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きょうすけすみだ
5 years ago
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1 微生物学実習 ( 担当 : 生体情報学 Ⅱ 講座 ) テーマ () 環境中の微生物微生物の採取採取と観察 (a) 目的水や手を培地にさらして培養しどのような微生物がどれだけ存在するかを調べる (b) 材料 LB 寒天培地 (%Triptone0.5% 乾燥酵母エキス % NaCl.5% 寒天) 黎明寮( 多人数 ) の風呂の水西播磨寮 C 棟 ( 人 ) の風呂の水兵庫県立大学書写キャンパスサークル会館前の土兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパス学生用駐車場からキャンパスに向かう途中の路肩の土 (C) 方法黎明寮の風呂の水において入浴前は 6 月 0 日午後 5 時ごろ入浴後は翌日午前 7 時ごろ採取した西播磨学生寮 C 棟の風呂兵庫県立大学書写キャンパスサークル会館前の土兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパス学生用駐車場からキャンパスに向かう途中の路肩の土をサンプルとして採取した各自が持参したサンプルの水をピペットマン滅菌済みブルーチップを用いて LB 寒天地のプレートに 0.ml 撒きアルコールで殺菌したコンテージ棒を用いて均一に広げた手から採取した際は手の甲指を直接プレートにつけたシャーレのふたにグループ名採取対象をマジックペンで書き込みプレートを裏返しにしてインキュベータ (37 ) で 4 時間培養したそして培養したプレートのコロニーの大きさ形色表面の状態などに注意しながらスケッチした (d) 結果. 実験者の食指人差し指で触れた部分の培地に約 ~3mm の黄色円形のコロニーと約 0.~.0mm の

2 白色円形のコロニーが観察できた黄色白色のコロニーとも光沢があった特に黄色のコロニーはかなりの厚みがあった反対側の指で触れなかった培地には何も繁殖していなかった. 多人数が入浴入浴するする前の風呂風呂の水ヶ所のみ黄色円形のコロニーができているが他の部分には何の繁殖も見られなかった 3. 多人数が入浴入浴したした後の風呂風呂の水白色円形のコロニーが培地上に広がっていたがすべてを埋め尽くすほど密集しておらずところどころ何も繁殖していない隙間があったコロニーの大きさは約 ~3mm で表面は滑らかな光沢があった

3 4. 個人が入浴入浴するする前の風呂風呂の水円形に近い不定形白色のコロニーが培地ほぼすべてを埋め尽くすように広がっていた 3 の培地と比較してひとつひとつのコロニーの大きさが小さく数も多かった 5. 個人が入浴入浴したした後の風呂風呂の水 4 の培地と同じく円形に近い不定形白色のコロニーが培地ほぼすべてを埋め尽くすように存在していた数個の橙色の少し大きな円形のコロニーもできていたコロニー大きさひとつひとつが 4 の培地と比較して少し大きくなっていた 6. 兵庫県立大学書写キャンパスサークルキャンパスサークル会館前会館前の土

白色の小さなコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた他の形状のコロニーが見られないことから種類の菌の繁殖だと考えられる 7. 兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパスキャンパス学生用駐車場学生用駐車場からからキャンパスキャンパスにかけての路肩路肩の土円形白色のコロニーと線形白色のコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた (e) 考察.

