703 Kekkaku Vol. 85, No. 9 : 703_709, 2010 Line Probe Assay による Rifampicin 耐性遺伝子検査の 有用性 患者喀痰を供試しての検討 稲垣 1, 6 森山 1, 3, 4 孝行 誠 八木 哲也 3 打矢 恵一 5 市川 和哉 3 二
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- みがね なみこし
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1 73 Kekkaku Vol. 85, No. 9 : 73_79, Line Probe Assay による Rifampicin 耐性遺伝子検査の 有用性 患者喀痰を供試しての検討 稲垣, 森山, 3, 4 孝行 誠 八木 哲也 3 打矢 恵一 5 市川 和哉 3 二改 俊章,, 中川 拓 小川 賢二 要旨 緒言 薬剤耐性結核の蔓延防止は 臨床上重要な課題である そこで 早期に RFP 耐性を検 出できる結核菌群 RFP 耐性遺伝子同定キット ジェノスカラー Rif TB を用いて その臨床的有用 性についての検討を行った 方法 肺結核症と確定診断された患者喀痰 検体を用いて AutoLiPA を用いた ジェノスカラー Rif TB を実施し RFP に対する感受性の判定を行い 塗抹検査 および培養検査結果による検出感度の違いを検討した また培養陽性検体は MGIT を用いた薬剤感 受性検査と比較した 結果 塗抹陽性検体は 73 検体中 9 検体で LiPA 陽性であった 感度 94.5 % 塗抹陰性検体は 37 検体中 5 検体で LiPA 陽性であった 感度 7..% 培養陰性検体や培養 困難な検体であっても 半数以上の検体で LiPA 陽性であった 培養陽性となった 7 検体を薬剤感受 性検査と比較したところ RFP 感受性株ではすべての検体で野生型を示したのに対し RFP 耐性株で は 8 検体中 検体で変異型を示した また 変異型を示した検体はすべて多剤耐性結核であった 考察 本検査法は喀痰塗抹陽性度が LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出を決定する要因の一つになる と考えられた また培養陰性検体や培養困難な検体でも検出可能であり RFP 耐性および多剤耐性結 核患者をより迅速に発見できると考えられた キーワーズ 多剤耐性結核 rifampicin Line Probe Assay rpob 遺伝子 塗抹検査 培養検査 緒 結核菌の薬剤感受性検査は 主に薬剤含有培地による 言 ものであり 結果が得られるまでに数週間から数カ月の 今日における結核短期化学療法は isoniazid INH と 時間を要している5) そのため 検査結果を初期治療に rifampicin RFP を 中 心 と し て ethambutol や pyrazin- 役立てることや早期の蔓延防止対策は困難であるため amide などを加えた多剤併用療法が行われている し より迅速に薬剤耐性の有無を検出する方法が求められて かし近年では この化学療法において必須の抗菌薬であ いる 結核菌の薬剤感受性検査の結果を迅速に得る手段 るINHとRFPの両薬剤に耐性を示す多剤耐性結核 Multi- としては 耐性遺伝子変異の検出により表現型としての drug resistant tuberculosis : MDR-TB が世界的に問題と 耐性を推定する方法が挙げられている ) なっている WHO の調査では 年に世界 85 カ国 耐性結核菌は ゲノム DNA の突然変異により生じる における初回多剤耐性率が 3.% 既治療多剤耐性率が が 通常 つの薬剤に対して複数の耐性遺伝子が関与し 9.3% 全体での多剤耐性率が 4.8% であった ) 同年の ている 例えば INH 耐性菌は 5% 程度が katg の変異 日本における多剤耐性率は およそ.3% 程度であった であり 残りが inha などの遺伝子の変異により薬剤耐 と報告されている また 多剤耐性結核は 感受性結 性が生じる) 一方 RFP 耐性菌は Telenti ら7) により 3) 核に比べて治療が困難となるケースが多く 治療成功率 RFP 耐性株 株中 4 株で RNA polymerase subunit βをコ はおよそ 7% 程度である4) ードしている rpob 遺伝子の 5 番目から 533 番目の 3 個 独立行政法人国立病院機構東名古屋病院臨床研究部 同呼吸 器科 3 名城大学薬学部微生物学研究室 4 高山赤十字病院薬剤 部 5 名古屋大学医学部付属病院中央感染制御部 独立行政法 人国立病院機構名古屋医療センター薬剤科 連絡先 小川賢二 独立行政法人国立病院機構東名古屋病院臨 床研究部/呼吸器科 45 _ 8 愛知県名古屋市名東区梅森 坂 5 _ ogawak toumei.hosp.go.jp Received 5 Mar. / Accepted Jun.
