光学顕微鏡概論 生命科学特論E 京都大学大学院生命科学研究科

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1 光学顕微鏡概論 京都大学大学院生命科学研究科生命科学特論 E 2010 年 4 月 27 日 オリンパス株式会社 ライフサイエンス国内営業部教育研修ク ルーフ 田中隆明

2 目次 光学顕微鏡とは基本機能 構造種類光学顕微鏡の原理レンズによる結像顕微鏡の能力対物レンズレンズの収差対物レンズの種類油浸対物レンズと水浸対物レンズ各種観察法蛍光法位相差法微分干渉法 参考文献 ビデオ顕微鏡共立出版 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

3 3 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡とは

4 顕微鏡の基本機能 1. 倍率 見やすい大きさで見える 2. 分解能見たい部分が十分に精細に見える 3. コントラスト見たいもの 見つけたいものが明暗や色ではっきり見える /4/16 No data copy / No data transfer permitted

5 倍率 見やすい大きさで見える 肉眼観察 千円札 実体顕微鏡観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

6 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 珪藻標本開口絞り ( コンデンサ絞り ) による分解能の違い /4/16 No data copy / No data transfer permitted

7 分解能 見たい部分が十分に精細に見える 細部が見えている 細部がつぶれている /4/16 No data copy / No data transfer permitted

8 コントラスト 見たいもの 見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 微分干渉観察 位相差観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

9 コントラスト 見たいもの 見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 染色体検査 : 蛍光観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

10 コントラスト 見たいもの 見つけたいものが明暗や色ではっきり見える 角閃石系アスベスト ( アモサイト ): 鋭敏色観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

11 顕微鏡の基本構造 1. 試料の拡大像を結像させる構造 結像位置 結像倍率を所定の値にする 視野絞り 試料面 中間像 (1 次像 ) 網膜 ( ヒトの眼 ) が共役関係 2. 試料の像にコントラストをつける構造瞳の結像関係を使いて光変調を行い 像に明暗や色のコントラストをつける 光源 開口絞り ( コンデンサ瞳 ) 対物瞳 アイポイントが共役関係 共役関係とはレンズを介して物体と像との関係になっていること /4/16 No data copy / No data transfer permitted

12 顕微鏡の基本構造 アイポイント < 眼の瞳位置 > /4/16 No data copy / No data transfer permitted

13 顕微鏡の種類 用途による分類 観察対象生物顕微鏡 金属顕微鏡 実体顕微鏡 測定顕微鏡 ( レーザー顕微鏡 電子顕微鏡 ) 形による分類 標本に合わせた形正立型顕微鏡 倒立型顕微鏡 観察法による分類 観察 検出する方法明視野 暗視野 位相差 微分干渉 ( 偏光 蛍光 レリーフコントラスト 分散染色 ) /4/16 No data copy / No data transfer permitted

14 用途による分類 生物顕微鏡 プレパラート標本や培養容器中の試料観察標本を光が透過する /4/16 No data copy / No data transfer permitted

15 用途による分類 金属顕微鏡 半導体検査用顕微鏡 金属や半導体 IC など不透明な試料観察標本で光が反射する /4/16 No data copy / No data transfer permitted

16 用途による分類 実体顕微鏡 試料を立体的に観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

17 用途による分類 実体顕微鏡 左右別の光軸があり 内向きの角度がつけてあるので立体視できる ガリレオタイプ グリノータイプ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

18 用途による分類 測定顕微鏡 座標表示 x y z 測長機構 試料を XY 座標上で計測する /4/16 No data copy / No data transfer permitted

19 形による分類 正立型顕微鏡 生物用 金属用 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

20 形による分類 倒立型顕微鏡 生物用 金属用 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

21 明視野観察 : 染色した組織切片 100x 40x 20x 10x 4x 2x 1.25x /4/16 No data copy / No data transfer permitted

22 暗視野観察 サルモネラ菌 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

23 暗視野観察 : 無染色の藻類 アオミドロ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

24 位相差観察 : 無染色の肺組織 ( 中皮腫 ) アスベスト小体 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

25 微分干渉観察 : 無染色の培養細胞 NG108 細胞 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

26 偏光観察 : 臨床検査 ( アミロイド検査 ) コンゴーレッド染色 簡易偏光観察 腎臓血管 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

27 偏光観察 : 臨床検査 ( 痛風検査 ) 関節液中の尿酸ナトリウム : 鋭敏色観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

