Ⅱ 材料および方法 1. 供胚牛福井県内の酪農家 19 戸で飼養されているホルスタイン種経産牛の中から 4 産以上分娩しかつ産乳能力が高い上位 3 頭 ( 平均産歴 4.7 産 ) を選抜した供胚牛 3 頭を 3 反復し ( 延べ 9 回 ) SOV 方法が異なる 3 区 ( 対照区試験区 1

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おさむながだき
5 years ago
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1 過剰排卵処置における卵胞発育および排卵時間と雌雄選別精液を用いたホルスタイン種経産牛の採胚成績堀川明彦小林崇之近藤守人要約雌雄選別精液を用いたホルスタイン種経産牛の採胚成績の改善を目的に異なる過剰排卵処置 (SOV) を実施しその卵胞動態と採胚成績との関係を検討した試験区 1は卵胞刺激ホルモン (FSH) 総量 30AUを3 日間試験区 2および試験区 3は4 日間の漸減投与としたまた試験区 2と試験区 3でFSH 投与開始からPGF2α 投与と膣内留置型ホルモン製剤を除去する時期について検討した人工授精 (AI) は試験区 1と試験区 2は2 回 ( 発情確認日の夕刻に体部注入翌日朝方に子宮角深部注入 ) 試験区 3は1 回 ( 発情確認日の翌日朝方に子宮角深部注入 ) を行った性腺刺激ホルモン放出ホルモン剤 (GnRH) 投与時の卵胞発育を比較したところ試験区 1と比較して試験区 2および試験区 3で直径 8mm 以上の卵胞が多数観察された GnRH 投与後の卵胞動態を調査したところ試験区 2と比較して試験区 3でGnRH 投与 26 時間以降の排卵集中が認められた採胚成績を比較したところ試験区 3で移植可能胚率が高く未受精卵率が低かったこれらの結果から 4 日間のFSH 投与によってGnRH 投与までの卵胞発育を促進し GnRH 投与 26 時間以降に子宮角深部注入によるAIを行うことで採胚成績の改善に繋がる可能性が示唆されたキーワード : 雌雄選別精液子宮角深部注入過剰排卵処置ホルスタイン種経産牛 Ⅰ 緒言受精卵の雌雄判別技術は優良後継牛の安定確保ができ経産牛の更新計画が立てやすくなることから酪農および肉用牛経営の生産性の効率化と低コスト化に繋がる有益な技術であるフローサイトメーターで選別された雌雄選別精液 ( 選別精液 ) を用いることで人工授精 (AI) により雌産子を生産することが可能となりその過剰排卵処置 (SOV) への活用が期待されているしかし選別精液を用いた経産牛の SOV では移植可能胚率が低い傾向にあり雌胚生産効率およびコストの面からも未経産牛での活用が提案されている (Hayakawa et al., 2009) 選別精液は封入精子数が少なく選別によるダメージによって凍結融解後の精子活力が低下しているこの欠点を補うため AI を子宮角深部注入で行う方法が検討されている ( 砂川, 2012) 当場でも SOV 後の発情確認日の夕刻に子宮角深部注入を行いその有効性を検討したが通常の体部注入と比較して移植可能胚率は低い結果であった ( 堀川ら, 2012) 雌雄選別精液は精子活力の低下に加えて受精能獲得と維持の時間も異なるといわれている (Moce et al., 2006; Blondin et al., 2009) 選別精液を用いた採胚成績を改善するためには排卵後の卵子の受精率を向上させる SOV 条件を検討すること SOV において排卵が集中する時期を特定し適期に深部注入による AI を行うことが有効と考えられるそこで本試験では異なる SOV を実施した供胚牛の卵胞動態を調査し採胚成績との関係を検討した -

