狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認技術資料狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認田村直也飯田将行堀内雅之荒尾恵石丸雅敏安田博美 1 ( 平成 27 年 8 月 11 日受付平成 27 年

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まなさくいし
5 years ago
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1 狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認技術資料狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認田村直也飯田将行堀内雅之荒尾恵石丸雅敏安田博美 1 ( 平成 27 年 8 月 11 日受付平成 27 年 11 月 27 日受理 ) 1 株式会社微生物化学研究所 TECNICAL REPORT Validity of Reference Vaccine(Lot No. 4) for Potency Test of Tissue Culture Inactivated Rabies Vaccine Naoya TAMURA, Masayuki IIDA, Noriyuki HORIUCH, Megumi ARAO, Masatosihi ISHIMARU, Hiromi YASUDA 1 National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Tokura, Kokubunji-Shi, Tokyo, Japan ( Received: 11th August 2015, Accepted: 27th November 2015) 1 Kyoto Biken Laboratories,Inc. Abstract A reference vaccine for a potency test of a tissue culture inactivated rabies vaccine was used as an index for measuring the effective antigen concentration of test vaccines using the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(elisa). In this study, the efficacy of different concentrations of the new reference vaccine was examined. All test concentrations of the new reference vaccine induced neutralizing antibody titers that exceeded 1:10 three months after immunization of dogs. In mice, the effective dose and international unit in NIH potency test of the new reference vaccine,dissolved in 8.0 ml, were ED50 and 3.08 IU/ml, respectively. As a result of comparing the titer with the present reference vaccine by ELISA using the sample which dissolved the new reference vaccine to become 1 IU/ml from the results of the the National Institutes of Health(NIH) potency test, the relative titer of this sample was approximately 1:1. These results indicate that the new reference vaccine will induce sufficient neutralizing antibody titers in dogs to protect them against rabies for up to 1 year. In addition, the results showed that the new reference vaccine should be diluted 3.08 times after dissolution in 8.0 ml to give an antigen value equivalent to the present reference vaccine. 要旨狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチン ( 参照ワクチン ) はサンドイッチ ELISA により被検狂犬病ワクチン中の有効抗原量を相対的に測定する際の指標とし