28 蛍光観察 :3 重染色培養細胞 核 微小管 アクチン繊維 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

29 レリーフコントラスト観察 :ART( 生殖補助医療 ) ICSI(Intracytoplasmic sperm injection) 卵細胞質内精子注入法 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

30 分散染色観察 : アスベスト分析 建材成分中のクリソタイル ( 蛇紋岩系 ) 浸液 1.55 の分散色 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

31 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 光学顕微鏡の原理

32 光学原理 : 眼の識別能力 250mm: 明視距離 眼による結像網膜への投影 眼の 2 点識別能力視細胞の大きさに依存する /4/16 No data copy / No data transfer permitted

33 光学原理 : レンズによる結像 実像の結像 虚像の結像 ( 網膜上には実像 ) /4/16 No data copy / No data transfer permitted

34 光学原理 : レンズによる結像 網膜上の実像 中間像 (1 次像 ) 試料 虚像 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

35 参考 : 無限遠補正光学系とは 平行光束部分 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

36 光学原理 : 顕微鏡の能力 分解能標本上で分解して見える 2 点間の最小寸法対物レンズの開口数と波長で決まる 倍率対物レンズの倍率 接眼レンズの倍率 撮影レンズの倍率がある コントラスト開口絞りの開度で決まる 観察法で決まる 焦点深度開口数 倍率 眼の分解能で決まる 像の明るさ開口数と倍率で決まる /4/16 No data copy / No data transfer permitted

37 光学原理 : 開口数 numerical aperture 乾燥系対物レンズ 乾燥系対物レンズの開口数 NA=sinα 実用最大 :0.95 油浸系対物レンズ 液浸系対物レンズの開口数 NA=nsinβ 実用最大 :1.49 n: 浸液の屈折率オイル :1.516 水 : /4/16 No data copy / No data transfer permitted

38 光学原理 : 分解能 resolving power 分解能 δ=0.61λ/na 開口数と波長にのみ依存する /4/16 No data copy / No data transfer permitted

39 光学原理 : 回折像 直径 エアリーの円盤 (disk) 全光量の 84% 直径 =1.22λ/NA 回折像の強度分布曲線 1 光点の回折像 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

40 光学原理 :2 光点の回折像 2 光点を 2 光点像と識別できる ヒ テ オ顕微鏡 : 共立出版 2 光点像と完全に識別できる /4/16 No data copy / No data transfer permitted

41 光学原理 :Rayleigh の分解能 この間隔に対応する物体側の距離 レーレー (Rayleigh) の分解能 δ=0.61λ/na < 条件 ) 2 光点の強度が等しい 2 光点の光線がインコヒーレントである くびれ くびれを考慮すると 0, としてよい /4/16 No data copy / No data transfer permitted

42 参考 :CCD の画素サイズと分解能 対物レンズ + 撮影レンズによる CCD 上への結像倍率 :M CCD 面 δ =Mxδ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

43 参考 :CCD の画素サイズと分解能 光軸 CCD 面 1 画素を と同じとすると 2 点分解できない場合がある 1 画素は の 1/2 以下が必要 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

44 光学原理 : 有効倍率 500NA<ME<1000NA ME: 有効な倍率 ( 対物倍率 接眼倍率 ) NA: 対物開口数 開口数と倍率の関係 1000NA 以上の倍率をばか倍率 または無効倍率と呼ぶ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

45 光学原理 : 横倍率と縦倍率 縦倍率は 横倍率の 2 乗 空気中かつ横倍率が 1 以外のとき 物体と像とは相似にならない X n n Z Z X' 横倍率 β= X Z ' n' 縦倍率 α= = β Z n 2 拡大光学系 X 球の像は長楕円体 一般に 倍率 とは横倍率を言う /4/16 No data copy / No data transfer permitted

46 光学原理 : 横倍率と縦倍率 縦倍率は 横倍率の 2 乗 横倍率が 1 以外のとき 物体と像とは相似にならない X n n Z Z 縮小光学系 X X' 横倍率 β= X Z ' n' 縦倍率 α= = β Z n 2 球の像は長楕円体 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

47 光学原理 : コントラスト 照明の条件による違い a 開口絞り全開 b 開口絞り 80% c 開口絞り最小 a は分解能は良いが コントラストが悪い b は分解能とコントラストのバランスがよい c はコントラスとは良いが分解能が悪い注 ) % は対物開口数に対する照明開口数の割合 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

