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きのこあざみ
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1 Cytometry Research 27(2):51 ~ 56,2017 総説患者腫瘍移植マウスモデル (Patient-Derived Tumor Xenograft:PDX) とその活用 - 個別化がん治療 (Precision Cancer Medicine) に向けて - 岡田誠治 Establishment of Patient-derived tumor xenograft (PDX) model and application for precision cancer medicine. Seiji Okada, M.D., Ph.D. Division of Hematopoiesis, Center for AIDS Research, Kumamoto University Abstract Patient-derived xenograft (PDX) models can be created with transplantation of cancerous cells or tissues from patient s primary tumors into immunodeficient mice. PDX technology leads to the breakthrough with the introduction of novel highly immunodeficient mice such as NOG (NOD/Scid/IL2Rγ null ), NSG (NOD/Scid/IL2Rγ null ), and NOJ (NOD/Scid/ Jak3 null ) mice. As PDX has been shown to conserve human original tumor characteristics, it is now getting standard methods to evaluate the drug sensitivity, and PDX library is now established in many organization with integrated genomic signature. These PDX data base are getting powerful tool for advancing Precision Cancer Medicine. Key words : highly immunodeficient mice; PDX (Patient-derived xenograft) model; precision medicine Ⅰ. はじめに悪性腫瘍の病態解析や新規治療法の開発には, 適切な解析系 ( モデル動物 in vitro in vivo 実験系 ) が必要であるこれまでに, 様々なマウス腫瘍モデルや腫瘍細胞株などが用いられてきたが, これらのモデルは必ずしも腫瘍の臨床病態を反映しうるものではなく, 前臨床試験結果が臨床応用に直結するものではなかった ( 表 1) 1, 2) そのため, 前臨床試験で有効とされた薬剤が, 臨床試験で無効となる事例がかなりの確率で認められた近年, 様々な高度免疫不全マウスが熊本大学エイズ学研究センター受付日 : 平成 29 年 9 月 19 日受理日 : 平成 29 年 10 月 9 日開発され, ヒト腫瘍細胞の移植効率が上がり, 患者腫瘍移植マウスモデル (Patient-derived tumor xenograft: PDX) の作成が容易になった 2) PDX は, 患者由来腫瘍の特徴を保持しているため, 腫瘍の病態解析, 幹細胞解析, 腫瘍マーカー解析, 薬剤開発等への活用が強く期待されている本稿では,PDX マウスを用いたがん研究の進歩と個別化がん医療 (Precision cancer medicine) の確立に向けての展望について概説する Ⅱ. 患者腫瘍移植マウスモデル (Patient Derived Tumor Xenograft:PDX モデル ) PDX モデルは, 患者由来の腫瘍サンプルを免疫不全マウスに移植する事で作成する ( 図 1) 3) 通常, 移植後数ヶ月以内に腫瘍増殖が認められるので (F0), その一部で遺伝子解析 (WES:whole exosome sequencing, 51

