放射光第 12 巻第 3 号 (1999 年 ) 生命科学蛋白特集シンクロトロン放射光を使った原子分解能の蛋自質結晶構造解析野中孝昌長岡技術科学大学生物系 * および理化学研究所播磨研究所 Str 阻 cture Analysis 臨 si 盟 g Resol 副 io 目 BioEngi

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うまじちづ
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1 生命科学蛋白特集シンクロトロン放射光を使った原子分解能の蛋自質結晶構造解析野中孝昌長岡技術科学大学生物系 * および理化学研究所播磨研究所 Str 阻 cture Analysis 臨 si 盟 g Resol 副 io 目 BioEngineering, Nagaokα University (RIKEN), protein, atoms, resolution, ing, solve, re 負 ne, はじめに 1978 年, Sakabe らは分子量約 5.8 kda のインスリンの 4 0 Cで測定した1. 2 A 分解能の X 線回折強度データに対して, ブロック対角法による最小二乗法で結晶構造精密化を行った 1, 2) 等方性温度因子が 30A2 以下の原子の異方性温度因子を精密化した結果, 差フーリエ図上で蛋白質の X 線結品構造解析では初めて水素原子を確認することに成功した 1997 年, 塩野らは分子量 14kDa のプロテアーゼ ScNP caesþitosus) の1. 05 A 分解能の X 線田折強度データを用いて, initio に構造を決定することに成功した 3) パターソンサーチで見出した亜鉛原子による位相から出発して, 独自に開発したプログラム LODEM4) によりほとんどの原子位置を決定しうる明瞭な電子密度分布国を得た 1998 年, Harata らは分子量 16kDa の七面鳥ワゾチーム A) と 17kDa のヒトリゾチーム (1. 15 A) の 12 0 C で測定したデータを用いて結晶構造の精密化を行った 5) 分子量 10kDa を越える褒自質としては初めての完全行列最小ニ乗法による精密化であり, 水素原子を除く全原子の異方性温度因子が決定された α 炭素の異方性温度因子を用いて剛体振動解析を行い, 両リゾチームの内部運動を ORTEP 図上に見事に示したこれら日本における atomic ( 一般的な化合物の最短の原子間距離 1. 2 A の分離が可能という意味で Sheldrick が真の意味の atomic resolution と定義している 6) 未だ定まった訳語はないと思われるが, 本稿では原子分解能という訳語を充てることにする ) での X 線結品構造解析に関連する報告には, Dauter らの総説 Proteins resolution"7) から始まる一連の Current biology 誌上に見られる蛋白質の原子分解能の構造解析に関する総説 8.9) に述べられているエッセンスがほぼ全て述べられているといってもよいすなわち, 蛋白質結晶の原子分解能の X 線回折強度データを得ることができれば次のようなことが可能となる非水素原子の異方性温度因子と riding" 水素原子 ( 直接共有結合している非水素原子の位置から立体化学的な理想的位置に配置された水素原子 ) を加味して結品構造の精密化を行えば, 最終的な R 帽 factor が 10% を切ることもあり得る等方的に精密化した場合と比べて, 高角での R 幽 factor が小さいので京子位置の誤差が非常に小さくなる実際, Harata らのリゾチームの座標の誤差は約 0.03 A であり 5), A 分解能程度で精密化された構造の Luzza 綱 * 長岡技指科学大学生物系干長岡市上富関町 (C) 1999 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

