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せぴあさんきち
5 years ago
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1 五十嵐研雑誌会 No 修士二年宮野裕介 Aquifex の硫黄を介した呼吸経路はじめに Aquifex は当研究室の研究対象の柱の一つである Hydrogenobacter と近縁であり代謝経路には共通点が多い近年 Hydrogenobacter のゲノム情報が公開されたが Aquifex の方が先にゲノムを公開されたせいもあってか研究が盛んである Aquifex に関する研究報告は Hydrogenobacter にあてはまるものも多くそうでない場合でも違いを知るからこそ Hydrogenobacter の理解を深められることもあると思われる Aquifex と Hydrogenobacter は水素を唯一エネルギー源として生育する細菌であるそのため水素からエネルギーを取り出すメカニズムに関する研究は本菌の研究における重要な分野でありそのメカニズムにおける初発酵素であるヒドロゲナーゼに関する研究は多くなされている Hydrogenobacter thermophiles のゲノムからは4 種 (Hyd1,Hyd2,Hyd3 Hox) のヒドロゲナーゼの存在が示唆されており実際当研究室では膜結合型ヒドロゲナーゼ (Hox) が精製されている一方 Aquifex に関してはゲノムから 3 種 (Hyd1,Hyd2,Hyd3) のヒドロゲナーゼをもつことが示唆されておりそれらの3 種は既に精製されており Hyd1 と Hyd3 に関しては 2003 年に Hyd2 に関しては 2005 年に硫黄還元酵素複合体 (Hyd1,Hyd2 を含む ) として精製されている Hydrogenobacter との大きな違いの一つとして Aquifex の生育には培地成分として硫黄化合物 ( ただし H2S は除く ) が必要であることが挙げられるこの酵素複合体の発見に始まり 2010 年 Aquifex において新たな酵素複合体が精製されたことで Aquifex における硫黄代謝モデルが提案されるようになった今回の雑誌会ではその経緯を追うと共に 2010 年に発見された酵素複合体の論文を中心に紹介する一報目 : 硫黄還元酵素の発見 A Membrane-bound Multienzyme, Hydrogen-oxidizing, and Sulfur-reducing Complex from the Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus Received for publication, July 22, 2005, and in revised form, September 23, 2005 Published, JBC Papers in Press, October 19, 2005, DOI /jbc.M Marianne Guiral, Pascale Tron, Corinne Aubert, Alexandre Gloter, Chantal Iobbi-Nivol, and Marie-The re`se Giudici-Orticoni 上記で紹介したように 2005 年に Aquifex の Hyd2 は硫黄酵素還元複合体 (Hyd1 を含む ) として発見されたこの実験が成功したポイントは精製の際に使用する界面活性剤と保護剤の選択だと言われている (Table.1)Hyd1 と Hyd3 の精製の際には界面活性剤とし 1