Application of Patient-derived tumor xenograft 表 1 汎用される腫瘍のマウスモデルタイプ Subtype 例特徴マウス腫瘍同系移植腫瘍誘導遺伝子改変 B16 悪性黒色腫放射線による皮膚腫瘍発がん物質投与 PIP-Tag マウス膵島拒絶反応無し免疫反応あり必ずしもヒトの腫瘍を再現していないヒト腫瘍細胞株ヒト由来腫瘍細胞株遺伝子導入など

2 Application of Patient-derived tumor xenograft 表 1 汎用される腫瘍のマウスモデルタイプ Subtype 例特徴マウス腫瘍同系移植腫瘍誘導遺伝子改変 B16 悪性黒色腫放射線による皮膚腫瘍発がん物質投与 PIP-Tag マウス膵島拒絶反応無し免疫反応あり必ずしもヒトの腫瘍を再現していないヒト腫瘍細胞株ヒト由来腫瘍細胞株遺伝子導入など HCT116 大腸癌細胞株 FLT3- 依存性 BaF/3 細胞細胞株と腫瘍では遺伝子 Profile や薬剤耐性などが異なることがある免疫不全マウスを用いるので免疫反応が見にくい遺伝子操作が可能患者由来腫瘍細胞移植 (Patient-derived xenograft:pdx) 文献 1) より改変皮下移植同所移植大腸癌, 胃癌など患者由来の腫瘍の特徴を有している個別化医療に応用が期待される図 1 Patient-derived xenograft (PDX) モデル患者由来の腫瘍細胞を高度免疫不全マウスに移植すると数ヶ月以内にマウス体内で腫瘍増殖が認められる増殖した腫瘍を取り出し, 一部は遺伝子解析を行い, 一部は再び高度免疫不全マウスへ移植する増殖した腫瘍を PDX モデルバンクとして冷凍保存するこれらの腫瘍を再び高度免疫不全マウスに移植して, 薬剤感受性検査を行うこれらの PDX 腫瘍, 遺伝子解析データ, 薬剤感受性データをデータベース化する事で, 腫瘍の特性に応じた Precision Cancer Medicine への活用が期待できる RNA-sequencing, CNA:copy number alteration 解析等 ) を行って腫瘍の遺伝学的特徴を解析し, 一部を PDX 組織バンクとして保存する一部は次の免疫不全マウスに移植し (F1), 増殖した腫瘍を大量に凍結保存するこれらの腫瘍を同時に多くのマウスに移植して治療候補薬を投与することで, 患者に有効な治療薬のスクリーニングが可能となり, 遺伝子解析結果及び臨床データと照合することで個別化医療への道を拓くことが可能となる PDX モデルでは, 継代が進むにつれてマウス体内における腫瘍増殖が加速するが,F3 程度では, 患者由来サンプルと遺伝子発現プロフィールはほぼ一致し, その後, 継代する毎に遺伝子プロフィールが変化することが示されている 4) そのため,PDX モデルを用いた評価には,F3 までの腫瘍を用いる事が推奨されている PDX 腫瘍は, 細胞株よりも患者由来の腫瘍の遺伝 52

3 Cytometry Research 27(2):51 ~ 56,2017 表 2 PDX に汎用される免疫不全マウスマウス NOG, NSG a), NOJ b) NOD c) Rag-2/γc KO d) Rag-2/Jak3KO e) NOD/Scid f) Balb/c Rag-2/γc KO Rag-2/Jak3 KO Balb/c 免疫系成熟 T 細胞なしなしなしなしなし成熟 B 細胞なしなしなしなしあり NK 細胞なしなし機能不全なしあり樹状細胞機能不全機能不全機能不全正常正常マクロファージ機能不全機能不全機能不全正常正常補体活性なしなしなしありありリーク * なしなしありなしあり放射線感受性高い低い高い低い低いリンパ腫発症率低い低い高い低い低い長所考慮する点ヒト正常細胞腫瘍細胞の移植に最も適している放射線感受性が高いヒト正常細胞腫瘍細胞の移植に最も適しているヒト血液系細胞を含む正常細胞腫瘍細胞の移植が可能放射線感受性が高い 8-9 ヶ月で胸腺腫ができやすい寿命が短いヒト正常細胞腫瘍細胞の移植に適しているストレスに強く, 繁殖が容易無毛のため, 皮下移植した腫瘍の評価がしやすい自然免疫は正常造血系腫瘍はほとんど生着しない a) NOG,NSG:NOD/Scid/ common γ 鎖欠損マウス, b) NOJ:NOD/Scid/Jak3 欠損マウス c) NOD:Non-obese diabetes, d) Rag-2/γc