48 光学原理 : 焦点深度 焦点深度開口数 倍率 眼の分解能で決まる開口数 倍率の反比例する 開口数が大 焦点深度小 高倍率ほど 焦点深度小 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

49 光学原理 : 焦点深度 NA0.30 対物 20X NA0.50 アカガシ切片 同じ倍率でも NA が違うと焦点深度は違う /4/16 No data copy / No data transfer permitted

50 光学原理 : 像の明るさ 像の明るさ 開口数と倍率で決まる一般に 開口数の自乗に比例し 倍率の自乗に反比例する NA0.75 対物 40X NA1.0 落射蛍光顕微鏡の像の明るさは開口数の 4 乗に比例 倍率の自乗に逆比例 Ptk2 細胞 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

51 光学原理 : 像の明るさ NA0.75 対物 40X NA0.50 マウス腎臓切片 同じ倍率でも NA が違うと明るさが違う /4/16 No data copy / No data transfer permitted

52 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 対物レンズ

53 対物レンズ レンズの収差幾何光学的光線収差アッベの 5 収差と 2 つの色収差計 7 収差 ( 波面収差 ) 対物レンズの種類対物レンズの表示収差による分類観察法による分類付属機構 補正環絞り 油浸対物レンズと水浸対物レンズ特徴と用途 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

54 対物レンズの収差 : 球面収差 レンズの光軸に近い光線と光軸から離れた光線が 1 点に集光しない < 球面収差による像の悪化 > 補正環対物レンズの調整不足 液浸対物レンズの浸液間違い カバーガラス厚条件の間違い /4/16 No data copy / No data transfer permitted

55 球面収差 : 液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 培養細胞 : 蛍光観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

56 球面収差 : 液浸対物レンズの浸液間違い 油浸レンズをドライで使用 染色組織切片 : 明視野観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

57 対物レンズ : 色収差 軸上色収差波長ごとに焦点位置が異なる現象 倍率色収差波長ごとに倍率が異なる現象 屈折率が波長によって異なることによる現象屈折率大 屈折角大 白色光線入射 ガラスプリズム n 紫 >n 緑 >n 赤 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

58 対物レンズ : 色収差 色収差補正不足 コントラストの境界に色にじみが出る /4/16 No data copy / No data transfer permitted

59 色収差 : ガラス表 基準波長の屈折率とアッベ数 nd:λ587.56nm の屈折率 アッヘ 数 υ d = ( n ( n F d 1) n ) C nf:λ486.13nm の屈折率 nc:λ656.27nm の屈折率 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

60 屈折率と分散 nd 大 nd は同じ νd 小 nd 小 νd 大 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

61 軸上色収差とその補正原理 : 光学ガラスの特性 凸レンズと凹レンズの組合わせで打ち消す /4/16 No data copy / No data transfer permitted

62 色収差の例 1.0 アホ クロマート 100 スーハ ーアホ クロマート 100 焦点面 (μm) 波長 (nm) 焦点深度 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

63 対物レンズの表示 名称 UPlanApo 開口数 浸液オイル :Oil 水 :W ク リセリン :Gly 多重 :Imm MI 倍率 鏡筒長 : 無限遠 100x/1.35 Oil Iris /0.17 絞り付 カハ ーカ ラス厚 カラーリンク コート ( 倍率 ) カラーリンク コート ( 浸液 ) /4/16 No data copy / No data transfer permitted

64 同焦点距離 作動距離 (WD) 胴付き面 同焦点距離 ( 胴付き面 ~ 試料面 ) 45mm 試料面 作動距離 ( 先玉 ~ 試料面 ) /4/16 No data copy / No data transfer permitted

65 対物レンズの収差による分類 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

66 対物レンズの観察法による分類 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

67 付属機構による分類 絞り付き スプリング付き 補正環付き /4/16 No data copy / No data transfer permitted

68 補正環付き対物レンズの像 補正不十分 ( 球面収差 ) 対物 40x: 蛍光 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 補正環付き : 高 NA 乾燥系対物 培養用対物 高 NA 水浸対物に付属

69 絞り付き対物レンズの像 絞り付き : 高 NA 対物に付属 適正に調整 対物 100x: 蛍光 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

70 対物レンズカバーガラス厚条件 対物レンズ先端 ( 先玉 ) レンズと試料との間にあるものは 対物レンズの一部と同じ レンズの指定条件から外れると球面収差が発生 対物レンス 先端部 カバーガラス用対物表示 : 空気または浸液 ノーカバー用対物表示 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