4 白色の小さなコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた他の形状のコロニーが見られないことから種類の菌の繁殖だと考えられる 7. 兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパスキャンパス学生用駐車場学生用駐車場からからキャンパスキャンパスにかけての路肩路肩の土円形白色のコロニーと線形白色のコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた (e) 考察. 実験者の食指動物は胎内にいるときは皮膚も体内も無菌的であるが外界へ出てくるとすぐ各種微生物が住み始めるとくに皮膚や粘膜など外界と接する部分には多くの微生物が生息しているこれらの微生物は常在微生物叢と呼ばれている皮膚にはグラム陽性の表皮ブドウ球菌 Micrococcus 嫌気性の Propionibacterium などが存在するこれらの細菌は皮膚 cm 当りの菌数は 0 3 ~0 4 個程である消毒を行うと一時的に無菌的な環境になるが汗腺などから残存した菌が出てくるため元に戻る今回発見されたコロニーはこの常在微生物叢だと考えられる. 多人数で入浴前入浴前の水と入浴後入浴後の比較多人数が入浴する前の風呂の水でコロニーが発見されず入浴後に多くのコロニーが存在したのは塩素殺菌のためだと考えられるまた入浴後に繁殖していた細菌も常在微生物叢であると考えられる 3. 個人で入浴前入浴前の水と入浴後入浴後の水のサンプルサンプルの比較個人が入浴する前の風呂の水で入浴後の風呂の水の培地とほとんどコロニーの状況が変わらなかったこれにはつの理由が考えられる第一に浴槽の洗浄があまり行われていない不衛生な環境が水に影響を与えたという可能性つぎにサンプル採取後プレートに移す操作の段階で降下細菌が入った可能性である繁殖したコロニーの種類も同一であることから前者の可能性の方が高いと思われる 3

5 4. 多人数で入浴入浴の水と個人個人で入浴入浴の水の比較個人が入浴する前の風呂の水による培地で多くのコロニーが発見されたのに対して多人数で入浴する前の水ではほぼ無菌状態だったこれは後者の清掃がよく行き届いているためだと考えられる 5. 書写キャンパスキャンパスで採取採取したした土と播磨科学公園都市播磨科学公園都市キャンパスキャンパスしたしたサンプルサンプルの比較書写キャンパスで採取したコロニーはひとつひとつのコロニーの判別が難しいほど密集していて全く隙間のない状況だった一方播磨科学公園都市キャンパスで採取した土はコロニーの大きさも大きく書写では見られなかった線形のコロニーが見られたテーマ () 大腸菌の増殖曲線増殖曲線及び抗生物質抗生物質によるによる生育阻害 (a) 目的新鮮な培地において大腸菌がどのような増殖曲線を描くか抗生物質アンピシリンを加えることでどの程度増殖が抑制されるかを調べる (b) 材料液体培地大腸菌懸濁液アンピシリン溶液 (5mg/ml) (C) 方法番と番のつ液体培地を用意し番は何も加えないまま吸光度を測定し番は実験開始から 60 分後にアンピシリンを加えて吸光度を測定した液体培地が入った三角フラスコから ml の液体培地を無菌的に取り出しキュベットに入れ 660nm の吸光度 A660( 濁度 ) を測定しこれを Blank としたもう一つの液体培地についても同様の操作を行った個の三角フラスコの液体培地に大腸菌懸濁液をピペットマン滅菌済みブルーチップを用いて無菌的に取り出し分光光度計で 660nm の吸光度 A660( 濁度 ) を測定しこれを 0 分の懸度測定とした 37 で振盪培養を開始しそれぞれの三角フラスコから 0 分毎に ml ずつ無菌的に取り出し同様にして吸光度 A660( 濁度 ) を測定した培養開始 60 分後に片方の液体培地にピペットマン滅菌済みブルーチップを用いて滅菌的にアンピシリン溶液 (5mg/ml) を 0.4ml 加えアンピシリンなし () とアンピシリン入り () の液体培地での培養と 0 分毎の濁度の測定を 80 分まで行った (d) 結果 Blank はそれぞれとなった表に何も加えない () と実験開始から 60 分後にアンピシリンを加えた () の吸光度を示すグラフはそれぞれ縦軸を通常にとったグラフと対数をとったグラフである 4

6 表 : アンピシリンなし (), あり () の吸光度測定値時間 ( 分 ) の測定結果真の吸光度の測定結果真の吸光度グラフ. アンピシリン添加による吸光度の変化 ( 通常 ).5 ) m (n.5 度光吸 0.5 アンピシリンなしアンピシリン入り時間 ( 分 ) 5