2 Ⅱ 材料および方法 1. 供胚牛福井県内の酪農家 19 戸で飼養されているホルスタイン種経産牛の中から 4 産以上分娩しかつ産乳能力が高い上位 3 頭 ( 平均産歴 4.7 産 ) を選抜した供胚牛 3 頭を 3 反復し ( 延べ 9 回 ) SOV 方法が異なる 3 区 ( 対照区試験区 1 および試験区 2) でそれぞれ 1 回ずつ供試した 2.SOV 近年生体内卵子吸引 (OPU) と体外受精 (IVF) を組み合わせた効率的な雌胚生産系の構築を目的に効率的に成熟卵子を得るための SOV 方法が検討されてきた ( 的場ら, 2012) 本試験ではこれらの結果を参考に卵胞刺激ホルモン剤 (FSH) 投与日数と PGF2α(PG) 投与および腟内留置型黄体ホルモン製剤 (CIDR) 除去の時期を調整した 3 区の SOV 方法を検討した ( 図 1) 発情周期において直径 5mm 以下の小卵胞が多数観察される時期に CIDR( 家畜改良事業団 ) を挿入し超音波画像診断装置 HS-1500( アロカ ) で卵巣を観察のうえ優勢卵胞を除去した CIDR 挿入日を SOV 開始 0 日目とし試験区 1 は 2 日目朝方から FSH( アントリン R10 川崎三鷹製薬 ) 総量 30AU を 3 日間試験区 2 は 4 日間試験区 3 は夕刻から 4 日間漸減投与した試験区 1 は 4 日目朝方に PG( クロプロステノールエストラメイトナガセ医薬品 )650μg 投与と CIDR 除去を行い試験区 2 と 3 は 4 日目夕刻に PG 投与 5 日目朝方に CIDR 除去を行った各試験区とも 6 日目朝方に性腺刺激ホルモン放出ホルモン剤 (GnRH 酢酸フェルチレリンコンセラールナガセ医薬品 )200μg を投与した 4.AI および採胚試験区 1 および試験区 2 ではスタンディング発情を確認した同日の夕刻 (GnRH 投与 8 時間後 ) と翌日の朝方 (GnRH 投与時間後 ) に AI を計 2 回実施した雌雄選別精液は採卵用 Sort90( 家畜改良事業団 ) を使用した初回の AI では 1 本の精液を使用し人工授精用シース管 ( 富士平工業 ) を用いて子宮体部に注入した 2 回目の AI では砂川 (2012) の手法に従い 0.5ml ストロー用に改変した動物用受精卵注入カテーテル ( モ 4 号ミサワ医科工業 ) を使用し左右の子宮角深部に精液を 1 本ずつ注入した試験区 3 では発情確認日の翌日朝方にのみ左右の子宮角深部に精液を 1 本ずつ注入した AI 後 7 日目に採胚を行い回収された胚数および胚の品質を調査した胚の品質は家畜人工授精講習会テキスト ( 日本家畜人工授精師協会 1996) の基準に従って評価した回収された桑実胚から拡張胚盤胞期胚を A A B C D の 5 段階で評価し C ランク以上のものを正常胚 B ランク以上のものを移植可能胚 D ランク以下を変性胚として分類した 3. 卵胞動態の観察卵胞動態の観察は 7.5MHz のリニア式プローブを接続した超音波画像診断装置を使用し左右の卵巣で観察された卵胞数と卵胞の最長径を測定した SOV 開始から GnRH 投与までは 1 日毎に観察した GnRH 投与 24~32 時間後までは 2 時間毎の間隔で観察し卵巣画像上で明瞭な卵胞像が確認できなくなったもの消失したものを排卵と判断し GnRH 投与 32 時間後までに残存していた直径 8mm 以上の卵胞数を測定した図 1 SOV 方法

Ⅲ 結試験区 1 試験区 2 および試験区 3 の方法で SOV を行い GnRH 投与時に観察された卵胞数と卵胞サイズを計測した ( 図 2) 観察された直径 5mm 以上の卵胞を直径 5~8mm または直径 8mm 以上に分類して比較した ( 表 1) 観察された直径 5mm 以上の卵胞のうち直径 8mm 未満の卵胞数は試験区 1 が 12.0 個試験区 2 が 7.

4% であり試験区 2 が最も低かった回収した胚を発生ステージ別に分類した ( 表 4) 試験区 1 からは初期胚盤胞期胚 1 個胚盤胞期胚 4 個拡張胚盤胞期胚 1 個を回収した試験区 2 からは拡張胚盤胞期胚 4 個を回収した試験区 3 からは後期桑実胚 2 個胚盤胞期胚 7 個拡張胚盤胞期胚 4 個を回収した図 2 GnRH 投与時の卵胞サイズの比較表 1 GnRH