71 対物レンズ : 油浸レンズと水浸レンズ油浸対物レンズ対物先端とカバーガラスの間を 指定のイマージョンオイルで満たす カバーガラス直下の標本にピントを合せた時 最高の分解能 コントラストで観察できる水浸対物レンズ浸液が水である カバーガラス タイプとノーカバータイプの 2 種類ある カバー対物 ノーカバー対物 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

72 対物レンズ : 油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 カバーガラス直下が最もよく見える油浸オイル 生細胞と培養液 水浸対物 水 30~40μm 以上 対物かぶつかる範囲まで良好な像が見える /4/16 No data copy / No data transfer permitted

73 対物レンズ : 油浸レンズと水浸レンズ 油浸対物 球面収差が発生 水浸対物 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 球面収差なし

74 観察法の種類 特徴 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

75 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 各種観察法

76 各種観察法 3 つの特徴 蛍光顕微鏡 : 蛍光色素 蛍光たんぱく質の蛍光で試料を観察する 蛍光の発光を利用 位相差顕微鏡 : 無染色 ( 透明 ) 試料の形態を 濃淡のコントラスト ( 位相差コントラスト ) で観察する 直進光と ±1 次回折光の干渉を利用 微分干渉顕微鏡 : 無染色 ( 透明 ) 試料の形態を 立体的なコントラストで観察する 偏光 2 光束シアリング干渉を利用 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

77 各種観察法の特徴 位相差観察 微分干渉観察 明視野観察 蛍光観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

78 倒立顕顕微鏡の構成 透過用ハロゲンランプハウス 蛍光用高輝度ランプハウス コンデンサ 接眼レンズ 対物レンズ 蛍光用投光管 蛍光フィルタ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

79 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 蛍光顕微鏡

80 項目 蛍光顕微鏡の特徴蛍光顕微鏡の構成蛍光観察の原理励起法の種類蛍光フィルタ蛍光用対物レンズ光源 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

81 蛍光顕微鏡の特徴 高感度で検出力が高い特異性が高い検出が可能検出対象が分解能以下の大きさでも検出可能 ~ たんぱく質 1 個も可 発光 消光の時間分解能が高い 定量的な分析にも応用できる 細胞内イオン濃度測定など蛍光の明るさの変化 色 ( 波長 ) の変化を検出できる 複数の対象を同時に検出 可視化できる多重染色で観察できる /4/16 No data copy / No data transfer permitted

82 蛍光顕顕微鏡の構成 透過用ハロゲンランプハウス 蛍光フィルタ 蛍光用高輝度ランプハウス コンデンサ 接眼レンズ 蛍光用対物レンズ 蛍光用投光管 蛍光フィルタ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

83 蛍光顕微鏡の構成 高輝度光源 蛍光フィルタ 蛍光用対物レンズ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

84 蛍光観察の原理 : 蛍光とは 発蛍光には 光の吸収が必要 : absorption emission 励起光照射後すぐに発光し 照射を止めるとすぐに消光する 蛍光は励起光より波長が長い非常に微弱な光 ( 励起光の強度の約 ) 褪色または消光する 10 6 紫外線によって生ずる自家蛍光に対する注意が必要である 1 光子励起のモデル図 励起状態 励起光 蛍光 基底状態 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

85 蛍光色素の特性の例 λ EX : 495nm λ EM:519nm Fluorescence Emission Absorption (Excitation) Alexa Fluor /4/16 No data copy / No data transfer permitted

86 蛍光観察の原理 : フィルタ暗視野法 光源 励起フィルタ 励起光 蛍光 吸収フィルタ 励起フィルタ : 照明光から励起光の波長のみ透過 吸収フィルタ : 蛍光の波長のみ透過励起光は反射 励起波長と蛍光波長の違いを利用 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

87 蛍光顕微鏡の原理 : フィルタ暗視野法 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

88 励起法の種類 励起光の波長帯域( 色 ) によって大まかに呼び分ける 呼び名 励起波長帯 U 励起 紫外線 V 励起 紫色 BV 励起 青紫色 B 励起青色励起法は蛍光フィルタ G 励起緑色 ( 励起フィルタ 吸収フィルタ ) で組合せで決まる Y 励起黄色 励起波長帯の幅で3つの呼び名がある 呼び名 記号 狭帯域 :Narrow band W 広帯域 :Wide band N 超広帯域 :Super wide band SW /4/16 No data copy / No data transfer permitted