2 結核 第 85 巻 第 9 号 年 9 月 74 のアミノ酸 9 bp 領域の変異があったと報告してい 出感度について比較した 判定には 培養陽性になるま る その後 Kapur ら8) により 9 bp のコア領域の外側 での期間の違いを 週間ごとに区分し 週間経過して の変異が報告され 現在では 57 番目から 533 番目の 7 も増菌が見られない場合は培養陰性とした 個のアミノ酸 8 bp コア領域をホットスポット領域 また 培養陽性検体については BACTEC MGIT 9 としている RFP 耐性株の約 95% がこの領域の変異の AST 結核菌薬剤感受性検査用ミジットシリーズ により ため 遺伝子による RFP 耐性検査が可能である) ) さ RFP および INH に対する感受性の判定を行い LiPA の らに Traore ら は RFP 耐性菌の 9% が INH 耐性菌で RFP 感受性の判定と比較した あったと報告している 従って rpob 遺伝子中のコア 3. DNA の抽出 9) ) 領域の変異を検出することは 早期の適切な治療や多剤 前処理後の検体は 各検査で使用した後 残りの全量 耐性結核のスクリーニングが可能となり 臨床的にはき を, rpm で 5 分間遠心し 上清を捨て TE [ mm わめて有用な検査法である Tris-HCl (ph 8.) - mm EDTA (ph 8.)] buffer を μl 結核菌群 RFP 耐性遺伝子同定キット ジェノスカラー 加えた その後 再度, rpm で 5 分遠心し 上清を Rif TB は リバースハイブリダイゼーション法を用 捨て TE buffer を 5μL 加え よく混和した後 95 で いて Line Probe Assay LiPA により 結核菌群の鑑別 3 分間加熱し 3 分間凍結して DNA の抽出を行った と rpob 遺伝子中のホットスポット領域の変異を喀痰か また 新規入院患者からの喀痰検体に対しては さらに ら直接検出できるキットである 本法を用いることによ 前処理後の検体 μl について AMPLICOR respiratory り 約 日で RFP に対する感受性を判定することが可能 specimen preparation kit を用いてマニュアルに従い DNA である3) しかし 本検査法を実施している施設が少な の抽出を行った それぞれの DNA 抽出液は, rpm いため 喀痰からの直接検出による信頼性の評価が十分 で 3 分間遠心した後 増幅に使用した になされていない現状がある そこで本研究では 4) 5) ジェノスカラー RifTB を用い その臨床的有用性 について検討した 実験材料および方法 使用検体 使用検体は 独立行政法人国立病院機構東名古屋病院 4. Line Probe Assay DNA 抽出液 5μL をジェノスカラー Rif TB 増幅試薬キ ット A outer primer を含む を用いて PCR による増幅 を行った後 その産物 μl をジェノスカラー RifTB 増 幅試薬キット B inner primer を含む を用いて再度 PCR を行い LiPA 検体とした 得られた LiPA 検体に対し ア ガロースゲルにて電気泳動後 増幅の確認を行った そ において肺結核症と確定診断された新規入院患者からの の後 Auto-LiPA を用いた ジェノスカラー RifTB 喀痰 5 検体 8 年 月 5 月 および結核病棟に既 を実施し LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出感度 およ 入院中の患者からの喀痰 検体 8 年 月 4 月 び RFP に対する感受性の判定を行った を用いた 採痰は 患者 人につき 回行った 喀痰検 ジェノスカラー RifTB は ビオチン化して増幅 体は 喀痰溶解酵素 スプタザイム で溶解および均一 化した検体を N _ アセチル _ L _ システイン 水酸化ナト した rpob 遺伝子をストリップ上の結核菌群特異的プロ ーブ TB および 5 種類の野生型プローブ S S5 リウム NALC-NaOH 法により前処理を行い 各検査 と RFP 耐性結核菌に見られる rpob 遺伝子変異に対応す に使用した る 4 種類の変異型プローブ R R4a R4b R5 にハイ 実験方法 ブリダイズさせ 塩基配列が一致したプローブに LiPA. 結核菌塗抹検査 検体が結合する ストリップを洗浄後 アルカリフォス 塗抹検査については 年に発表された結核菌検 ファターゼ標識ストレプトアビジンを結合させ 基質を 査指針に基づき 蛍光法を用いて染色した 判定には簡 加え発色させる 検体の DNA 配列が野生型の場合 5 本 易法にて 3 ガフキー 号以上 ガフキー 3 の野生型プローブの発色が見られれば RFP 感受性と判 5 号 ガフキー 号 ± ガフキー 号 定する 変異が存在する場合は 相当する野生型プロー ガフキー 号 菌陰性 に区分し判定を行い 塗抹 ブに発色が見られず RFP 耐性と判定する また 変異 検査での陽性度と LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出感 型プローブに該当する変異の場合 R プローブが発色す 度について比較した る 従って 結核菌群特異的プローブ および 5 種類の. MGIT による結核菌培養検査および薬剤感受性検査 野生型プローブに発色が見られた場合は野生型 Wild 培 養 検 査 に つ い て は Mycobacteria growth indicator type : WT と判定した 結核菌群特異的プローブ およ tube MGIT /BACTEC MGIT 9 システム ) により培 び 4 種類の野生型プローブのみに発色が見られた場合 養を行い 培養期間と LiPA による RFP 耐性遺伝子の検 もしくは対応する変異型プローブに発色が見られた場合