7 グラフ. アンピシリン添加による吸光度の変化 ( 片対数 ) 0 ) m (n 度光吸アンピシリンなしアンピシリン入り時間 ( 分 ) グラフにおけるアンピシリンなし () の増殖曲線の形状からどの増殖段階であるかを判断するはじめに 0~0 分かけてはおだやかに細胞数が増加していることがうかがえることからこの間が遅滞期であると判断できるつぎに 0~00 分にかけてほぼ次関数のように細胞数が大きく増加していることから対数期であると判断できる最後に 00~80 分にかけて増殖速度が衰え始めていることから静止期であると判断したグラフにおけるアンピシリンあり () の増殖曲線からアンピシリンが増加曲線に与える影響を考えるアンピシリンを加える前までの増殖速度は () と一致している 60 分の吸光度計測後アンピシリンを加えたところ 80~00 分にかけて増殖速度が急激に減少したこれはアンピシリンによって細菌の細胞壁のペプチドグリカンの架橋合成が阻害されペプチドグリカンが薄くなり細胞の強度が低くなるそのため浸透圧により水が細胞内に流入し溶菌し大腸菌が死滅したことが予想できる細菌が死滅しても吸光度が Blank 値に戻らない点については考察で述べることとする対数期の細胞増殖速度は細胞数を N 増殖速度定数をμとすると ln N ln N 0 = µ ( t t0 ) で表せるグラフの対数期を次関数とみなし最小二乗法によって傾きを求めれば増殖速度定数 μを求めることができるグラフのアンピシリンを入れなかった培地 () において対数期を 0~00 分と判断し増殖速度定数と世代時間を求める表の値を以下の式に代入すると増殖速度定数 μ は 6

8 となる µ n xy x y n x x x = = = 0.39 よって細菌数が倍になるまでの時間の世代時間は ln = µt で表すことができ μ を代入し t を求めるととなった ln t = = ( 分 ) µ 表 : 増殖速度定数 μを計算計算するためにの培地培地の吸光度吸光度を変換変換したした値 n x x y xy グラフよりアンピシリンを測定開始 60 分後に入れた培地 () の対数期を 0~60 分と判断し増殖速度定数と世代時間を求める表 3 の値を以下の式に代入すると増殖速度定数 μは µ n xy x y n x x x = = = となる同様に t を求めると ln t = = ( 分 ) µ となった 7

9 表 3: 増殖速度定数 μを計算計算するためにの培地培地の吸光度吸光度を変換変換したした値 (e) 考察考察 n x x y xy アンピシリンを加えた培地 () での吸光度が Blank 値まで下がらない理由を考察する細菌の死骸が吸光度に与える影響アンピシリン溶液が吸光度に与える影響形質転換しアンピシリン耐性をもった大腸菌の出現実験操作の際にペプチドグリカンをもたない細菌の流入の恐れが挙げられるはじめに細菌の死骸が吸光度に与える影響が挙げられる Blank と () の溶液の違いは大腸菌懸濁液及びアンピシリンを加えているか否かである大腸菌が全てが死滅したとしてもその成分は培地中に残っているはずなのでこれが濁度が Blank まで下がらなかった理由と予想できるつぎにアンピシリン溶液が吸光度に与える影響だがこれは大腸菌を加えない培地にアンピシリンを加えて対照実験を行えば明確な結果が得られるはずであるさらに形質転換しアンピシリン耐性をもった大腸菌の出現について考察する形質転換しアンピシリンに対して耐性をもつ大腸菌が出現すれば吸光度はいずれ再び上昇し始めるはずである実際 60~80 分にかけてわずかに濁度が上昇し始めているこの先も吸光度を測定し続ければ対数期になり () のような増殖曲線を示したのだろうかわずか数十分の間に形質転換が起こるほど大腸菌の環境に対する適応性は高いのだろうかという点が疑問となるしかしながら形質転換が起こったとすればほかの可能性と比較してこれが最も測定値に影響を与えることとなる最後に実験操作の際にペプチドグリカンをもたない細菌の流入の恐れについてであるペプチドグリカンをもたない細菌にマイコプラズマが挙げられるしかしこの菌は多くが病原菌であり実験者に症状をもつものもない点日常生活ではあまり見る機会がない点から可能性はきわめて低いといえる 8