2 て n-dodecyl β-d-maltoside(ddm) が用いられたしかし同様に DDM を用いて膜画分サンプルからこの硫黄酵素複合体の精製を試みてもヒドロゲナーゼ活性は検出されるが硫黄還元活性は検出されないところが界面活性剤に Deoxycholate 保護剤に ACA (aminocapric acid) とグリセロールを用いると硫黄還元活性 (SR) が検出されなぜかヒドロゲナーゼ活性も高い値が検出されたこの酵素複合体は硫黄還元活性とヒドロゲナーゼ活性がキノンを介して共役しており巨大な複合体となっているこのヒドロゲナーゼと硫黄還元酵素の複合体の発見により水素からエネルギーを取り出し授受するメカニズムに硫黄代謝酵素が関係していることが示唆されるようになったこの時点での硫黄代謝の構造を Fig.1 のように筆者は予想している二報目 : 硫化物依存の呼吸経路の示唆 New Insights into the Respiratory Chains of the Chemolithoautotrophic and Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus Marianne Guiral, Laurence Prunetti, Sabrina Lignon, Re gine Lebrun, Danielle Moinier, and Marie-The re`se Giudici-Orticoni Laboratoire de Bioe nerge tique et Inge nierie des Prote ines, IBSM-CNRS, 31 chemin Joseph Aiguier, Marseille cedex 20, France, and Service de Microse quenc age et de Spectrome trie de Masse, IBSM-CNRS, 31 chemin Joseph Aiguier, Marseille cedex 20, France Received September 18, 2008 この論文はブルーネイティブ電気泳動やマススペクトル解析などを駆使し Aquifex の細胞膜溶解物に含まれる酵素の活性を様々に解析したものであるこの実験から膜画分サンプルに Sqr(Sulfide quinone reductase) シトクローム c オキシダーゼシトクロームbccomplex 膜結合ヒドロゲナーゼキノンオキシダーゼの活性が見られた一報目の成果を受けヒドロゲナーゼから受け取った電子を硫化物が酸素に受け渡すのかということに関心が持たれたそこで Na2S を電子受容体として酸素消費量という観点から硫化物から酸素に電子を受け渡す活性があるのかということを調べた (Fig.2) この結果によるとキノンのアナログである AntymycinA で活性が抑制されたことから電子の授受にキノンが用いられていることが示唆されるまた KCN で活性が阻害されたことからシトクローム c オキシダーゼが関与していることが示唆されるこの時点で筆者が想定している Aquifex の呼吸代謝は以下のモデルである (Fig.3) 2

3 三報目 : 硫黄酸化酸素還元複合酵素の精製 New Functional Sulfide Oxidase-Oxygen Reductase Supercomplex in the Membrane of the Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus Received for publication, July 23, 2010, and in revised form, October 8, 2010 Published, JBC Papers in Press, October 22, 2010, DOI /jbc.M Laurence Prunetti, Pascale Infossi, Myriam Brugna, Christine Ebel, Marie-The re`se Giudici-Orticoni, and Marianne Guiral 二報目の結果を受け呼吸酵素への硫化物代謝酵素の関与を想定し呼吸酵素の精製を試みた以下にその過程で行われた実験について紹介する 1. 酵素複合体の精製シトクローム c オキシダーゼ活性を指標に酵素複合体を精製した Aquifex の細胞膜を界面活性剤 n-dodecyl β-d-maltoside(ddm) で溶解させたものを遠心しその上澄みを三つのカラム ( ヒドロキシアパタイトゲルカラムスーパーデックス 200 ゲルフィルタレーションカラム Q セファロースカラム ) に流し酵素複合体を精製したそしてそれをブルーネイティブゲル電気泳動で流したこの酵素複合体のバンドからはシトクローム c オキシダーゼ活性が検出された (Fig.4B) さらに下方の 50kDa と100kDa のところにも薄いバンドが見られたしかしそれらからはシトクローム c オキシダーゼ活性は検出されなかった 2. 酵素複合体の同定精製した酵素複合体を正確に同定するために 3 通りの実験を行った 1) イオントラップマススペクトル解析ブルーネイティブゲルからプロテインバンドを切り出しトリプシン処理した後イオントラップマススペクトル解析を行ったその結果上記のシトクローム c オキシダーゼ活性を持つ酵素複合体は CoxA 2 と CoxB 2 のサブユニットからなることが分かった (Table.2) 更に同一のバンドからシトクローム c とシトクローム b と Rieske 鉄硫黄タンパクからなるシトクロームbc 1 complex と Sqr が検出された (Table.2 の機能未知のタンパク質 aq_814 は BLAST 検索によるとセリンデヒドロゲナーゼプロテインアーゼとクロトナーゼと相同性を示した ( このタンパク質が酵素複合体の一部なのかは結局わかっていない ) 3