3 75 Rapid Detection of TB / T. Inagaki et al. は変異型 S S5 R R4a R4b R5 と判定した Fig. 73 検体中 9 検体で LiPA 陽性であった 感度 94.5% また 塗抹陰性であった 37 検体中 5 検体で LiPA 陽性で あった 感度 7.% 5. rpob 遺伝子変異領域のシーケンス解析 判定が困難となった検体など合計 4 検体に対して シ 培養期間の違いと LiPA 判定結果の相関性 ーケンス解析用プライマー IP- IP- を用いて rpob 培養期間の違いと LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出 遺伝子変異領域のシーケンス解析を行った 得られたデ 結果を Table に示した 培養陽性であった 7 検体中 ータはNCBI http// による BLAST LiPA 陽性検体が 8 検体 感度 89.5% LiPA 陰性検体 解析を行い データベースと比較した が 8 検体であった 培養陰性の 9 検体中 3 検体が LiPA 陽性 感度 79.3% であり 汚染により培養困難な検 実験結果 体 5 検体中 3 検体が LiPA 陽性であった 塗抹検査で判定された陽性度と LiPA 判定結果の 3 DNA の抽出方法の違いによる LiPA 判定結果に対 相関性 する影響 塗抹検査で判定された陽性度と LiPA による RFP 耐性 TE buffer を用いて DNA 抽出した場合 5 検体中 4 検 遺伝子の検出結果を Table に示した 新規入院患者か 体で LiPA 陽性であった 一方 PCR 同定検査で用いら らの喀痰 5 検体 および結核病棟に既入院中の患者か れ る AMPLICOR respiratory specimen preparation kit に よ らの喀痰 検体計 検体のうち 塗抹陽性であった る DNA 抽出液を用いた場合 5 検体中 44 検体で LiPA WT S S R S3 S4 R4a R4b S5 R5 TB S S S3 S4 S5 R R4a R4b R5 Fig. Representative hybridization patterns obtained with line probe strips. The TB line (TB) is a specific probe for M. tuberculosis complex. Nine probes (S to S5, R, R4a, R4b and R5) were designed to detect nucleotide changes in the relevant part of rpob. The S probes exclusively hybridize to the wild-type sequence. The R probes hybridize with amplicons carrying the respective mutations. According to the reactivities of the probes, common LiPA patterns can be expected for M.tuberculosis complex strains. If all R probes are negative and all S probes are positive, a wild-type sequence is present (WT). When one of the S probes is missing and no R probe hybridizes, this pattern is indicated with a preceding the missing probe (e.g., S). If one of the S probes is negative and the corresponding R probe is positive, the pattern is defined according to the R probe observed (e.g., R). Occasionally, deviating patterns may be observed, as outlined in the text. Table Detection of mycobacteria by fluorochrome stain microscopy and LiPA for sputum samples Smear examination LiPA test Total Positive Negative 3 ±