10 テーマ (3) 大腸菌の形質転換 (a) 目的新鮮な培地において大腸菌がどのような増殖曲線を描くか β-ラクタマーゼ遺伝子をもつプラスミド (pbr3) によって形質転換を生じさせ大腸菌の形質転換効率を求める (b) 材料材料液体培地プラスミド溶液 (pbr3 0ng) コンピテントセル希釈用滅菌水 (C) 方法方法エッペンドルフチューブ内のコンピテントセルを室温で溶かしすぐにアイスボックス内に移したプラスミド溶液 (pbr3 0ng) の入ったエッペンドルフチューブ及びプラスミドの入ってない滅菌済みのエッペンドルフチューブにそれぞれコンピテントセルをピペットマンで数回吸ったり吹いたりすることで均一な懸濁液にして分注しふたをして攪拌した後すぐにアイスボックス内に移した次にそれぞれのエッペンドルフチューブにコンピテントセルを 0.ml ずつ加え 37 で時間震盪培養した後底に沈んでいる菌体を良く混ぜそれぞれのサンプルに 0.ml ずつ準備しておいた.8ml の滅菌水に加え 0 倍に希釈したさらに菌体密度が均一になるように攪拌した後同様の 0 倍希釈を 4 回繰り返し倍希釈溶液を作成したつのサンプルの倍希釈溶液から 0.ml ずつ取り出しアンピシリンなしとアンピシリン入りのプレートに撒きコンラージ棒を用いて塗り広げインキュベーター内で裏返しにして 4 時間培養したその後プレートを取り出しプレート内のコロニー数を測定し大腸菌の形質転換効率を求めた (d) 結果結果アンピシリン入りなし各希釈倍率による大腸菌のコロニー数の変化を表 4 に示す表 4: 各希釈倍率によるによる大腸菌大腸菌のコロニーコロニー数アンピシリンなしアンピシリンあり希釈倍率プラスミドなしプラスミドありプラスミドなしプラスミドあり 0 一面一面プラスミド ng あたりの形質転換形質転換したした細胞数細胞数の算出今回使用したプラスミド溶液は 0ng である希釈倍率 0 倍の希釈液中で見つかった形質転換した大腸菌数が 7 個である 0 倍希釈液中のプラスミド溶液は 0ng なのでこれを 9

11 0 で割ればいいことになる計算すると 7 = 0.7( 個 ) 0 がプラスミド ng あたりの形質転換した細胞数と考えられる. 形質転換したした細胞細胞の割合割合の算出希釈倍率 0 倍のときにのみ形質転換した大腸菌が見られるが希釈倍率 0 倍のアンピシリンなしの大腸菌数は膨大で計測できなかったそこで希釈倍率 0 3 倍の大腸菌数を 00 倍した数をアンピシリンなしで増殖した大腸菌数とするすると 76 00=7600 個がアンピシリンなしプラスミドありで培養した大腸菌数となるよって形質転換した細胞の割合を算出するととなる = (%) (e) 考察考察希釈倍率が 0 3 倍の希釈液中では形質転換してアンピシリンを分解する β-ラクタマーゼという酵素をもつ大腸菌コロニーが数個見つかったが希釈倍率が 0 3 倍 0 5 倍の希釈液中では形質転換してアンピシリン耐性をもつ大腸菌はまったく発現しなかった理論値と比較しても非常に低い値であるこれはプラスミド (pbr3) が壊れて断片化していたためにこのような結果になったと推測できるテーマ (4) 紫外線照射によるによる殺菌効果 (a) 目的大腸菌に紫外線を照射しコロニーを計数し生存曲線を作成しそのグラフから半減期を求め大腸菌に対する紫外線の影響を調べる (b) 材料材料大腸菌懸濁液蛍光灯スタンド (C) 方法方法滅菌した試験管 (6 本 ) に希釈用滅菌水を.8ml ずつ分注しそこに大腸菌懸濁液 0.ml を無菌的に取り出し加え 0 倍希釈溶液としたさらに菌体密度が均一になるように攪拌し 0 倍希釈を繰り返し行い倍希釈溶液を作成した次にそれぞれの懸濁液から 0.ml ずつ採取しプレートに撒きコンラージ棒と回転台を用いて均一に広げ原液 0 3 倍希釈のものは 3 枚ずつ 0 6 倍希釈のものは 4 枚用意したそしてプレー 0