2 田村直也飯田将行堀内雅之荒尾恵石丸雅敏安田博美て用いられている今回新たに製造した参照ワクチンロット 4 の有効性を検討した犬における接種後 3 ヶ月目の全ての試験群で 10 倍以上の中和抗体価が認められた 8.0 ml に溶解した参照ワクチンロット 4 のマウスにおける有効量は ED 50 であり NIH 法による力価は 3.08 IU/ml であった NIH 法で得られた成績から 1 IU/ml となるように調整した参照ワクチンロット 4 の参照ワクチンロット 3 に対する ELISA による相対力価はおよそ 1 であった以上の試験により参照ワクチンロット 4 は犬に対して 1 年間の感染防御が可能な抗体を賦与できるものと推察されたまた参照ワクチンロット 4 を参照ワクチンロット 3 と同等の抗原量に調整するには 8.0 ml で調整後 3.08 倍希釈することが適当であることが示唆された緒言狂犬病組織培養不活化ワクチン ( 狂犬病ワクチン ) の力価試験用参照ワクチン ( 参照ワクチン ) は動物用生物学的製剤基準 ( 動生剤基準 )( 農林水産省 2002) に規定されたサンドイッチ ELISA( ELISA) により被検狂犬病ワクチン中の有効抗原量を相対的に測定する際の指標として用いられる参照ワクチンロット No.3 は財団法人化学及血清療法研究所 ( 化血研 ) が平成 14 年 6 月に製造したもので狂犬病ワクチンとしての有効性については犬に対して少なくとも 1 年間の感染防御が可能な抗体価を賦与できるものであることモルモットを用いた力価試験法 ( モルモット法 ) で試験群の耐過率 70 % 以上であること及びマウスを用いた力価試験 ( NIH 法 ) で 2.81 国際単位 ( IU) を示すことにより確認されている ( 小林ら 2003) これまで凍結乾燥品である参照ワクチンの保存安定性については参照ワクチンロット No.3 を用いて経時的な確認を行い製造後 10 年までは安定であることが確認されているしかしながら参照ワクチンの最終的な有効期間は不明であり参照ワクチンロット No.3 の保存年数が 9 年を超えたことから品質の確かな参照ワクチンを供給する目的で化血研が平成 23 年 5 月に参照ワクチンロット 4 を製造した参照ワクチンロット No.4 について犬における抗体応答試験及び NIH 法により狂犬病ワクチンとしての有効性確認を行ったまた参照ワクチンロット No.3 と同等な抗原量となる参照ワクチンロット No.4 の溶解量の確認には ELISA を用いた相対力価試験を行った Ⅰ 犬における抗体応答試験対象動物である犬における免疫応答が確実に起こっていることまたその反応の程度を確認することにより参照ワクチンロット No.4 の狂犬病ワクチンとしての有効性を検討するため犬における抗体応答試験を行った 1 試験材料 1 ) 供試ワクチン参照ワクチンロット No.4 を滅菌精製水 2.4 ml で溶解後 1.6 ml のリン酸緩衝食塩液 ( PBS) を加えて全量 4.0 ml としたものを原液として用いた 2 ) 試験動物狂犬病ウイルス抗体陰性の約 6 ヶ月齢ビーグル犬 9 頭 ( 雄 5 頭雌 4 頭 ) を用いた 2 試験方法参照ワクチンロット No.4 の原液 PBS で 2 倍及び 4 倍に希釈したものをそれぞれ 3 頭に

3 狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認 ml ずつ皮下注射した接種前接種後 1 ヶ月目及び 3 ヶ月目に採血し中和用ウイルスとして RC HL 株を用いた間接イムノペルオキシダーゼ法を応用した試験法 ( Hirayama ら 1990) により狂犬病ウイルスに対する血清中和抗体価を測定した 3 結果及び考察抗体応答は全ての個体で認められ中和抗体価は幾何平均値 ( GM) で接種後 1 ヶ月目で原液群が 512 倍 2 倍希釈液群が 406 倍 4 倍希釈液群が 128 倍に上昇した接種後 3 ヶ月目には原液群が 161 倍 2 倍希釈液群が 81 倍 4 倍希釈液群が 128 倍になり中和抗体価はやや低下したが各群全ての個体が感染防御に有効とされる 10 倍以上 ( 石川ら 1989) を有していた ( Table1) 1.55 IU/ml に調整した参照ワクチンロット 2 の接種後 3 ヶ月目の中和抗体価は 51 倍 ( 金井ら 1997) IU/ml 及び IU/ml に調整した参照ワクチンロット 3 は 72 倍及び 43 倍であり ( 小林ら 2003) 1.54 IU/ml に調整した参照ワクチンロット 4 は 128 倍であることから参照ワクチンロット 4 は参照ワクチンロット 2 及び参照ワクチンロット 3 と同等以上の抗体価を賦与できるものと考えられるまた参照ワクチンロット 2 及び参照ワクチンロット 3 は概ね 1 年間 10 倍以上の中和抗体価が持続される傾向にある ( 金井ら 1997 Gamoh ら 2003) これらのことより参照ワクチンロット No.4 は犬に対して 1 年間の感染防御が可能な抗体価を賦与できるものと推察された Ⅱ NIH 法 NIH 法は試験ごとの成績のばらつきが大きいが ( Barth ら 1988) 世界的に広く採用されている狂犬病ワクチンの力価試験法であることから ( Seligmann 1973) NIH 法により求めた参照ワクチンロット 4 の力価 ( 国際単位 ) と参照ワクチンロット 3 の力価を比較することにより有効性を確認した 1 試験材料 1 ) 供試ワクチン参照ワクチンロット No.4 を滅菌精製水 2.4 ml で溶解後 5.6 ml の PBS を加えて全量を 8.0 ml としたものを用いた WHO から入手した第 6 次国際標準狂犬病ワクチン ( The sixth international standard for Rabies vaccine) については滅菌精製水 1.0 ml で溶解後 3.0 ml の PBS を加えて全量を 2 IU/ml としたものを用いた 2 ) 試験動物 4 週齢 ddy 系雌マウスを用いた 3 ) 攻撃ウイルス狂犬病ウイルス CVS 株のマウス感染脳乳剤を 2 % 馬血清加生理食塩液で 25 LD 50 /0.03 ml を目安に調整したものを用いた 2 試験方法参照ワクチンロット No.4 及び国際標準ワクチンをそれぞれ PBS で 5 倍 25 倍 125 倍及び 625 倍に希釈しそれぞれ 16 匹のマウスの腹腔内に 0.5ml ずつ 1 週間隔で 2 回注射した初回免疫後 14 日目に免疫群のマウスに攻撃ウイルスを 0.03 ml ずつ脳内接種し 14 日間観察した観察期間中神経症状を伴う異常及び死亡した個体数から各ワクチンの 50 % 有効量 ( ED50) を算出し次式により国際単位を求めた参照ワクチン IU = 参照ワクチン ED50/ 国際標準ワクチン ED 結果及び考察参照ワクチンロット No.4 の ED50 は国際標準ワクチンのそれはであった ( Table