KO:Rag-2/common γ 鎖二重欠損マウス e) Rag-2/Jak3 KO: Rag-2/Jak3 二重欠損マウス, f) NOD/Scid:Non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency * リーク (leakage):scid マウスでは, 成熟したリンパ球は認められないが, 一部の個体で少数のリンパ球が出現することがあり, リーク (leakage) と呼ばれている 22) Rag-1/Rag-2 遺伝子欠損マウスのような遺伝子改変マウスではこのような現象は認められない乳癌大腸癌腫瘍マウス移植場所移植効率頭頸部癌 ( 扁平上皮癌 ) Scid/Beige, NSG NSG 皮下乳房脂肪組織乳房脂肪組織ヒト化乳房脂肪組織皮下皮下同所皮下皮下 13% 27% 19-21% 13% 87% 64% 89% 85% 54% 髄芽腫 Rag2/scid 同所 52% 肺非小細胞癌膵臓癌 ( 腺癌 ) ICR SCID 皮下腎皮膜下皮下同所皮下 25% 90% 61% 62% 67% 黒色腫 ( ぶどう膜 ) 皮下 28% 文献 2) より改変表 3 様々な腫瘍における PDX の移植効率 53

Application of Patient-derived tumor xenograft 学的特徴や腫瘍の Heterogeneity を保持しており, 腫瘍内に間質細胞がん関連線維芽細胞 (Cancer associated fibroblast:caf) や腫瘍マクロファージ (Tumor associated macrophage:tam)

4 Application of Patient-derived tumor xenograft 学的特徴や腫瘍の Heterogeneity を保持しており, 腫瘍内に間質細胞がん関連線維芽細胞 (Cancer associated fibroblast:caf) や腫瘍マクロファージ (Tumor associated macrophage:tam) などの患者由来の細胞が含まれていることから, 現在最も腫瘍の臨床状態に近いモデルとして, 腫瘍の臨床病態解析や薬剤開発への活用が期待されている PDX モデルに使用される免疫不全マウスには, 長期にわたりマウスが使用されてきたその移植効率は満足の得られるレベルではなかったが, マウスは無毛のため, 皮下移植した腫瘍の評価がしやすいという長所があり, 今でも多くの施設で用いられている近年, 様々な免疫不全を示す高度免疫不全マウスが開発されたため,PDX モデルの移植効率は格段に進歩した ( 表 2) しかし, 高度免疫不全マウスの長期飼育は,SPF(Specific pathogen free) 環境での飼育が必要であり, 繁殖も難しいため, それらのマウスの長所短所を見極めて標的とする腫瘍に最適なマウスを使用することが望ましい PDX モデル樹立には通常 3-6 ヶ月の時間を要する点も考慮が必要である最近, 無毛超高度免疫不全マウスも開発されており, 今後 PDX モデルモデルへの活用が期待できる 5, 6) PDX モデルでは, 移植する腫瘍によりその生着率が異なっている ( 表 3) 大腸がんや膵臓がんでは移植効率が高く, マウスを使用してもある程度の成果が期待できる一方, 造血器腫瘍による PDX モデル樹立には,NOG(NOD/Scid/IL2Rγ null ),NSG(NOD/ Scid/IL2Rγ null ),NOJ(NOD/Scid/Jak3 null ) マウスのような超高度免疫不全マウスを使用する必要がある 7, 8) 一般的に免疫不全度の高いマウスの方が移植効率は良い傾向にあるが, 免疫不全度が高いと飼育が難しいという欠点がある我々の経験では, 胆管細胞がんでは BALB/c Rag-2/Jak3 二重欠損マウスで充分な移植効率を示した一方, 造血器腫瘍においては BALB/ c Rag-2/Jak3 二重欠損マウスでは生着が認められず, NOJ マウス ( 図 2) 及び NOD Rag-2/Jak3 二重欠損マウスでは PDX の樹立可能であった 9) また, 悪性度の高い腫瘍ほど, 原発巣より転移巣のほうが PDX が樹立できる確率は高い 2) 移植部位は, 皮下移植が簡便であり, 腫瘍増殖の評価も容易なため, 一般的に用いられている ( 表 3, 表 4) しかし, 乳がんや前立腺がんでは皮下移植での移植効図 2 NOD/Scid/Jak3 欠損マウス (NOJ マウス ) A. 最も高度な免疫不全を呈するマウスの一つであり,PDX モデルの作成に極めて有用である 21) B. NOJ マウスでは,NK 細胞 (CD122 + DX5 + ),T 細胞 (CD3 + ),B 細胞 (CD19 + ) が存在しない他にマクロファージと樹状細胞の機能障害及び補体活性欠損を示す 54