2 ti の方法 10) で見積もった誤差が A 程度であるのと比較して極めて正確であるということができる (2) 差フーリエ図上に溶媒分子や乱れた構造のみならず, 水素原子をも容易に見出すことができるようになる Rubredoxin では 2/3 以上 11), Sakabe らのインスリンでは突に 90% もの水素原子の同定が可能となっている 1, 2) 蛋白質と直接水素結合で結びつけられていない多くの水分子を見出すことも可能で, rubredoxin では結晶中に存在しうる水分子の 50% 以上が同定されている側鎖のみならず, 場合によっては主鎖までも静 and/or 動的に乱れている構造を至る所に見出すことができる乱れたアミノ酸残基の割合が優に 10% を越えることもしばしばあるまた, 精密化の最終段階の差フーリエ図では土 0.4 ea-3 を越える残余のピークがなくなる Harata 合は, -3~ 十 0.26 ea-3 である 5) らのリゾチームの場 (3) 温度因子があまり大きくない場合には, 炭素, 窒素, 酸素原子を明瞭に区別することができるすなわち, 電子一個分の違いを判別することが可能となるしたがって, 通常の分解能では, 困難であったグルタミン, アスパラギン, およびヒスチジンの側鎖の表裏を同定することができる結品中に金属原子などの重い原子を含む場合は, パターソンサーチなどによりそれらの原子位置を決定し, 得られた初期位相を SHELXSl 2) や LODEM4) などのプログラムで拡張 / 改良することで, initio に構造を決定することができるらも遅蒔きながら, 2 種類の蛋白鷺の原子分解能の X 線結晶構造解析を行っているので, これまでの経験を踏まえつつ, 結品化から構造の評価までの概説を行うことにする 1 つはアミノ酸残基数 111 のウシガエル卵由来のレクチン (RCEL と呼ぶことにする ) で, もう一つは 419 残基の細菌由来のキチン分解酵素 (CA6 と呼ぶ ) である結晶化原子分解能の結晶構造解析を行っていて, もっとも多く受ける質問の一つは, どうすれば原子分解能の回折を与える蛋白質の結品を得ることができるのか? " ということであるところが, 私どもはこの質問には明快に答えることができない実際, RCEL も CA6 も結晶化条件の初期探索はともに広くー披に行われているランダムスクリーニング法を採用したにすぎないし, 多少の条件の最適化を行った後は特別な工夫はなにも行っていない数多くの原子分解能の構造解析に関する研究を行っている W i1son らの総説 7, 8) にも, 結品化に関する記述はほとんど見られないいくつかの間々で第 3 世代の放射光施設が共同で利用され, 受光面の大きな検出器がルーチンに使われている以上, 原子分解能の田折強度データ収集の正否はいかにいい結品を得るか, という一点にかかっているといってもよし 10 純度の高い試料を使うということは当然としても, クライオ条件を確立することは, 望ましいことではあっても必須ではない EU ValidationNetwork の総説 13) に記述されている原子分解能の解析が行われた 8 つの例のうち, 実に 7 つは室温でデータの収集が行われたのである 1 1. はじめにに紹介した 3 種類の例と CA6 も室温かまたはそれに近い湿度で, データ収集が行われているすなわち, 放射線損傷が少なければ室温でも大きな問題はないのである CA6 は SPring-8 の BL44B2 で測定を行ったが, l 偲の結晶から1. 13 A 分解能のデータを収集することができた Harata らはより生理条件に近い状態での構造を得るために, 意図的に室温での測定を行っている 5) 単位格子内の分子量が同じなら, 単位格子が小さい方がより強い反射強度を与えるしかしながら, リゾチームのように様々な種類の結晶が得られるならともかく, 結晶化条件を変化させることで単位格子の大きさを制御することは実際上不可能である残された方法は結品岳体を大きくすることである最近の論文には結晶の大きさが記載されていないことが多いので不完全な調査ではあるが, もっとも小さいものでも 0.5 mm 3 であるそれでは, 結晶を大きくするにはどうすればよいかこれには従来から様々な方法が試みられているが, 原子分解能の解析でもっとも多いのはシーディング法であるしかも, ミク口シーディングとマクロシーディングを組み合わせている例が多い筆者らはシーディング法での結晶化を行ったことはないが, 測定の時には大きいものから選んで使っている測定原子分解能の X 線回折強度データの収集のためには, 高角の弱い反射を精密に測定するため検出器の受光面はできるだけ大きく, また低角が飽和せぬようダイナミックレンジもできるだけ広い方がよいさらに, 高角領域の斜入射による積分計算の因難を排するためには, 湾曲した検出器か 2() が可変の検出器であることが望ましい湾曲タイプとしては PF の BL6C のイメージングプレートを搭載した円筒カメラが理想的であるし, 2() を変化させることができればダイナミックレンジが狭いにしろ読みとり時間の短い CCD カメラが極めて効率的である平板でかっ 2() を変化させることのできない場合には, 低角, 中角, および高角照に結晶と検出器の距離を設定し誼す必要があるだろう一定面積の受光面でより多くの回折強度データを収集するためと, 吸収の影響を無視し得るほど小さくするために, 波長は 1A 以下で測定されることが多い波長の選択は, X 線の強度, 検出器の大きさと位置分解能, 結晶一検出器開距離, 必要とする分解能, および結晶の大きさとを勘案して決めるべきであるが, 筆者らは十分な強度が得られるもっとも短い波長で測定を行っている測定法は振動法とワイセンベルグ法に眼定されている

