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たしろううとだ
4 years ago
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1 酵素消化低分子化フコイダン抽出物による癌細胞特異的細胞死及び糖鎖合成経路の改変誘導 Kiichiro Teruya 1, Sanetaka Shirahata 1, Toshihiro Yoshida 2 (1. Dept. Biosci. and Biotech., Fac. Agr., Kyushu Univ., 2. Yoshida Clinic)

2 背景細胞表面に発現している糖鎖は免疫機能や恒常性維持機能のいずれにも密接に関与している糖鎖合成の異常ガンを含む様々な疾病の一因と考えられている Nomal cells intermediate-grade high-grade cancer cells malignant alteration Change of sugar chain structures

3 現在のガン治療法とその課題外科的療法再発や免疫力低下の可能性進行度合による限界放射線療法ガンの種類による感受性の違い治療に時間を要する抗ガン剤療法副作用薬剤耐性の問題機能性食品などを用いた補完代替療法有効性や作用メカニズムが完全に明らかとなっていない効果の低さガン細胞に特徴的な遺伝子変化や糖鎖合成異常の分子メカニズムに基づいた治療法の開発複数のサプリメントの併用

酵素消化低分子化フコイダン抽出物についてフコイダンコンブワカメモズクなどのメカブなど褐藻類の粘質物に多く含まれる硫酸多糖の一種主に L- フコースを主成分として含み数十から数十万個に連なった化合物平均分子量 ; 約 8, Preparation トンガ王国産モズク有機酸抽出 / 脱塩処理トンガ王国産モズク (Cladosiphon novae-caledniae Kylin)

4 酵素消化低分子化フコイダン抽出物についてフコイダンコンブワカメモズクなどのメカブなど褐藻類の粘質物に多く含まれる硫酸多糖の一種主に L- フコースを主成分として含み数十から数十万個に連なった化合物平均分子量 ; 約 8, Preparation トンガ王国産モズク有機酸抽出 / 脱塩処理トンガ王国産モズク (Cladosiphon novae-caledniae Kylin) 高分子フコイダン ( 平均分子量 : 約 8kDa) アワビグリコシダーゼ CH 3 O O 酵素消化低分子化フコイダン抽出物 (Fucoidan Extract : FE) OH OH O O CH 3 OH HO 3 SO O O O CH 3 OH HO 3 SO CO 2 H O O O CH 3 OH OH OH OH フコイダンの基本構造 Components Fucose 62.1 % Xylose 1.5 % Mannose 6. % Glucose 3.5 % Galactose 3.3 % Uronic acid 14.6 % Sulfate group 14.5 %

5 # Cells 実験条件 FE 添加培地と交換ヒト線維肉腫細胞株 HT18 Incubation (24 h 前培養 ) incubation Lectin 3 min h 48 h 25 Sub-G1 assay 2 15 G1 G2 期の細胞のピーク正常 DNA 断片化 DNA EtOH 固定 PI 染色 1 5 Sub-G1 領域 (DNA 断片化細胞群 ) 蛍光強度強二重らせん構造に intercalation 蛍光強度弱 FL3 LOG: FL3 LOG DNA content

6 Sub-G1 (%) Sub-G1 (%) FE と Con A による細胞死誘導増強効果 μg/ml FE のみ 14 μg/ml FE + Con A 12 1 FE のみ FE + Con A FE (μg/ml) Time (h) FE 処理濃度依存的な死細胞数の増加が確認された細胞死誘導増強効果は FE 処理 24 時間以降に認められた

7 Fluorescence strength FE 処理した HT18 細胞の Con A 反応性糖鎖発現量の変化 control 28 µg/ml FE 14 µg/ml FE 28 µg/ml FE h 48 h FITC Fluorescence FITC Fluorescence 24 h 48 h FE (μg/ml) FE 処理濃度依存的な Con A 反応性糖鎖の発現量増加が確認された

8 Fluorescence strength HT18 細胞の Con A 反応性糖鎖発現量の経時的変化 4 FE 未処理 28 µg/ml FE Time (h) 48 FE 処理時間依存的な Con A 反応性糖鎖の発現量増加が確認された