89 励起波長帯と観察波長帯の例 WU NU V WBV NBV SWB WB NB WIB NIB SWG WG NG WIG WIY NUA WIBA NIBA nm /4/16 No data copy / No data transfer permitted

90 蛍光フィルタの働き 対物 標本側 光源側 ダイクロイックミラー : 励起光を反射 蛍光を透過励起光が僅かに漏洩 吸収フィルタ : 蛍光を透過 励起光を反射 励起フィルタ : 励起光のみ透過 観察側 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

91 蛍光フィルタの波長特性図例 : 広帯域 U 励起 励起フィルタ BP の特性 透過率 タ イクロイックミラー DM400 の特性 吸収フィルタ BA420 の特性 蛍光色素 蛍光たんぱく質の光学特性との適合性チェックに利用する 波長 注 ) フィルタの呼称はメーカーにより異なる /4/16 No data copy / No data transfer permitted

92 励起法の例 1 励起波長 :372nm 蛍光波長 :456nm 細胞の核を DAPI で染めて U 励起観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted nm U 励起フィルタを使用

93 励起法の例 2 励起波長 :495nm 蛍光波長 :519nm 細胞の微小管を Alexa488 で染めて B 励起観察 /4/16 No data copy / No data transfer permitted nm B 励起フィルタを使用

94 励起法の例 3 励起波長 :550nm 蛍光波長 :580nm 細胞のアクチンをロタ ミンで染めて G 励起観察 (Rhodamine Phalloidin) /4/16 No data copy / No data transfer permitted nm G 励起フィルタを使用

95 励起法の例 4 Alexa488 励起 :495nm 蛍光 :519nm 細胞の核を PI で 微小管を Alexa488 で染めて B 励起観察 PI 励起 :530nm 蛍光 :615nm /4/16 No data copy / No data transfer permitted nm B 励起フィルタを使用

96 蛍光用対物レンズ 色収差はセミアポクロマート アポクロマート級以上 色が画像の重要な要素 高開口数 明るい像の条件 油浸対物レンズと水浸対物レンズの使い分け 広い波長帯で透過率が高い 適用する励起波長 蛍光波長の波長帯が広い ( レンズ自体の ) 自家蛍光が少ない よいコントラストの条件 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

97 蛍光用対物レンズに望ましい分光透過率特性 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

98 蛍光顕微鏡用光源 一般的に水銀ランプ 一部キセノンランプ ハロゲンランプ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

99 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 位相差顕微鏡

100 項目 位相差顕微鏡の特徴 位相差顕微鏡の構成 位相差観察の原理ポジティブ ( ダーク ) コントラストとネガティブ ( ブライト ) コントラスト /4/16 No data copy / No data transfer permitted

101 位相差顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 細胞の観察 厚い試料の観察には向かない 数 μm 以上になるとハローが強くなる 薄い試料の形態観察で検出感度が高い ハロー 位相差像 上皮細胞 微分干渉像 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

102 位相差顕顕微鏡の構成 透過用ハロゲンランプハウス 位相差コンデンサユニバーサルコンデンサ 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 位相差対物レンズ 蛍光用投光管 蛍光フィルタ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

103 位相差顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ リングスリット切換え用ターレット /4/16 No data copy / No data transfer permitted

104 位相差観察の原理 原理図 照明側 リングスリット ユニハ ーサルコンテ ンサ 位相差コンテ ンサ 試料面 位相板 位相差対物レンス 観察側 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

105 位相差観察の原理 照明光がリンク スリットに入射する 位相差コンテ ンサ リンク スリット リンク 状の 2 次光源から照明光が標本を照明する 位相差対物レンス 試料 位相板 細胞 細胞を通過する際に ±1 次回折光と直進光とに分かれる ±1 次回折光は直進光より位相が 1/4 波長遅れる 直進光はフェース フ レートで位相が変わり ±1 次回折光と 1/2 波長の位相ずれとなる 3 本の光線が 中間像位置で干渉し 像に明暗のコントラストがつく 中間像位置 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

106 位相差観察の原理 ポジティブ ( ダーク ) コントラスト直進光と回折光の位相差が 1/2 波長 ( 逆位相 ) の場合 像の輝度は低くなり 明るい視野に試料のコントラストが黒く見える 主に形態観察用 ネガティブ ( ブライトコントラスト ) 直進光と回折光の位相差が同位相の場合 像の輝度は高くなり 暗い視野に試料のコントラストが明るく見える 主に試料の計数用 気中アスベスト ( グリーンフィルタ使用 ) /4/16 No data copy / No data transfer permitted