4 結核 第 85 巻 第 9 号 年 9 月 7 陽性であった 異なる DNA の抽出方法による検出感度 で増幅が認められた 検体 No.83 について rpob 遺 について McNemar 検定の結果 有意な差はなかった χ.5 ; P. 伝子変異領域のシーケンス解析を行った BLAST 解析 の結果 Neisseria meningitidis 基準株と最も相同性が高 4 LiPA による RFP 耐性遺伝子検査と MGIT を用い く 93% の一致率であった た薬剤感受性検査の結果の比較 考 新規入院患者からの 45 検体 および培養陽性となっ 察 た結核病棟に既入院中の患者からの 3 検体 合計 7 検 本研究では 確定診断された結核患者からの喀痰 体について LiPA での RFP 感受性の判定結果と MGIT 検体から LiPA による RFP 耐性遺伝子の迅速検出法に による薬剤感受性検査を Table 3 に示した RFP 感受性 ついて その臨床的有用性の検討を行った RFP の作用 株 8 検体中 検体が野生型を示した 残りの 検体は 機序は 結核菌の RNA polymerase subunit βに結合し 喀痰からの DNA 抽出で検出されなかったが 培養後に RNA 鎖形成の開始を阻害する 約 95% の RFP 耐性菌は 培養菌液からの DNA 抽出をしたところ すべての検体 この RNA polymerase subunit βをコードする rpob 遺伝子 で野生型を示した 一方 RFP 耐性株 8 検体中 検体で 中のホットスポット領域に変異が認められ 感受性菌に 変異型を示した 変異のパターンは それぞれ S 変 は変異が認められていないことが報告されている) 異型が 3 検体 R 変異型が 検体 R5 変異型が 検体 病院施設内の細菌検査室で LiPA を実施する場合 検 であった 残りの 検体のうち No.9 は プローブ S と 体提出から約 日以内に行われる そのため 塗抹検査 R の両方に発色が見られた No. は プローブ S5 の結果のみで実施に適した検体であるか確認する必要が R4a R4b に弱い発色を呈した そのため この 検体 ある 塗抹陽性検体では感度が 94.5% 塗抹陰性検体で は 感受性もしくは耐性の判定が困難であった 以上よ は感度 7.% であった つまり 塗抹検査により目視で り 感度 75.% 特異度 9.% 一致率 89.5% であった 菌が確認できない喀痰を検査材料として用いた場合に 5 LiPA での判定困難であった検体に対するシーケ は 感度が著しく低下した 従って 塗抹検査の陽性度 ンス解析の結果 が LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出を決定する要因の 判定が困難であった 検体 No.9とNo. について 一つになると考えられた rpob 遺伝子変異領域のシーケンス解析を行った No.9 従来の薬剤感受性検査は 培養陽性検体のみ実施する の場合は rpob 遺伝子の塩基配列中の 5 番目のコドン ことが可能だが 一般細菌汚染による検体や塗抹陽性だ における塩基が 種類以上混在していたため シーケン が培養陰性となる検体などでは 感受性の判定を行うこ ス解析による判定ができなかった gac gnc No. とができない 一方 これらの薬剤感受性検査を実施で の場合は rpob 遺伝子の塩基配列中の 533 番目のコドン きない検体に対しても LiPA は 培養陰性検体の 79.3% における塩基の変異が認められた ctg ccg 培養困難な検体 5 検体中 3 検体で RFP 感受性の判定が可 LiPA 陰性となったが ジェノスカラーで用いる 能であった ただし 培養陽性でも.5% の検体で LiPA PCR で増幅が認められた 検体の検討 による RFP 感受性の判定ができなかった 従って LiPA を用いた遺伝子検査は 従来の薬剤感受性検査を実施で LiPA 陰性となったが ジェノスカラーで用いる PCR Table LiPA and culture results for sputum samples Culture positive LiPA test Positive Negative Total Table 3 week weeks 3 weeks 4 weeks Culture negative weeks Contamination Comparison of the results of LiPA with the in vitro susceptibility test by MGIT Susceptibility (n) RFP-sensitive RFP-resistant Total *Sample Nos. 9 and. LiPA profile Wild type Mutation type Indeterminant Undetected (8) ( 8) * (7)
5 77 Rapid Detection of TB / T. Inagaki et al. きない検体にも実施できるが 培養陽性検体であっても おいて 症例であるがナイセリア属の髄膜炎起因菌 感受性を判定できなかった検体も少なからず存在するこ N. meningitidis に最も相同性がある PCR 産物が検出さ とから 培養陽性検体であれば 常に薬剤感受性検査を れた N. meningitidis は 健常人でも 5 % 保菌者であ 実施すべきであると考えられた るため 他の検体でもこれら結核菌以外の菌の DNA が DNA の抽出方法により PCR による DNA の増幅に対 増幅される可能性が考えられた ただし今回 相同性が する感度が異なることが知られている そこで PCR 同 93% と低いことから 非特異的な増幅である可能性も考 定検査で用いられた DNA 抽出液と TE buffer による DNA えられた いずれにしても LiPA では 全く検出されな 抽出液を用いて