9 Fluorescence strength FE 処理した HT18 細胞の PHA-L4 反応性糖鎖発現量の変化 control 28 µg/ml FE 14 µg/ml FE 28 µg/ml FE h 48 h FITC Fluorescence FITC Fluorescence h 48 h FE (μg/ml) FE 処理濃度依存的な PHA-L4 反応性糖鎖の発現量減少が確認された

10 Fluorescence strength FE 処理した TIG-1 細胞の Con A 反応性糖鎖発現量の変化 control 28 µg/ml FE 14 µg/ml FE 28 µg/ml FE h 48 h FITC Fluorescence FITC Fluorescence 24 h 48 h FE (μg/ml) Con A 反応性糖鎖の発現量に変化は認められなかった

11 小活細胞死誘導増強効果は FE 処理 24 時間以降に認められた FE 処理によるCon A 反応性糖鎖の発現量増加及びPHA- L4 反応性糖鎖の発現量減少が確認された FE treatment Con A malignant alteration :mannose :N-acetylglucosamine :β-1,6-glcnac 細胞死誘導増強効果の要因であると示唆された

12 ガン細胞における GnT-V の役割 Nomal cells Cancer cells invasion malignant alteration GnT-V の発現量増加 Ets-1 の発現量増加 :mannose :N-acetylglucosamine :β-1,6-glcnac metastasis GlcNAcβ 1 GlcNAcβ 1-2 Manα 1 GlcNAcβ 1-2 Manα 1 6 Manβ 1-4 GlcNAcβ 1 3 GnT-V UDP- GlcNAc UDP 6 GlcNAcβ 1-2 Manα 1 GlcNAcβ 1-2 Manα 1 6 Manβ 1-4 GlcNAcβ 1 3 GnT-V は β-1,6-glcnac 分岐鎖の形成に関与しガンの浸潤転移とも深く関係している

Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理した HT18 細胞の GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量の変化 2.5E-2 GnT-V 24 h 48 h 4.E-2 Ets-1 24 h 48 h 2.E-2 * 3.5E-2 3.E-2 1.5E-2 1.E-2 ** 2.5E-2 2.E-2 1.5E-2 ** * ** 5.

13 Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理した HT18 細胞の GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量の変化 2.5E-2 GnT-V 24 h 48 h 4.E-2 Ets-1 24 h 48 h 2.E-2 * 3.5E-2 3.E-2 1.5E-2 1.E-2 ** 2.5E-2 2.E-2 1.5E-2 ** * ** 5.E-3 ** ** ** 1.E-2 5.E-3 ** ** **.E E FE (μg/ml) *:p<.5 **:p<.1 FE (μg/ml) *:p<.5 **:p<.1 FE 処理によって GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量減少が確認された

14 Relative GnT-V level Relative Ets-1 level HT18 細胞の GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量の経時的変化 3.E-1 2.5E-1 GnT-V FE 未処理 28 µg/ml FE 2.5E-2 2.E-2 Ets-1 FE 未処理 28 µg/ml FE 2.E-1 1.5E-1 1.E-1 ** ** 1.5E-2 1.E-2 ** * * 5.E-2 5.E-3 ** **.E E Time (h) *:p<.5 **:p<.1 Time (h) *:p<.5 **:p<.1 FE 処理時間依存的な GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量減少が確認された

15 Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理した TIG-1 細胞の GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量の変化 2.E-2 GnT-V 24 h 48 h 1.E-2 Ets-1 24 h 48 h 1.5E-2 1.E-2 * ** ** 8.E-3 6.E-3 4.E-3 * ** ** ** 5.E-3 2.E-3.E E FE (μg/ml) *:p<.5 **:p<.1 FE (μg/ml) *:p<.5 **:p<.1 FE 処理 24 時間では GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量に顕著な変化は認められなかった 48 時間処理ではわずかな発現量減少が確認された

16 小胞体 (ER) ストレスについて小胞体内腔に折り畳み不全のタンパク質 (unfolded proteins) が蓄積するようになる状態 UPR (unfolded protein response) 小胞体内に存在するシャペロン分子 (GRP78/Bip GRP94 など ) を転写レベルで誘導して異常タンパク質の巻き戻しを図る応答糖転移酵素 GnT-V Apoptosis シャペロン分子 XBP1 GRP78/Bip GRP94 ガン細胞のストレス耐性