4 2)MALDI-TOF マススペクトル解析今度は酵素複合体を SDS-PAGE で泳動し (Fig.5A)MALDI-TOF マススペクトル解析を行った (Fig.5B) (Fig.5 では CoxA 2 は検出されなかったこの理由として CoxA 2 に高い疎水性があるのではないかと筆者は推測している ) 3) ウエスタンブロッティングネイティブ PAGE を行った後ウエスタンブロッティングを行い Sqr とシトクローム c オキシダーゼが同じバンドにあることを確認した (Fig.5C) 3. 複合体の均一性分析超遠心による沈降速度を確かめることで複合体の均一性を確かめたブルーネイティブで検出されたバンドが同一の物質由来であることを確認するための実験である (Fig.6) 4. 複合体の各酵素の活性 1) ブルーネイティブゲル泳動で現れた同一バンド上に複合体を形成しているシトクロームbc 1 complex とシトクローム c オキシダーゼと Sqr の活性があることを活性染色でそれぞれ調べたシトクロームbc 1 complex とシトクローム c オキシダーゼに関して酵素複合体と同じ 350kDa の位置で活性が見られた (Fig.4C)Sqr に関しては 350kDa の位置以外にも100kDa と50kDa のところにも活性がみられた (Fig.4D)100kDa と 50kDa のバンドに現れたものは平衡かい離によりできたものだと筆者は考えているまた Sqr についてだけ複数のバンドで活性が見られたことから Sqr は他の構成物質に比べかい離しやすいのではないかと考えられる 2)bc 1 complex とシトクローム c オキシダーゼと Sqr の活性が保たれているかを阻害剤を加えたことによる活性値の変化によって調べた (Table.3) その結果 Sqr とbc 1 complex はキノンのアナログである AntymycinA で活性が抑制されたシトクローム c オキシダーゼに関しては KCN で完全に活性が阻害された (Sqr に関して今回精製されたものは A.ferrooxidans などの別の種で発見されたものよりも活性が高い ) 3) 硫化物から酸素への電子の授受について調べた Sqr 活性と O 2 reductase 活性がカップリングしていることを確かめるために Na2S を電子供与体として用いて酸素消費量を調べることにより酵素複合体の H2S oxidase-o2 reductase 活性を調べた (Fig.7) その結果シトクローム c を加えるときは活性が上昇しキノンを加えても活性は上昇 4

5 しなかったこれは可溶性であるシトクロームcは精製過程で減少しており疎水性のキノンは複合体中に既に十分量あることを示唆していると考えられる 5.Sqr が酵素複合体を形成する機能的重要性について 1) Sqr が複合体を形成する意義を知るために Sqr を複合体から分離精製させた N 末アミノ酸シークエンスの結果 Sqr の N 末は膜貫通性ではなかった ( ペリプラズム側に Sqr がでていると思われるにも関わらずと筆者は書いているがそれを示すデータは載っていなかった ) 2) さらに複合体から自然かい離した Sqr も得られたらしくブルーネイティブゲルで流した結果自然かい離した Sqr では三量体の存在が見られないことが分かった (Fig.8) 3) また細胞膜から分離した Sqr と複合体を形成している Sqr の活性を比較した (Table.4) この結果から複合体を形成しているほうが基質との親和性が高いことが分かった ( しかし複合体のほうが安定であるとは言い難いように思われる ) まとめこれらの実験から硫黄酸化酵素と酸素還元酵素が複合体として存在していることが分かったこれは Sqr(Sulfide quinone reductase) が呼吸酵素複合体を作っている初めての報告であるこの酵素の発見により一報目の硫化物還元酵素複合体と合わせ Aquifex における硫黄代謝モデルが提案されるようになった (Fig.9) その精製された酵素複合体の特徴についてまとめる 1.H2S oxidase-o2 reductase 経路に関係する部位の安定性について今回の精製過程において可溶化は比較的厳しい条件で行い三段回の精製を行ったにもかかわらず複合体が安定していたことからこの複合体はミトコンドリアや他の微生物の呼吸経路における複合体より安定であると考えられるただこの複合体の構造は遺伝子的には予測できなかったものらしい 2. 酵素複合体における Sqr について Sqr は三量体を形成しているのではないかと筆者らは考えている ( 三量体の結晶構造に関する論文が別のところででている ) また今回の実験でブルーネイティブゲルで分離できた54kDa の Sqr に比べ酵素複合体の Sqr のほうが安定であることも調べてあるらしい ( しかしデータは示されていない ) 3.Aquifex における呼吸鎖の超分子構造の機能的重要性について複合体が形成される理由について筆者は次のように考えている一つは単一の酵素よりも複合体を形成しているほうが構造的に安定であることもう一つは単一の酵素に比べ親和性などの活性パラメーターが違うということ 5