LiPA での検出感度を比較した 各抽出 かった そのため きわめて特異性が高く信頼性がある 方法ともに 増幅できなかった検体が含まれた原因とし 検査法であると考えられた て PCR 同定検査で用いられた DNA 抽出液では サン 以上の結果から 本検査法は 塗抹陽性度によって プル量が少なかったために検出されなかったと考えられ LiPA による RFP 耐性遺伝子の検出感度が異なると考え た また TE buffer による DNA 抽出では 抽出効率が られた また 従来の薬剤感受性検査では 測定するこ 低いため検出されなかったと考えられた しかし 抽出 とができない検体も検出可能であり 特異性が高く 臨 方法の違いによる有意な差が認められなかったことか 床現場では有用な情報となりうると考えられた さらに ら PCR 同定検査で使用した DNA 抽出液を LiPA に用い 多剤耐性結核患者をより迅速に発見でき 早期に適切な ることにより DNA 抽出の手間を省くことができ よ 治療を行うことができると考えられた 従って 本検査 り迅速に判定が可能になると考えられた 法は 新規入院患者における多剤耐性結核のスクリーニ LiPA の感受性の判定結果について 感度 75.% 特異 ングや 既入院中患者での早期に耐性の判定が必要な 度9.% 一致率89.5%であった 感度が低下した原因は 時 培養が困難であった場合などに適用すべきではない 判定が困難な検体 No.9 と No. があった No.9 かと考えられた また カ所の変異や欠損するパター の検体については S と R の両方に発色が見られ シ ンなどの特殊なケースと薬剤感受性検査結果を比較した ーケンス解析結果から 5 番目のコドンの判定ができな データの蓄積や喀痰以外の材料を用いた場合の検出感度 かったため 野生型と変異型の両方が混在していたと考 などが今後検討すべき課題であると考えられた えられた Hillemann ら は 変異型と野生型が混在す 7) 謝 る検体での検出限界は % であったと報告しており 辞 これらの検体では薬剤感受性検査のほうが感度は高かっ 本研究を行うにあたり 多大な御協力をいただきまし たと報告している 一方 Hirano ら は 薬剤感受性検 た宮岡秀和氏をはじめとする独立行政法人国立病院機構 査に比べ 変異型プローブがあることで 変異型と野生 東名古屋病院検査科の皆様に御礼申し上げます また御 型が混在する検体を確認できるため 有用な検査法であ 助言をいただきましたニプロ株式会社 末竹寿紀氏に心 ったと報告している No. の検体については S5 より感謝致します 8) R4a R4b に弱い発色が見られ 533 番目のコドンが変異 文 していた この 533 番目のコドンが変異するとホットス ポット領域の末端に当たる位置のため 非特異的な結合 献 が起こると報告されている3) 9) 従って このようにま 日本結核病学会治療委員会 結核医療の基準 の見 直し 8年. 結核. 8 ; 83 : 59 _ 535. れな判定の結果が起こりうることを考慮しておく必要が World Health Organization : Anti-tuberculosis drug resist- あると考えられた また 喀痰材料からの DNA 抽出で は 検出ができなかった検体が存在したため 特異度が 低下した しかし RFP 感受性株で変異型検体 RFP 耐 ance in the world: Fourth global report. WHO/HTM/TB. 8 ; 豊田恵美子, 川辺芳子, 四元秀毅, 他 多剤および超多 剤耐性結核の全国調査 年. 結核. 8 ; 83 : 773 _ 性株で野生型検体を認められなかったことから 薬剤感 777. 受性との相関性が高い検査法であると考えられた 本研 4 吉山 究におけるすべての変異型検体は 多剤耐性結核であっ た このうち 検体は 新規入院患者から得られた喀痰 であった 従って RFP 耐性のみを判定する本検査法 は 多剤耐性結核患者のスクリーニングをするうえでも 有用な検査法であると考えられた LiPA の結核菌群特異的プローブは この群に対して % 特異性を示すことが報告されている) 本研究に 崇, 尾形英雄, 和田雅子 多剤耐性結核の治療 成績. 結核. 5 ; 8 : 87 _ 阿部千代治, 尾形英雄, 河田兼光, 他 Line Probe Assay LiPA によるリファンピシン耐性結核菌の検出. 結核. ; 75 : 575 _ 58. Sekiguchi J, Miyoshi-Akiyama T, Augustynowicz-Kopec E, et al.: Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 7 ; 45 : 79 _ 9. 7 Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al.: Detection of