4 田村直也飯田将行堀内雅之荒尾恵石丸雅敏安田博美 2) また攻撃ウイルス量は 10 LD50 であり規格とされている 10 ~ 100 LD50 に適合していた参照ワクチン No.4 の力価は 3.08 IU/ml であり参照ワクチンロット No.3 の成績である 2.81 IU/ml( 小林ら 2003) と近似の値を示したなお WHO において推奨されている動物用狂犬病不活化ワクチンに必要な力価は 1 ドーズ当たり 1 IU 以上であり参照ワクチンロット No.4 は十分な力価を有していることが確認された Ⅲ ELISA による相対力価定量試験 ELISA は狂犬病ワクチン中の抗原量を直接定量する試験法で平成 8 年度から動生剤基準に力価試験法として採用されている NIH 法で得られた成績から参照ワクチンロット No.4 及び参照ワクチンロット No.3 をそれぞれ 1 IU/ml となるように調整した試料について ELISA による力価試験を行い参照ワクチンロット No.4 の調整量の妥当性を参照ワクチンロット No.3 と比較することにより確認した 1 試験材料 NIH 法で得られた成績から 1 IU/ml となるように参照ワクチンロット No.4 は 2.4 ml の滅菌精製水で溶解後 PBS を 5.6 ml 加えて全量 8 ml としたものに更に抗原希釈液を加えて 3.08 倍に希釈したものを原液とした同様に参照ワクチンロット No.3 は 2.4 ml の滅菌精製水で溶解後 PBS を 0.8 ml 加えて全量 3.2 ml としたものに更に抗原希釈液を加えて 2.81 倍希釈したものを原液とした 2 試験方法試験は動生剤基準の狂犬病ワクチン力価試験法 ( 農林水産省 2002) に準じて行った供試ワクチンの原液を規定された処理後その 4 ml について液体クロマトグラフィーにより第 1 分画のピークを採取し ELISA 試料の原液としたこの ELISA 試料の原液及び抗原希釈液で更に 2 倍 4 倍に希釈ものをそれぞれ ELISA により OD 値を測定し参照ワクチンロット No.3 に対する参照ワクチンロット No.4 の相対力価を算出した 3 結果及び考察 NIH 法の成績から 1 IU/ml となるよう調整した参照ワクチンロット No.4 の参照ワクチンロット No.3 に対する相対力価は 1.091( Table3) であり 1 に近い値となったことから参照ワクチンロット No.4 を力価試験に用いる場合の調整量については 8.0 ml を 3.08 倍希釈してすることが妥当と考えられた Ⅳ まとめ以上の試験により今回新たに製造された参照ワクチンロット No.4 は犬に対して 1 年間の感染防御が可能な抗体を賦与できるものと推察され狂犬病ワクチンとしての有効性が確認されたまた参照ワクチンロット No.3 と同等の抗原量を含有するには NIH 法の成績 ELISA による相対力価試験成績から参照ワクチンロット No.4 を 8.0 ml で調整後更に 3.08 倍希釈し力価試験に供することが適当であることが示唆された引用文献 Barth, R., Diderrch, G. & Weinmann, E.(1988)NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine 6, Gamoh, K., Shimazaki, Y., Senda, M., Makie, H., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., & Hatakeyama, H