17 Relative XBP-1 level Relative GnT-V level Control Tunicamycin Relative GRP78/Bip level Relative GRP94 level ER ストレス関連遺伝子に対する影響 1.2 GRP78/Bip 1.2 GRP FE (µg/ml) GRP78/Bip.2 control 1 Tm control 1 Tm GRP94 FE (µg/ml) FE (µg/ml) XBP XBP GnT-V GnT-V GAPDH control 1 Tm control 1 Tm FE (µg/ml) FE (µg/ml) FE は ER ストレスを増加させるのではなく軽減すると推測された

18 総括 FE 処理によって Con A 反応性糖鎖の発現量増加及び PHA-L4 反応性糖鎖の発現量減少が確認された糖鎖発現量の変化には GnT-V 及び Ets-1 の発現抑制が深く関与していると示唆された FE による ER ストレスの軽減が GnT-V の発現抑制に寄与していると推測された FE treatment Con A GnT-V Ets-1 GnT-V Ets-1 ER stress GRP78/Bip XBP-1 :mannose Enhancing Con A- induced cell death :N-acetylglucosamine :β-1,6-glcnac

19 酵素消化低分子フコイダン抽出物と抗ガン剤併用による抗腫瘍効果の増強

20 Sub-G1 (%) Sub-G1 (%) FE と Con A による細胞死誘導増強効果 FE のみ FE + Con A mg/ml FE のみ 14 mg/ml FE + Con A FE (mg/ml) Time (h) FE 処理濃度依存細胞死誘導効果の増加を確認 FE 処理 24 時間以降に細胞死誘導増強効果を確認

21 目的フコイダンガン化抗ガン作用正常細胞ガン細胞抗ガン剤抗ガン剤ガン細胞? フコイダンと抗ガン剤の併用がガン細胞に及ぼす効果およびその作用メカニズムの解明フコイダン cisplatin(cddp) : 腫瘍細胞の DNA 合成阻害および細胞分裂を阻害

22 # Cells 実験条件 HT18 細胞 ( ヒト線維肉腫細胞株 ) incubation (24 h 前培養 ) 培地交換 incubation h 24 h 48 h Sub-G1 assay Trypanblue staining 25 G 1 G 2 期の細胞のピーク EtOH 固定 DNA 断片化細胞 PI 染色濃青色の色素でタンパク質に強く結合死細胞は損傷により膜の透過性が高く細胞内に入り込み全体を青く染色 DNA content 二重らせん構造に intercalation

23 Sub-G1 (%) hour 48 hour control FE 28 mg/ml CDDP.1 mm CDDP 1. mm FE + CDDP.1 mm FE + CDDP 1. mm FE と CDDP の併用による処理濃度および処理時間依存の Sub-G1 細胞割合の増加を確認

24 Cell viability (%) (%) ** control FE 28 mg/ml CDDP.1 mm CDDP 1. mm FE + CDDP.1 mm FE + CDDP 1. mm FE と CDDP の併用による濃度依存細胞生存率の低下を確認

25 総括 FE と CDDP の併用による処理濃度および処理時間依存の細胞死誘導の増強を確認 FE と CDDP の併用による濃度依存細胞生存率の低下を確認併用により CDDP の使用量を減少させる事が出来るつまり FE による CDDP の副作用の軽減の可能性が示唆された

酵素消化低分子化フコイダン抽出物の抗ガン作用増強法の開発

酵素消化低分子化フコイダン抽出物の抗ガン作用増強法の開発 LMF 研究会 213.2.23 低分子化フコイダンの抗腫瘍効果に関する最新研究平成 25 年 2 月 23 日九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門システム生物学講座細胞制御工学分野白畑實隆現在のガンの治療とその課題外科的療法再発や免疫力低下の可能性進行度合いによる限界放射線療法ガンの種類による感受性の違い治療に時間を要する抗ガン剤療法副作用薬剤耐性の問題機能性食品などを用いた補完代替医療