3 Ⅲ 結試験区 1 試験区 2 および試験区 3 の方法で SOV を行い GnRH 投与時に観察された卵胞数と卵胞サイズを計測した ( 図 2) 観察された直径 5mm 以上の卵胞を直径 5~8mm または直径 8mm 以上に分類して比較した ( 表 1) 観察された直径 5mm 以上の卵胞のうち直径 8mm 未満の卵胞数は試験区 1 が 12.0 個試験区 2 が 7.0 個試験区 3 が 10.3 個であり試験区 1 が最も多かった直径 8mm 以上の卵胞数は試験区 1 が 9.7 個試験区 2 が 17.7 個試験区 3 が 15.3 個であり試験区 2 が最も多かった果は試験区 1 で 70.8% 試験区 2 で 53.8% 試験区 3 で 44.4% であり試験区 2 が最も低かった回収した胚を発生ステージ別に分類した ( 表 4) 試験区 1 からは初期胚盤胞期胚 1 個胚盤胞期胚 4 個拡張胚盤胞期胚 1 個を回収した試験区 2 からは拡張胚盤胞期胚 4 個を回収した試験区 3 からは後期桑実胚 2 個胚盤胞期胚 7 個拡張胚盤胞期胚 4 個を回収した図 2 GnRH 投与時の卵胞サイズの比較表 1 GnRH 投与時の卵胞数の比較区頭数平均卵胞数 5mm < 8mm 8mm 試験区試験区試験区 GnRH 投与時間後の卵胞動態を経時的に観察し残存卵胞数を調査した ( 図 3 表 2) GnRH 投与 26 時間後に観察された卵胞数は試験区 2 が 14.3 個試験区 3 が 17.7 個であった GnRH 投与 32 時間後に観察された卵胞数は試験区 2 が 7.7 個試験区 3 が 6.0 個であった残存卵胞率を比較したところ試験区 2 が 53.5% 試験区 3 が 34.0% であり試験区 3 で低かった採胚結果を表 3 に示した供胚牛 3 頭の平均回収卵数は試験区 1 で 8.0 個試験区 2 で 4.3 個試験区 3 で 12.0 個であった平均移植可能胚率は試験区 1 で 25.0% 試験区 2 で 30.8% 試験区 3 で 36.1% であり試験区 3 が最も高かった平均未受精卵率図 3 GnRH 投与時の卵胞動態 ( 供胚牛 X) * 排卵が認められた卵胞を点線で示す表 2 GnRH 投与後の残存卵胞数の比較 GnRH 投与後の平均卵胞数区 ( 頭数 ) 残存卵胞率 (%:b/a) 試験区 2 試験区 3 (3) (3) 26 時間後 (a) 時間後時間後時間後 (b) Ⅳ 考察牛の定時 AI プロトコールにおいて排卵誘起で用いられる GnRH は卵胞サイズが小さい時期に投与すると受胎率を低下させることが報告されている (Perry et al., 2005) そのため SOV を実施した

