子発現を測定した正常臓器で最も発現が高かった遺伝子発現量と胃癌で最も発現が高かった遺伝子発現量を比較し胃癌で 10 倍以上高かった遺伝子を癌特異的遺伝子と定義した Aung PP, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2006.

Stomach Small intestine Colon Pancreas Reg IV 培養液中に分泌される TMK-1-Reg TMK-1-empty Cell Medium Cell Medium Western blot -

7 Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4) Reg IVは2001 年に炎症性腸疾患にて発現が亢進している遺伝子としてクローニングされた EGFRを活性化しアポトーシスを抑制することが知られている全身臓器における Reg IV の遺伝子発現解析 REGIV mrna expression level Real time RT-PCR analysis Stomach Small intestine Colon Pancreas Reg IV 培養液中に分泌される TMK-1-Reg TMK-1-empty Cell Medium Cell Medium Western blot - β-actin -V5-Reg IV 0 全身正常組織胃癌大腸癌肺癌乳癌全身正常組織では Reg IV の発現はほとんどなかったが胃癌大腸癌において高いレベルの Reg IV が検出された Oue N, Yasui W, et al. J Pathol, 2005.

8 胃癌組織における Reg IV の免疫染色 30% の胃癌で Reg IV の発現が認められた

胃癌患者の血清における Reg IV の検出 ng/ml 7 6 n = 36 n = 10 Serum Reg IV level 5 4 3 n = 101 n = 6 n = 9 2 n = 20 1 0

9 胃癌患者の血清における Reg IV の検出 ng/ml 7 6 n = 36 n = 10 Serum Reg IV level n = 101 n = 6 n = 9 2 n = 健常人胃炎患者 Stage I Stage II Stage III Stage IV 胃癌特異性は 99% 感受性は 36% であった Mitani Y, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2007

10 OLFM4 (Olfactomedin 4) 別名 GW112 hgc-1 骨髄芽球からクローニングされた遺伝子である分泌蛋白をコードする 510-amino acids 正常では骨髄小腸大腸前立腺に発現する潰瘍性大腸炎大腸癌肺癌乳癌などにおける発現が確認されている GRIM-19 cadherin lectin と結合しアポトーシスや細胞接着を制御する全身臓器における Reg IV の遺伝子発現解析 Real time RT-PCR analysis Liver Kidney Heart Colon Brain Bone marrow Skeletal muscle Lung Small intestine Spleen Spinal cord Stomach Pancreas Leukocytes GC1 GC2 GC3 GC4 GC5 GC6 GC7 GC8 GC9 CRC1 CRC2 CRC3 CRC4 CRC5 CRC6 CRC7 CRC8 CRC9 正常組織胃癌大腸癌 Fold difference (Tumor/Normal) > T/N>2 Gastric cancer T/N>2: 29 / 50 (58%) Stage I Stage II Stage III Stage IV 6/19 (32%) 23/31 (74%) -- P = 全身正常組織ではOLFM4の発現はほとんどなかったが胃癌において高いレベルのOLFM4が検出された

11 OLFM4 の局在発現とその機能胃癌胃癌 59% の胃癌で OLFM4 の発現を認めた小腸正常小腸においても一部に発現を認めた

胃癌患者の血清における OLFM4 の検出 ng/ml 250 n = 10 200 n = 36 n = 8 n = 9 n = 40 Serum OLFM4 level 150 100 n = 76 n =

12 胃癌患者の血清における OLFM4 の検出 ng/ml 250 n = n = 36 n = 8 n = 9 n = 40 Serum OLFM4 level n = 76 n = 101 n = 60 n = 6 n = n = 20 0 健常人胃炎患者 Stage I Stage II Stage III Stage IV 胃癌特異性は 95% 感受性は 31% であった

13 Reg IV と OLFM4 の血清診断マーカーとしての有用性 Reg IV CA19-9 CEA OLFM4 OLFM4 OLFM4 胃癌患者 123 例健常人 76 例 OLFM4 Reg IV CA19-9 CEA OLFM4+Reg IV Sensitivity 31% 37% 15% 14% 57% Specificity 95% 97% 100% 100% 95% Reg IV OLFM4 ともに stage I の胃癌症例でも 30% 以上が陽性である Reg IV と OLFM4 の組合わせは胃癌の高感度の血清診断マーカーである特願消化器癌検出用血清腫瘍マーカー消化器癌検出キットおよび消化器癌検出方法

14 新技術の特徴従来技術との比較胃癌の血清マーカーである CEA CA19-9 の陽性率はそれぞれ 10% 程度であったのに対し Reg IV の陽性率は 36% OLFM4 の陽性率は 31% であり従来のマーカーよりも検出感度が高かったさらに Reg IV と OLFM4 陽性例は一致しない傾向にあった両者を組み合せると陽性率は 57% であり半数以上の胃癌を検出できた

15 想定される用途業界胃癌の新規血清マーカーである Reg IV OLFM4 あるいは両者の組み合わせは陽性率が高いことから胃癌のスクリーニングに使用すれば簡便にこれらの癌を検出できる血清を材料に用いるので被検者への負担も少ない上記以外に抗がん剤の効果判定にも使用できる可能性がある検査センター病院においてこれらの検出試薬が使用されるものと考えられる尚血清腫瘍マーカーの測定は ELISA 法であり導入は容易である

16 実用化に向けた課題 Reg IV OLFM4 とも ELISA の系は完成しており胃癌患者の血清解析も終了している実用化に向けて標準化された方法を確立すると共に多数の胃癌患者健常人の血清を解析する必要がある

17 企業への期待 Reg IV と OLFM4 の標準化された ELISA の系を開発する標準化された ELISA の系があれば多数例の胃癌患者健常人の血清を材料に Reg IV と OLFM4 の濃度を測定することができる抗体作成技術を持つ企業との共同研究を希望

18 本技術に関する知的財産権発明の名称 : 消化器癌検出用血清腫瘍マーカー消化器癌検出キットおよび消化器癌検出方法出願番号 : 特願出願人 : 国立大学法人広島大学発明者 : 安井弥大上直秀 Reg IV OLFM4 単独での知的財産権の申請はしていない

19 お問い合わせ先広島大学大学院医歯薬学総合研究科分子病理学教室講師大上直秀 ( おおうえなおひで ) TEL: FAX: naoue@hiroshima-u.ac.jp

( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査教授大道正英髙橋優子副査副査教授教授岡田仁克辻求副査教授瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent trans

( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査教授大道正英髙橋優子副査副査教授教授岡田仁克辻求副査教授瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent trans ( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査大道正英髙橋優子副査副査岡田仁克辻求副査瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent transforming growth factor- binding protein-4 is downregulated in breast