5 狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.4 の有効性確認 (2003)Establishment of a potency test by ELISA for a rabies vaccine for animal use in Japan. Journal of Veterinary Medical Science 65, Hirayama, N., Raharjo Jusa, E., Aeny Rochman Noor, M., Sasaki, K. & Ogata, M.(1990)Immune state of dogs injected with rabies vaccines in the West Java, Indonesia. Japanese Jouenal of Veterinary Science 52, 石川義久鮫島都郷野村吉利本橋常正田坂邦安 (1989) 細胞培養順化狂犬病ウイルス RC HL 株から調整した不活化ワクチンの免疫原性. 日本獣医師会雑誌 42, 金井洋子蒲生恒一郎千田恵伊藤治銀永明弘 (1997) 狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンの更新. 動物医薬品検査所年報 34, 小林理絵子蒲生恒一郎千田恵井上剛光伊藤治江副伸介銀永明弘 (2003) 狂犬病組織培養不活化ワクチンの力価試験用参照ワクチンロット No.3 の有効性確認. 動物医薬品検査所年報 40, Lyng, J., Bentzon, M. W., Ferguson, M. & Fitzgerald, E. A.(1992)Rabies vaccine standardization: international collaborative study for the characterization of the fifth international standard for rabies vaccine. Biologicals 20, 農林水産省 (2002) 動物用生物学的製剤基準. ( 平成 14 年 10 月 ) 医薬品各条狂犬病組織培養不活化ワクチン Seligmann, E. B.(1973) The NIH test for potency. In Laboratory Techniques in Rabies. 3rd edn. Eds. Kalpan, M. M. & Koprowski, H. pp World Health Organization, Genova

6 Table 1 Neutralising antibody titers in dogs induced by the new reference vaccine Months post inoculation Vacccine dilution Dog No. Pre. 1 3 Undiluted 1 < < < GM * < fold dilution 4 < < < GM < fold dilution 7 < < < GM < * GM:Geometric mean Table 2. Potency of new reference vaccine by NIH potency test New reference International Potency of the Potency of the vaccine standard new reference challenge virus vaccine * vaccine (ED50) (ED50) (IU/ml) (LD50/0.03ml) * The sixth international standard for rabies vaccine(2iu/ml) Table3. Relative potency of the new reference vaccine Test No. Relative potency Geometric mean

日本脳炎不活化ワクチン ( シード ) 平成 24 年 7 月 4 日 ( 告示第 1622 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した日本脳炎ウイルスを同規格に適合した株化細胞で増殖させて得たウイルス液を不活化したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株名称日本脳炎ウイル

日本脳炎不活化ワクチン ( シード ) 平成 24 年 7 月 4 日 ( 告示第 1622 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した日本脳炎ウイルスを同規格に適合した株化細胞で増殖させて得たウイルス液を不活化したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株 2.1.1 名称日本脳炎ウイルス中山株薬検系又はこれと同等と認められた株 2.1.2 性状豚腎初代細胞で増殖しがちょう鶏初生ひな及びはとの赤血球を凝集する