が, いずれにしろ SjN 比をよくするためにはできるだけ振動角を小さくし露出時間を長くするのがよいしかしながら, マシンタイムに限りがある現状では SjN 比を犠牲にしてでも振動角を大きくしなければならない場合がほとんどである確かに, 室温でも原子分解能の X 線田折強度データを収集することは可能な場合もあるが, たとえ液体窒素温度にしても放射線損傷は起こるようである

3 が, いずれにしろ SjN 比をよくするためにはできるだけ振動角を小さくし露出時間を長くするのがよいしかしながら, マシンタイムに限りがある現状では SjN 比を犠牲にしてでも振動角を大きくしなければならない場合がほとんどである確かに, 室温でも原子分解能の X 線田折強度データを収集することは可能な場合もあるが, たとえ液体窒素温度にしても放射線損傷は起こるようであるできるだけ精密なデータ収集, 特に超高分解能 (Kuhn らの定義 14) によれば, 0.9A を超える分解能 ) のデータを得ょうとするなら液体ヘリウムによる冷却も必要であろうさて, 原子分解能に限られたことではないが, 得られたデータの分解能がどれだけであると表現するのはなかなか難しい問題である Acta D の fm authors では, 1 '2 3σ(1) の反射の最外角シェルにおけるコンブリートネスが 70% 以上, かつ全体のコンプリートネスが 93% 以上, さらに全体の Rrr 町 ge が 20% 以下と非常に厳しい要求を行っているこれに対し, 原子分解能の場合には Sheldirck がもう少し現実的な定義 6) を行っており, 広く受け入れられているようであるすなわち, f ミ 2σ (1) の反射の最外角シェルにおけるコンプリートネ Rm 叩 (1) <1/σ a=b=41.653, 53,295 (3,672) スが 50% 以上で, Rmerge がおおむね 25% 以下であることを満たす分解能である ( それにしても, いったいいくつのら出発して徐々仁位相を改良していくプログラムシェルに区切ればいいのだろうか? ) 参考のため Table ARp19, 20) を適用してみた RCEL の 111 アミノ酸残基のうに筆者らが SPring-8 の BL44B2 で測定した RCEL のデち, 8 残基を占める最大の r ヘリックスは RNase A の対タについてまとめてみた応する部分と側鎖を含めてほぼ同ーの構造であり, 分子の中心に近いところに位置しているそこで, この部分構造位相決定が正しいと仮定して, ARP で位相の改良 / 拡張を行った Frazão らのシトクローム c6 のめ initio 構造決定 15) を SGr 社の Origin2000 による丸一日程度の計算で Fig.l に除けば, 最初から新規蛋白質の構造が原子分解能で決定された例は今のところほとんどないいずれの例も, すでに構造が決定されている蛋白貿の分解能を向上させた精密化であるしかしながら, 原子分解能のデータが位相決定の上で極めて有効に利用できることは, いくつかの論文が示している 16-18) とおりである RCEL は当初, 回転対陰撞型 X 線発生装置上に設置されたイメージングプレート X 線回折装霊でデータの収集を行ったターゲットは銅であり, 検出器の大きさが mm 2 で, 結晶一検出器間距離は 55mm 以下にすることができなかったので, A が分解能の限界であった RCEL はすい臓出来リボヌクレアーゼスーパーファミリーに属しているので, 牛すい臓由来リボヌクレアーゼ A A) の構造を使って分子置換法で最終的には構造を決定することができたところが, RCEL には異なる位置に架かったジスルフィド結合があり, その周囲のモデルを構築するには延べで千にも上るオミットマップを繰り返し作製し, 全構造を構築するには数ヶ月を要したその後, PF で1. 14A 分解能, SPring 8 で1. 06 A 分解能のデータを得ることができたので, 試みに部分構造か 2F e, 叫 ) final, positions. Pca" threeωlet pyroglutarnic