12 トをふたの上にして紫外線滅菌ランプの中央に置きランプが点灯したときにプレートのふたを開け原液 0 3 倍 0 6 倍の 3 枚のプレートそれぞれに秒間紫外線を照射したまた 0 6 倍希釈のプレート枚は紫外線の照射は行わなかったすべてのプレートを裏返しにして 37 に設定したインキュベーターで培養し翌日コロニー数を数えて生存曲線を描いた (d) 結果結果希釈濃度と紫外線照射時間の違いによる大腸菌コロニー数の変化を表 5 に示す表 5: 希釈濃度紫外線照射時間紫外線照射時間の違いによるいによる大腸菌大腸菌コロニーコロニー数の変化コロニー数 ( 個 ) 紫外線照射時間 ( 秒 ) 原液一面大腸菌数が一桁のサンプルを除きその計測数に溶液の希釈倍率をかけて希釈しない場合の生存細胞数を求め表 6 に示した表 6: 希釈しないない場合場合の生存細胞数紫外線照射時間 ( 秒 ) コロニー数 ( 個 )

13 グラフ 3. 紫外線照射による生存細胞数の時間変化大腸菌コロニー数 ( 個 ) 紫外線照射時間 ( 秒 ) 半分の細胞細胞を殺す照射時間照射時間の算出. 半分ある紫外線 (ΔD) を照射したときにある個体数が死亡した (-ΔN) とするこのときの死亡率 (- ΔN/N) は照射紫外線量に比例する N N これを微分方程式におきかえると dn N = α D = dαd ( α : 比例定数 ) となる被爆紫外線強度が一定なら時間 t の一次関数なのででありこれを代入し変形すると dn dt となるこれから N を求める D = βt dn N dn dt = dαβt = αβn ( β: 定数 ) = kn ( k = αβ )

14 これを積分すると dn N ln N = kt + C = kdt N = exp( kt + C) = e ( C : 積分定数 ) kt e C C N 0 = e (t=0 のときの細胞数 ) とおくと N kt = N 0 e () 以上より N = N 0 となる半減期までの時間を求めることができる紫外線照射時間を x コロニー数 ( 希釈前に換算した数 ) を y として最小二乗法のために変換したものが表 7 である表 7: 比例定数 k を計算計算するためにするために表 6 の測定値測定値を変換変換したした値 n x x y xy 表 7 より定数 k を求めるととなる k n xy x y n x x x = = = 細胞数が半減するとき N = N 0 とすることができる () 式を変形すると = e kt 3

15 となり k = を代入すると ln t = = kt ln k t =.44( 秒 ) となり半分の細胞を殺す照射時間は.44 秒となった (e) 考察紫外線の照射時間が 30 秒間行わると 0 秒間紫外線を照射しても無数のコロニーが見られた原液でもわずか 47 個のコロニーしかみられなかったこのことから紫外線照射が大腸菌に与える影響は大きいと考えることができる紫外線照射による殺菌のメカニズムについて記す紫外線 (50nm 前後 ) が細胞内の DNA に吸収され, 核酸の 5 つの塩基 ( アデニンシトシン, グアニンチミンウラシル ) が化学変化を起こし量体が形成され核酸がその複製機能が失われるこれによって細菌は増殖することができなくなる紫外線照射が無菌的な環境を作り出したいときに非常に有効な手段であると考えることができるグラム陰性菌である大腸菌を培地上で 99.9% 死滅させるのに必要な紫外線量は 5400µw sec/cm である日本では水道水の殺菌は塩素によって行われているが海外では紫外線による殺菌を行っている国もある 4

DNA/RNA調製法実験ガイド

DNA/RNA調製法実験ガイド DNA/RNA 調製法実験ガイド PCR の鋳型となる DNA を調製するにはいくつかの方法があり検体の種類や実験目的に応じて適切な方法を選択しますこの文書ではこれらの方法について実際の操作方法を具体的に解説しますまた RNA 調製の際の注意事項や RNA 調製用のキット等をご紹介します - 目次 - 1 実験に必要なもの 2 コロニーからの DNA 調製 3 増菌培養液からの DNA 調製