6 rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tubercu- losis. Lancet. 993 ; 34 : 47 _ 5. 8 Kapur V, Li LL, Hamrick MR, et al.: Rapid Mycobacterium species assignment and unambiguous identification of mutations associated with antimicrobial resistance in Myco- bacterium tuberculosis by automated DNA sequencing. Arch Pathol Lab Med. 995 ; 9 : 3 _ Musser JM: Antimicrobial agent resistance in mycobac- teria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev. 995 ; 8 : 49 _ 54. Heep M, Brandstätter B, Rieger U, et al.: Frequency of rpob mutations inside and outside the cluster I region in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol. ; 39 : 7 _. Bártfai Z, Somoskövi A, Ködmön C, et al.: Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobac- terium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the line probe assay. J Clin Microbiol. ; 39 : 373 _ Traore H, van Deun A, Shamputa IC, et al.: Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA and rifampin resistance in clinical specimens from tuberculosis patients by line probe assay. J Clin Microbiol. ; 44 : 4384 _ ,,, Line Probe Assay LiPA.. 4 ; 79 : 55 _ Johansen IS, Lundgren B, Sosnovskaja A, et al.: Direct detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens in low- and high-incidence countries by line probe assay. J Clin Microbiol. 3 ; 4 : 4454 _ Somoskovi A, Dormandy J, Mitsani D, et al.: Use of smearpositive samples to assess the PCR-based genotype MTBDR assay for rapid, direct detection of the Mycobacterium tuberculosis complex as well as its resistance to isoniazid and rifampin. J Clin Microbiol. ; 44 : 4459 _ 443. Hanna BA, Ebrahimzadeh A, Elliott LB, et al.: Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 9 system for recovery of mycobacteria. J Clin Microbiol. 999 ; 37 : 748 _ Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, et al.: Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol. 5 ; 43 : 399 _ Hirano K, Abe C, Takahashi M: Mutations in the rpob gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated mostly in Asian countries and their rapid detection by line probe assay. J Clin Microbiol. 999 ; 37 : 3 _. 9 Rossau R, Traore H, De Beenhouwer H, et al.: Evaluation of the INNO-LiPA Rif. TB assay, a reverse hybridization assay for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and its resistance to rifampin. Anti- microb Agents Chemother. 997 ; 4 : 93 _ 98.
