糖鎖複合糖鎖糖鎖複合糖鎖各種単糖類 ( グルコース, ガラクトース, マンノース, N- アセチルグルコサミン, フコース, シアル酸など ) がグルコシド結合で連なった一群の化合物結合様式, 重合度, 構成糖による構造多様性に起因する機能性, 分子認識性を有するタンパク質や脂質などに糖鎖

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えのてっちがわら
5 years ago
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1 1 N 型糖タンパク質糖鎖のコア構造の効率的生産技術の開発新潟大学農学部特定研究員応用生物化学科仁平高則

2 糖鎖複合糖鎖糖鎖複合糖鎖各種単糖類 ( グルコース, ガラクトース, マンノース, N- アセチルグルコサミン, フコース, シアル酸など ) がグルコシド結合で連なった一群の化合物結合様式, 重合度, 構成糖による構造多様性に起因する機能性, 分子認識性を有するタンパク質や脂質などに糖鎖が結合した化合物で, それぞれ糖タンパク質や糖脂質などと呼ばれる N 型糖鎖, 型糖鎖, 糖脂質,GPI アンカー, プロテオグリカン, ペプチドグリカン, リポ多糖,S 層糖タンパク質, 莢膜多糖など細胞分化老化免疫応答など生命現象病原体による宿主認識癌転移炎症などの疾患に深く関与 2

3 アスパラギン結合型糖鎖アスパラギン結合型糖鎖細胞接着免疫調整シグナル伝達糖タンパク質の安定性溶解性 N 型糖鎖の構造 β β コア構造マンノース GlcNAc ガラクトースシアル酸 β-1,4-mannosyl-n,n -diacetylchitobiose H H H NHAc 62,000 円 / 10 μg (ProZyme Inc.) H H NHAc 糖鎖およびそのコア構造を安価に生産できれば, 医薬品素材として有効 3

4 4 従来技術とその問題点 (1) 有機合成保護合成脱保護多様な構造に対応 β- マンノシドなど合成困難多段階反応 (2) 糖転移酵素 NDP NDP (3) 加リン酸分解酵素 ( ホスホリラーゼ ) 厳密な位置選択性重合度制御酵素, 糖ヌクレオチドが不安定

5 5 ホスホリラーゼホスホリラーゼ + P P + オリゴ糖リン酸糖 1 リン酸単糖可逆反応厳密な位置選択性オリゴ糖生産に有効ホスホリラーゼによる高純度のオリゴ糖生産還元末端側の糖の変更によるオリゴ糖の多様性増大

fragilis ManGlcP ManGlcP: Mannosylglucose phosphorylase 1,4-β-Man n P:

6 β- マンノシドホスホリラーゼの探索 BT_ AA 18% R. albus ManGlcP 386AA 56% 58% 335AA R. albus 1,4-β-Man n P 390AA B. fragilis ManGlcP ManGlcP: Mannosylglucose phosphorylase 1,4-β-Man n P: Mannooligosaccharide phosphorylase amna phoa mfst naha nanh pufa enha susd susc B. thetaiotaomicron マンノースガラクトース 1032? GlcNAc シアル酸 amn: α-mannosidase pho: GH130 Phosphorylase mfst: Major facilitator superfamily transporter nah: β-n-acetylhexosaminidase nanh: α-sialidase enh: Endo-β-N-Acetyl-glucosaminidase sus: Sus(Starch utilization system)-like system 6

β- マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見 H Man1P P - - + RH Activity of BT_1033 RH K m (mm) k cat (s -1 ) k cat /K m (mm -1 s -1 ) GlcNAc 反応生成物 GlcNAc 3.8 37 9.

7 β- マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見 H Man1P P RH Activity of BT_1033 RH K m (mm) k cat (s -1 ) k cat /K m (mm -1 s -1 ) GlcNAc 反応生成物 GlcNAc H R + P - - GlcNAc β-1,4-mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase NMR ManGlcNAc Pi α-mannosyl 1-phosphate GlcNAc Nihira et al., J. Biol. Chem., 288, (2013). 7

N 型糖鎖コア構造の生産法の開発新規酵素 4--β-D-mannosyl-N-acetyl-D-glucosamine phosphorylase の発見 Synthesis α マンノース 1- リン酸 N- アセチルグルコサミン β-1,4 1,4- マンノシル N- アセチルグルコサミンリン酸 α マンノース 1- リン酸 N,N - ジアセチルキトビオース Synthesis H H

8 N 型糖鎖コア構造の生産法の開発新規酵素 4--β-D-mannosyl-N-acetyl-D-glucosamine phosphorylase の発見 Synthesis α マンノース 1- リン酸 N- アセチルグルコサミン β-1,4 1,4- マンノシル N- アセチルグルコサミンリン酸 α マンノース 1- リン酸 N,N - ジアセチルキトビオース Synthesis H H H NHAc β-1,4- マンノシル - N,N - ジアセチルキトビオースリン酸 H H NHAc N,N -diacetylchitobiose Core trisacchride of N-linked sugar chain β-1,4-mannosyl-n,n - diacetylchitobiose 60 min 10 min 0 min standard 1 g 620,000,000 Retention time(min) 8