4 表 3 採胚成績区頭数回収卵数 A A' B C D 未受精卵平均回収卵数 (a) 平均移植可能胚数 (b) 移植可能胚率 (%:b/a) 平均未受精卵数 (c) 未受精卵率 (%:c/a) 試験区試験区試験区表 4 回収した移植可能胚のステージ区頭数桑実胚後期桑実胚初期胚盤胞期胚胚盤胞期胚拡張胚盤胞期胚試験区試験区試験区計供胚牛の卵胞サイズが小さい時期に GnRH を投与することは強制的な排卵を促し採胚成績を低下させる要因になると考えられる本試験において SOV を実施した供胚牛の GnRH 投与時の卵胞数と卵胞サイズを調査したところ試験区 1 と比較して試験区 2 および試験区 3 では観察された直径 5mm 以上の卵胞のうち半数以上の卵胞が直径 8mm 以上に発育していた ( 試験区 1: 9.7/21.7 試験区 2: 17.7/24.7 試験区 3: 15.3/25.7) 卵胞は直径 8 10mm にまで発育すると FSH から黄体形成ホルモン (LH) 依存性に移行して排卵に至るが卵胞の発育を促す LH のパルス分泌は血中黄体ホルモン (P4) により制御されている (Ginther et al., 1997; Kojima et al., 2003) 試験区 2 および試験区 3 の SOV では FSH を 4 日間の漸減投与としており PG 投与以降の低 P4 レベル条件において発育の速い卵胞は LH 依存性へ移行し発育の遅い卵胞に FSH の作用が促されたことによってより多くの卵胞発育が促進された可能性が考えられる Ambrose ら (2008) は CIDR を活用した定時 AI プロトコールを検討したところ PG 投与および CIDR 除去の時期を調整することで受胎性を向上できる可能性があると報告している本試験では CIDR 除去の時期を調整し試験区 1 では GnRH 投与 48 時間前に試験区 2 および試験区 3 では GnRH 投与 24 時間前に除去した採胚試験の結果試験区 1 と比較して試験区 2 および試験区 3 で移植可能胚率が高かった ( 対照区 :25.0% 試験区 1:30.8% 試験区 2:36.1%) このことから CIDR 除去から GnRH までの期間の短縮が採胚成績の改善に有効である可能性が考えられる P4 レベル低下の時期とエストラジオール (E2) 及び LH 濃度の推移との関係を調査し卵胞の成熟と排卵前の卵子の品質にどのような影響を及ぼしているのか今後検討する必要がある本試験では SOV における PG 投与と CIDR 除去の時期が GnRH 投与後の供胚牛の卵胞動態に及ぼす影響を調査した GnRH 投与時間後の卵胞動態を試験区 2 と試験区 3 で比較したところ試験区 3 で排卵が集中していた試験区 2 の卵胞動態を調査したところ SOV 開始 4 日目の朝方 (5 回目の FSH 投与時 ) に 8mm 以上の卵胞が観察されておりこの時点から LH 依存性の卵胞が存在していたことが推察される試験区 2 ではその後 6 回目の FSH 投与と同時に PG を投与し翌日朝方に CIDR を除去した一方試験区 3 では直径 8mm の卵胞が観察された SOV 開始 4 日目夕刻 (5 回目の FSH 投与時 ) に PG を投与し翌日朝方に CIDR を除去した試験区 3 では直径 8mm 以上の卵胞の出現から早い段階で血中 P4 濃度を下げる処置を行ったことで成熟卵胞への発育が促進され GnRH 投与時間後の排卵の集中に繋がった可能性が考えられる卵胞の発育に伴い分泌される E2 が試験区 2 と試験区 3 の SOV でそれぞれどのように推移し供胚牛の排卵を誘起する LH サージに影響を及ぼしているのか今後調査する必要がある

5 GnRH 投与後の卵胞動態を観察したところ多くの卵胞の排卵は GnRH 投与 26 時間以降に認められたまた試験区 2 と 3 の採胚成績を比較したところ試験区 3 で移植可能胚率が高かった ( 試験区 2:30.8% 試験区 3:33.3%) 試験区 3 では胚盤胞期胚が 7 個拡張胚盤胞期胚が 4 個回収されていることから深部注入による AI は排卵が開始する GnRH 投与 26 時間以降に行うことが適しておりそれ以前の AI は採胚成績を改善しないことが推察された以上のことから 4 日間の FSH 投与によって GnRH 投与までの卵胞発育を促進し GnRH 投与 26 時間以降に深部注入による AI を行うことで選別精液を用いたホルスタイン種経産牛の採胚成績を改善する可能性が示唆された SOV は供卵牛によって反応性の差が大きいため採卵成績に個体差が生じることが指摘されている本試験でも試験区間で平均回収卵数にバラつきが認められたことからさらに例数を増やし今回検討した SOV 方法の有効性を継続して調査する必要がある文献 Ambrose, D. J., D. G. Emmanuel, M. G. Colazo and J. P. Kastelic. Pregnancy rates to timed artificial insemination in Holstein heifers given prostaglandin F2alpha twenty-four hours before or concurrent with removal of an intravaginal progesterone-releasing insert. J Dairy Sci, 91(7): Ginther, O. J., K. Kot, L. J. Kulick and M. C. Wiltbank. Emergence and deviation of follicles during the development of follicular waves in cattle. Theriogenology, 48(1): 砂川政弘. 牛性選別精液を用いた人工授精 : 子宮角深部注入の取り組み. 日本胚移植学雑誌, 34(2): Kojima, F. N., E. G. Bergfeld, M. E. Wehrman, A. S. Cupp, K. E. Fike, D. V. Mariscal-Aguayo, T. Sanchez-Torres, M. Garcia-Winder, D. T. Clopton, A. J. Roberts and J. E. Kinder. Frequency of luteinizing hormone pulses in cattle influences duration of persistence of dominant ovarian follicles, follicular fluid concentrations of steroids, and activity of insulin-like growth factor binding proteins. Anim Reprod Sci, 77(3-4): 日本家畜人工授精師協会. 家畜人工授精講習会テキスト. 日本家畜人工授精師協会, 東京, Blondin P, Beaulieu M, Fournier V, Morin N, Crawford L, Madan P, King WA. Analysis of bovine sexed sperm for IVF from sorting to the embryo. Theriogenology, 71: Hayakawa, H., T. Hirai, A. Takimoto, A. Ideta and Y. Aoyagi. Superovulation and embryo transfer in Holstein cattle using sexed sperm. Theriogenology, 71(1): 堀川明彦小林崇之近藤守人. 雌雄選別精液の子宮角深部注入が過剰排卵処置したホルスタイン種経産牛の採卵成績に及ぼす影響. 福井県畜産試験場研究報告, 25: Perry, G. A., M. F. Smith, M. C. Lucy, J. A. Green, T. E. Parks, M. D. MacNeil, A. J. Roberts and T. W. Geary. Relationship between follicle size at insemination and pregnancy success. Proc Natl Acad Scu U S A, 102(14): 的場理子吉岡一相川芳雄大竹正樹小林修司松田秀雄堀口英司橋谷田豊長井誠今井敬. 多排卵処置後に採取した体内成熟卵子または無処置で採取した卵子と性選別雌精液を用いた体外受精によるウシ胚生産. 日本胚移植学雑誌, 34(1): Moce E, Graham JK, Schenk JL. Effect of sex-sorting on the ability of fresh and cryopreserved bull sperm to undergo an acrosome reaction. Theriogenology, 66:

6 The effect of growth state and different timing of PG treatment and CIDR removal on embryo production in superovulated Holstein cows using X-sorted sperm (Sort90) Akihiko HORIKAWA, Takayuki KOBAYASHI and Morito KONDO Fukui Prefectural Livestock Experiment Station Abstract To investigate the effect of growth state of follicle and different timing of PGF2 alpha (PG) treatment and controlled internal drug release device (CIDR) removal on the production efficiency of female transferable embryo in multiparaous (4 ) Holstein cows, three protocols of superovulation were carried out with X-sorted sperm. 30 A.U of FSH was injected over three days in protocol 1, whereas that was injected over four days in protocol 2 and protocol 3. PG treatment concurrent with CIDR removal was done in protocol 1, whereas PG treatment followed by CIDR removal (16h later) was done in protocol 2 and protocol 3. AI was performed twice in protocol 1 and protocol 2: Donors were inseminated into uterine body with one Sort90 at 7-8h after GnRH treatment and uterine horn with two Sort90 at 24-26h after GnRH treatment. AI was performed once into uterine horn at 24-26h after GnRH treatment in protocol 3. Ovarian follicle growth and ovulation was observed by transrectal ultrasonography. In protocol 2 and protocol 3, the number of follicle 8mm in diameter was higher than in protocol 1 at the time of GnRH treatment. Compared with protocol 2, the rate of ovulation at hour after GnRH treatment was higher in protocol 3 in which PG was injected immediately after growing follicle 8mm in diameter. The rate of fertilized transferable embryo was higher in protocol 3 than other two protocols. These results indicate the benefical effect of four days treatment of FSH and short interval from CIDR removal to GnRH treatment for follicle maturation. Furthermore, PG treatment followed by CIDR removal in combination with uterine horn AI with two Sort90 at 26h after GnRH treatment may be suitable for efficient production of female transferable embryo in superovulated Holstein cows. Key word:x-sorted sperm, uterine horn, superovulation, Holstein cow

表 1 過剰排卵処置スケジュール日処置内容 AM E2:2mg CIDR 挿入 FSH:6AU FSH:5AU FSH:4AU PG:625μ g CIDR 抜去 PM FSH:6AU FSH:5AU FSH:4AU AI(1 回目 )* GnRH:200μ g A

表 1 過剰排卵処置スケジュール日処置内容 AM E2:2mg CIDR 挿入 FSH:6AU FSH:5AU FSH:4AU PG:625μ g CIDR 抜去 PM FSH:6AU FSH:5AU FSH:4AU AI(1 回目 )* GnRH:200μ g A 雌雄選別精液の子宮角深部注入が過剰排卵処置したホルスタイン種経産牛の採卵成績に及ぼす影響堀川明彦小林崇之近藤守人要約ホルスタイン種経産牛から効率的に雌受精卵を生産するために過剰排卵処置 (SOV) の人工授精 (AI) に雌雄選別精液を用い採卵成績を検討した SOV 後のAIは発情確認日 ( 初回 ) と翌日 (2 回目 ) に行った初回のAIは対照区では子宮体部注入を行い試験区では子宮角深部注入を行った