示すように, 原子一つ一つを明瞭に区別することのできる質の高い電子密度分布図を得ることができた原子分解能のデータがあれば数ヶ月の作業を 1 日に短縮することも可能である精密化原子分解能の X 線回折強度データが集まれば, パラメータの数に対して十分データの数が多くなるので, 通常の分解能では不可能な異方性温度因子の精密化も可能となる蛋白質の異方性の温度国子を決定できる広く普及した

4 示すように, 原子一つ一つを明瞭に区別することのできる質の高い電子密度分布図を得ることができた原子分解能のデータがあれば数ヶ月の作業を 1 日に短縮することも可能である精密化原子分解能の X 線回折強度データが集まれば, パラメータの数に対して十分データの数が多くなるので, 通常の分解能では不可能な異方性温度因子の精密化も可能となる蛋白質の異方性の温度国子を決定できる広く普及したプログラムとしては, 最近まで事実上 SHELXL ) およびそれ以前のパージョンしか存在しなかったが, ve r. 3.5 の REFMAC23) も個々の原子の異方性温度因子を精密化できるようになったようである RCEL の場合, データ / パラメータ比が 4 を超えるので SHELXL- 97 を用いて全ての非水素原子の異方性温度因子 (Fig. を決定することができたが, データ / パラメータ比が 3 程度でも十分異方性温度因子の精密化が可能であるまだ, 解析例が多いとは言えないので, 原子分解能の結晶構造精密化のプロトコルは確立までには至っていないそれぞれの研究者が試行錯誤で精密化を行っている段階であるが, (1) 等方性温度因子を用いた計算で十分収赦した後に, 異方性温度因子を導入する (2) 乱れと水分子を追加しつつ, 精密化を続ける (3) riding" 水素原子を導入する (4) ブロック対角法または完全行列最小二乗法による精密化, というステップを踏むのが一般的なようであるさらに付け加えるならば, (5) 立体化学的制限を課さない精密化, となるであろう RCEL の (1)"-'(3) のステップにおける R 幽 factor の変牝をプロットしたものが Fig.3 である異方性温度因子を導入すると 4% 程度, riding" 水素原子を導入すると 1% 程度 R-factor が下がっていることが分かるタ / パラメータ比が 4 に満たないリゾチームのケースに対して完全行列最小二乗法による精密化を成功させた Harata らのプロトコル 5) は, 現在のところ, もっとも鐙れているように思える収数の状況を監視しつつ, 最初はブロック対角化法から始め, 徐々にブロックを大きくしていくやり方は大いに参考になる一方, Kuhn らは原子位置の誤差, あるいは結合長や結合角の推定標準偏差を算出するために, 精密化の最後に 1 サイクルのみ完全行列最小二乗法の計算を行っている 14) 論文に記述がないので十分に収赦しているか否かは定かではないが, 立体化学的制限を課さずに精密化を行っている点は高く評価できる構造の評価ブロック対角法あるいは完全行列最小二乗法により精密化を行えば, 個々のパラメーターに対して推定標準偏差が与えられるしたがって, 通常の分解能の解析のように Luzzati の方法 10) によらなくとも, 原子位置の誤差を求め,,,,JS,