107 参考 : コントラストの呼び名と特性 ポジティブ PLL PL PM PH オリンパス 形態観察向き DLL DL DM DH ニコン ネガティブ NLL NL NM NH オリンパス BLL BL BM BH ニコン 計数向き ハロー 弱い 強い コントラスト 弱い 強い 厚い ( 太い ) 試料向き薄い ( 細い ) 試料向き /4/16 No data copy / No data transfer permitted

108 /4/16 No data copy / No data transfer permitted 微分干渉顕微鏡

109 項目 微分干渉顕微鏡の特徴 微分干渉顕微鏡の構成 微分干渉観察の原理シアリング量と分解能 コントラスト ( 立体感 ) コントラストの方向性 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

110 微分干渉顕微鏡の特徴 無染色標本の観察 細胞 ~ プランクトン 位相差でハローの強い厚い試料も観察できる 位相勾配の検出感度が高い 試料自体に光学的異方性があると本来のコントラストで観察できない 線虫 上皮細胞 培養細胞 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

111 微分干渉顕顕微鏡の構成 透過用ハロゲンランプハウス ポラライザ ユニバーサルコンデンサ微分干渉プリズム素子 蛍光用高輝度ランプハウス 接眼レンズ 微分干渉対物レンズ 微分干渉プリズム 蛍光用投光管 アナライザ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

112 微分干渉顕顕微鏡の構成 ユニバーサルコンデンサ ポラライザ 微分干渉プリズム素子切換え用ターレット /4/16 No data copy / No data transfer permitted

113 微分干渉顕顕微鏡の構成 微分干渉プリズムスライダ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

114 微分干渉観察の原理 原理図 照明側 ポラライザ 微分干渉フ リス 素子 ユニバーサルコンデンサ 試料面 微分干渉用対物レンス 微分干渉フ リス ム 微分干渉スライダ 観察側 アナライサ /4/16 No data copy / No data transfer permitted

115 微分干渉観察の原理 ユニハ ーサコンテ ンサ ホ ラライサ 微分干渉フ リス ム素子 直線偏光にする 振動方向が直交する 2 本の直線偏光に分ける 試料 微分干渉用対物レンス 細胞 シア量 細胞を通過する際に 2 本の光線に位相差が生ずる 微分干渉スライタ 対物側微分干渉フ リス ム 中間像位置 アナライサ 位相差のある光線を 1 本にあわせる ( 楕円偏光になる ) 位相差に応じた干渉効果により 像に明暗や色のコントラストが付く /4/16 No data copy / No data transfer permitted

116 微分干渉観察の原理 シア量 : 大きい コントラスト大 分解能低 小さい コントラスト小 分解能高 位相勾配が小さい ( 薄い ) 試料 シア量大が適する : 高コントラストプリズム 位相勾配が大きい ( 厚い ) 試料 シア量小が適する : 高分解能プリズム /4/16 No data copy / No data transfer permitted

117 微分干渉観察の原理 : シア量とコントラスト 標準シア量 シア量小 厚い試料 : 線虫 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

118 微分干渉観察の原理 : シア量とコントラスト 標準シア量 シア量大 薄い試料 : 培養細胞 /4/16 No data copy / No data transfer permitted

119 微分干渉観察の原理 : コントラストには方向性がある 2 光束がずれた方向 コントラストが低い ボルボックス コントラストが高い /4/16 No data copy / No data transfer permitted

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<4D F736F F F696E74202D C834E D836A834E83588DDE97BF955D89BF8B5A8F F196DA2E >

<4D F736F F F696E74202D C834E D836A834E83588DDE97BF955D89BF8B5A8F F196DA2E > 7-1 光学顕微鏡 8-2 エレクトロニクス材料評価技術 途による分類 透過型顕微鏡 体組織の薄切切 や細胞 細菌など光を透過する物体の観察に いる 落射型顕微鏡 ( 反射型顕微鏡 ) 理 学部 材料機能 学科 属表 や半導体など 光を透過しない物体の観察に いる 岩 素顕 iwaya@meijo-u.ac.jp 電 線を使った結晶の評価法 透過電 顕微鏡 査電 顕微鏡 実体顕微鏡拡 像を 体的に

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