6 おわりに今回 Aquifex のヒドロゲナーゼを精製した際硫黄還元酵素が複合体として発見された ( されてしまった?) ため水素から酸素に電子を受け渡す呼吸経路の間に硫黄代謝が関与することが示唆されたことから一連の研究がなされたそしてこれら三報の論文から以下の硫黄を介したエネルギー代謝モデルが提唱された (Aquifex の生育には水素と酸素だけでなく硫黄も添加する必要があるこのモデルはその硫黄の必要性を示しているのだろうと思われるしかしここでいくつか疑問が残る一つは Sulfur globules について細胞内に Sulfur globules の存在は過去に電子顕微鏡で確認されているこの細胞内の Sulfur globules からの硫黄を用いて電子の授受をしているように思われるしかしそもそもなぜ細胞内に Sulfur globules があるのかまた必要なのか?Aquifex が採取されたところは深海や火山帯であるそのため硫黄は多かったが酸素は少なく酸素を多く使う呼吸経路は発達してこなかったということが影響しているのだろうか? 酸素の代わりに還元力の捨て場として豊富にある硫黄を体内に蓄積するようになったのだろうか? 二つめはなぜ硫黄化合物として H2S では生育できないのか? 前述の通り Aquifex の生育には水素と酸素と硫黄または硫化物が必要とされているしかし水素の代わりに H2S では生育できないことが知られている今回提唱されたモデルでは Sulfur reductase によって細胞内に H2S が発生しそれが細胞外に出てから Sqr によって電子の授受が開始されているそうであるならば H2S を添加したときは Sqr を含む複合体だけで呼吸が完結し生育が可能になってしまうのであろうか? 呼吸は完結したとしても RTCA サイクルが回せないことが問題なのであろうか? そうであるならヒドロゲナーゼ硫黄還元酵素複合体のヒドロゲナーゼ以外のヒドロゲナーゼ (Hyd1 と Hyd3) が RTCA サイクルに関わっているということなのだろうか? 今回 Aquifex のヒドロゲナーゼの複合体というものに興味を持ち硫黄代謝の話へと広がっていったヒドロゲナーゼというと通常酸素に弱いと言われているそのため生育に酸素を必要とする Aquifex におけるヒドロゲナーゼの酸素耐性についても興味が持たれる今回紹介した論文を読む過程でそれについての論文もいくつか見受けられたそちらも今後読み進めていきたいと思う筆者らはエネルギー代謝経路を明らかにすることで Aquifex の生育においてなぜ水素と酸素と硫黄が必要なのかを解明することに注力するそうである今後の Aquifex のエネルギー代謝に関する研究が更なる進展を遂げることに期待すると共に近縁種である Hydrogenobacter の研究にも尽力したい 6

7 Table.1 Fig.1 Fig.2 Fig.3 1

8 Table.2 Fig.4 Fig.5 Table.3 2

9 Fig.7 Fig.6 Fig.8 3

10 Table.4 Fig.9 4

Microsoft PowerPoint - 雑誌会 pptx

Microsoft PowerPoint - 雑誌会 pptx 石井研雑誌会 No. 1148 2014. 1. 17 新井博之 Neisseria gonorrhoeae における cbb 3 oxidase の CcoP サブユニットと cytochrome c 2 を介した微好気呼吸と脱窒のリンク背景 1 Neisseria gonorrhoeae (gocococcus, 淋菌 ) -proteobacteria の病原性菌末端酸化酵素は cbb 3