7 Rapid Detection of TB/T.Inagaki et al. 79 Original Article CLINICAL APPLICATION OF LINE PROBE ASSAY (LiPA) FOR RIFAMPICIN (RFP)-RESISTANT GENE EXAMINATION IN SPUTUM FROM TUBERCULOSIS PATIENTS, 3, 4 Takayuki INAGAKI, 5 Tetsuya YAGI, Kazuya ICHIKAWA,, Taku NAKAGAWA,, Makoto MORIYAMA, 3 Kei-ichi UCHIYA, 3 Toshiaki NIKAI, and, Kenji OGAWA Abstract [Introduction] Preventing the spread of drugresistant tuberculosis is a clinically important challenge. In this effort, rifampicin (RFP)-resistant gene examination by line probe assay (LiPA) was evaluated for its clinical application for rapid detection of tuberculosis. [Methods] The RFP-resistant gene was examined in a total of samples of sputum obtained from patients that were definitively diagnosed with pulmonary tuberculosis by auto- LiPA. The difference in detection sensitivity between the results of the smear and culture examinations was evaluated. Culture-positive samples were compared with the results of the drug susceptibility test. [Results] Smear-positive samples were LiPA positive in 9 of 73 samples (sensitivity: 94.5%), and smear-negative samples were LiPA positive in 5 of 37 samples (7.%). More than half of the samples were LiPA positive, even those that were culture-negative or contaminated. Comparison of the 7 culture-positive samples with the results of the drug susceptibility test found that all samples were wild type among the RFP-sensitive strains. Among the 8 RFP-resistant strains, were mutation type. All samples shown to be mutation type were obtained from patients with multi-drug resistant tuberculosis. [Discussion] Using LiPA, the amount of smear can be used as a factor for detection of RFP-resistant genes. Detection was possible even with culture-negative and contaminated samples, allowing more rapid diagnosis of patients with multi-drug resistant tuberculosis. Key words: Multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB), Rifampicin, Line Probe Assay, rpob gene, Smear examination, Culture examination Departments of Clinical Research, Pulmonary Medicine, National Hospital Organization Higashinagoya National Hospital, 3 Department of Microbiology, Faculty of Pharmacy, Meijo University, 4 Department of Pharmacy, Takayama Red Cross Hospital, 5 Department of Infectious Diseases, Center of National University Hospital for Infection Control, Nagoya University Hospital, Department of Pharmacy, National Hospital Organization Nagoya Medical Center Correspondence to: Kenji Ogawa, National Hospital Organization Higashinagoya National Hospital, 5 _, Umemorizaka, Meito-ku, Nagoya-shi, Aichi 45 _ 8 Japan. ( ogawak@toumei.hosp.go.jp)
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