5 r ることができる RCEL の場合, ブロック対角法による最小二乗法で精密化した後の個々の原子位置の推定標準備を平均した値は Á であった実験室系の 1.54Á 分解能のデータを用いた X-PLOR24) による精密化では, Luzzati プロットより平均誤差を求めると 0.20,,--, 0.25 Á であったこれに比べると原子分解能では, 精密化の度合いが非常に高まっていることが分かる温度思子がそれほど大きくない場合には, 電子密度分布陣より炭素, 窒素, および酸素の区加ができることはすでに述べた実際に RCEL ではどのように見えるのかを Fig.4 に示したさらに, より定量的に示すため, tor と藤子中心の電子密度の関係を Fig.5 に示した B 同 factor が 20Á2 以下の場合にはほぼ完全に完素の判別を付けることができる蛋白質の立体構造の評価法としては Ramachandran プ口ット 25) が視覚的に捉えることができてもっともわかりやすいところが, 原子分解能の場合は, プロットするまでもなくほとんど全てのアミノ酸残基がエネルギー的に許容されうる範閉に収まってしまうので, もっと厳密な評価法を適用せねばならない Wilson らを中心とする EU network では, 命名法, 立体化学的パラメータ, 水素結合, 溶媒, 温度因子, 充填密度, あるいは格子定数にいたるさまざまな評価の対象について評価 " を行っている問 8 つの原子分解能の構造に対して,,, SQUID28), および WHATCHECK29) の 4 つのプログラムを適用したうえで, 原子分解能の構造, 評価プ口グラム, および原子分解能の構造解析の将来について述べている詳しくは原著を参照 J'a., residues, Trp3, Lys9, Asn38,

6 時剛 d り 10 ω 同 ~ L 帽 ω 場前 d 一一吟幽 d ~ Cross: 白巾 bo B 同 factor(å (F o, cた ) していただくとして, 注目すべき点を 2 つだけ簡単に述べる (1) 原子分解能の構造のポストリファインメントの結果, 格子定数に 0.5% もの誤差があることが分かったハンブルグの EMBL では格子定数を実験的に決定する方法が改善され, 誤差は 0.1% 以下になった (2) ペプチド結合の 2 面角 ω の理想値からのずれは, 原子分解能の構造の方がむしろ大きいつまり, 従来の精密化における制限がきっすぎたのであり, し 10 終わりに 2 面角には制限を課さない方がよ蛋白質結晶から原子分解能, さらには超高分解能の X 線回折強度データがぞくぞくと得られるようになってきたどうやら, そこには宝が眠っているらしい動的情報や水素原子はすでに見えた結合電子も見えつつある initio 構造決定も増えるだろうさてその次は? 謝辞 PF の BL18B での RCEL の最初の原子分解能のデータ収集では, PF の渡渡遅信久博士より, SPring-8 の BL44B2 での RCEL と CA6 のデータ収集では理研播磨研究所の足立伸一博士より協力をいただいた両博士に心より謝意を表する参考文献 (Exce 中旬 Medica, Amsterdam, 坂部知平他 : 蛋白質核酸酵素 24, 塩野正明他 : 日本結品学会平成 9 年度年会 ( つくば ) 講演要旨集 P-039 A48, 30, A46, 5, Cur r. 7, 8, 5, 93, 8836 D49, 276, 37, 3, 3, A46, D51, D53, 6, 277, Project, D50, D55, 277, 5, 26, 264, Old 五 eld: 10, 381, , Weekend,

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と課題名生体超分子チトクロム酸化酵素の高分解能 X 線構造解析課題番号 2006B1683 利用ビームライン BL41XU 大阪大学蛋白質研究所所属博士後期過程 2 年菅倫寛目的および背景生物は好気的条件下では呼吸によってエネルギーを得ているミトコンドリア内では ATP の合成が 40% 以上という極めて高いエネルギー変換効率で行われているチトクロム酸化酵素はミトコンドリア内の呼吸鎖末端に位置する巨大膜蛋白質で