9 ホスホリラーゼによる生産法の問題点 β-1,4-mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase + + α-man1p GlcNAc ManGlcNAc Pi 糖 1 リン酸が高価 (αman1p : 834,000 円 /g) 安価な天然糖質からホスホリラーゼおよび各種酵素を用いて糖 1 リン酸を獲得する 9

10 ホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システム糖 1リン酸をつくるホスホリラーゼ安価な糖質 P i リン酸糖 1 リン酸変換 P i 可能ならば変換利用 P i オリゴ糖ホスホリラーゼオリゴ糖をつくる糖受容体 10

糖 1 リン酸の生産および変換麦芽糖 MP ショ糖 SP GP 澱粉 αglc1p α-pgm Glc6P

GalT GalE αgal1p β-ガラクトシドの合成 β-マンノシドの合成 MP: maltose

phosphorylase, PGM: phosphoglucomutase, G6PI: glucose

11 糖 1 リン酸の生産および変換麦芽糖 MP ショ糖 SP GP 澱粉 αglc1p α-pgm Glc6P β-pgm G6PI βglc1p M6PI PMM α-グルコシドの合成 αman1p β-グルコシドの合成 GalT GalE αgal1p β-ガラクトシドの合成 β-マンノシドの合成 MP: maltose phosphorylase, SP: sucrose phosphorylase, GP: glycogen phosphorylase, PGM: phosphoglucomutase, G6PI: glucose 6-phosphate isomerase, M6PI: mannose 6-phosphate isomerase, PMM: phosphomannomutase 11

12 ManGlcNAc の調製 ( ショ糖出発 ) スクロースホスホリラーゼ P α-ホスホグルコムターゼ P ショ糖 P Fru αglc1p Glc6P Glc6P イソメラーゼ P ManGlcNAc GlcNAc P ManGlcNAc P αman1p ホスホ Man6P マンノムターゼ Fru6P Man6P イソメラーゼ P *ManGlcNAcP: β-1,4-mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase *ManGlcNAc: β-1,4-mannosyl N-acetyl glucosamine 12

13 13 ManGlcNAc の調製 ( ショ糖出発 ) 250 mm 250 mm 10 mm 100 mm 20 μg/ml 33 μg/ml 340 μg/ml 370 μg/ml 230 μg/ml 2.4 mg/ml 83 μg/ml 30 ショ糖 N- アセチルグルコサミン MgCl 2 リン酸ナトリウムグルコース 1,6- ビスリン酸スクロースホスホリラーゼ α- ホスホグルコムターゼグルコース 6- リン酸イソメラーゼマンノース 6- リン酸イソメラーゼホスホマンノムターゼ ManGlcNAc ホスホリラーゼ Fructose Sucrose ManGlcNAc 収率 42% で合成 Suc Fru Time (day) MGN

14 14 新技術の特徴従来技術との比較従来技術では合成困難なβ-マンノシドを, 簡便に生産することに成功した従来の合成法では, 有機溶媒の使用やスケールアップの点で生成糖の用途が限られていたが, ne-pot 酵素合成法により安全性を担保した大量生産が可能となった

15 15 想定される用途安全性の高い医薬品の原材料としての用途をはじめ, 医療分野全般, 食品分野, 化粧品分野などへの利用が想定される具体的には, 疾病用のマーカー,iPSやES 細胞の分化後の識別用マーカー, 癌細胞や病原菌の除去フィルター, ドラッグデリバリーシステム, 免疫寛容を組み込んだ糖タンパク質製剤としての利用など

16 16 実用化に向けた課題出発材料にショ糖を用いた生産システムを開発したが, 廃糖蜜などの廃棄物を利用した更なる低コスト化が可能か検討する必要がある水酸基を修飾した糖を使用した実験データを取得し, 有機合成法と連携をとる場合の条件設定を行なっていく食品利用の場合, 微生物汚染防止の観点から 60 程度の高温反応が望まれるため, 耐熱性酵素の探索が必要である

17 17 企業への期待有機合成法, 糖転移酵素による合成法など, 従来の技術をもつ医薬品分野の企業で, 本技術で生産されるマンノシドを材料とできる企業食品分野の企業で廃棄物 ( 廃糖蜜など ) 利用を展開を考えている企業キチンオリゴ糖生産技術をもつ水産加工系企業で, 糖鎖合成分野への展開を考えている企業などで, 本技術が有効と考えられ, 共同研究開発を希望する

18 18 本技術に関する知的財産権発明の名称 : 出願番号 : 出願人 : 発明者 : オリゴ糖合成酵素およびアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法特開新潟大学, 農研機構食品総合研究所中井博之, 仁平高則, 鈴木絵里香, 大坪研一, 北岡本光他, 未公開特許 1 件

19 19 お問い合わせ先新潟大学産学地域連携推進機構産学地域連携推進センター TEL FAX

新技術説明会　様式例

新技術説明会　様式例 1 機能性糖鎖の簡便な調製技術 : 医薬品検査薬機能性化粧品基剤などへの展開産業技術総合研究所北海道センター生物プロセス研究部門主任研究員清水弘樹研究背景近年糖鎖は核酸やタンパク質に続く第三の生命情報分子として注目されているまたウイルスや細菌の感染及び細菌毒素の体内への侵入の多くは宿主細胞が持つ糖鎖への接着によって開始されることが知られており感染症研究予防治療対策に病原体と糖鎖間の相互作用解析が重要と考えられている