5 Cytometry Research 27(2):51 ~ 56,2017 表 4 PDX の移植部位移植場所長所欠点皮下移植手技が簡単腫瘍により生着率は低め腎皮膜下生着率が良い手技が複雑腫瘍増殖が見にくい同所移植生着率が良い臓器によっては手技が複雑腫瘍増殖が見にくい場合がある率は極めて低く, 乳がんは雌マウスの乳腺に, 前立腺は雄マウスの前立腺に移植する同所移植により, 効率良く PDX が作成されるまた, 乳がんや前立腺がんなどのホルモン依存性腫瘍では, ヒトホルモン補充により移植効率が高くなることが知られているこのように,PDX モデル樹立にあたっては,1 移植するマウスの選定,2 移植部位,3 腫瘍の特質に基づいた補助, が重要な要素となる Ⅲ.PDX モデルの現状と今後の課題最近, 米国国立がん研究所 (US National Cancer Institute:NCI) は, 従来薬剤スクリーニングに用いてきた腫瘍細胞パネル NCI-60 10) から,PDX にシフトすると発表している 11) しかし,PDX はその樹立に時間がかかり, また, すべての腫瘍で樹立できるわけではないそのため, 現時点では腫瘍を提供した患者の個別医療に直接関与するのが困難であるそのため, PDX の樹立に伴い遺伝子解析や薬剤感受性検査を行い, 腫瘍の特性と臨床情報を同時に解析し, データベース化する事で腫瘍の特性に応じた個別化医療への活用が期待されているヨーロッパでは 16 の研究機関が共同で立ち上げたコンソーシアム EurOPDX を樹立し, 既に 30 種類以上の固形腫瘍における 1500 例以上のサンプルを保有している 12) 米国ジャクソン研究所も既に 450 例以上のサンプルを保有し, その提供を開始している 7) また, 製薬企業も独自に PDX ライブラリーを作成しており, ノバルティス社は 1000 種類以上の PDX を使った薬剤スクリーニング結果を報告している 13) 腫瘍の特性には人種差や地域差があるため, 本邦においてもこのような大規模な PDX ライブラリーの樹立が必要であるまた, 現在は大腸癌乳癌のような症例数が多く PDX が樹立しやすい症例のライブラリーが中心であるが, 希少腫瘍の PDX ライブラリー作成も今後の重要課題である PDX は高度免疫不全マウスにヒト腫瘍細胞を移植するため, 免疫反応がほとんど認められないヒトの造血幹細胞や末梢血単核球を移植する事で, 高度免疫不全マウス内でヒト免疫系を再現する試みがなされているが, 現時点ではヒトの複雑な免疫系, 特に獲得免疫を完全に再現したマウスは存在しない 14, 15) 一方, NK 細胞やγδ 細胞等の個別の免疫細胞が生着する超高度免疫不全マウスは開発されており 16, 17), これらの免疫細胞の抗腫瘍作用や抗体療法の有効性を PDX モデルで解析することは可能になっているまた, ヒトのサイトカインを産生する高度免疫不全マウスなどが開発されており, 近い将来, 免疫不全マウス内でヒト免疫系とヒト腫瘍微小環境が同じマウスの中で再現され, 免疫療法の評価系が構築されることが期待されている 12, 18) 医薬品開発においては, ヒトを被験者とする臨床試験を行う前に候補化合物の有効性と安全性を評価するために動物実験を行うことが必要である動物実験にあたっては, 動物の福祉愛護の観点から 3R の原則 (Reduction: 使用動物数の削減,Refinement: 実験動物の苦痛の軽減,Replacement: 代替え法の活用 ) に則って行う事が求められている 19, 20) PDX モデルは, これまでの腫瘍モデルと比べてよりヒト腫瘍に近いモデルである事から, 前臨床試験結果が臨床試験に反映されやすい点で, 動物実験の効率的な運用に貢献する事が期待される PDX 作成にあたっては, 適切なエンドポイントを設定するなど, 動物の愛護及び管理に関する法律および実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準を遵守し, 動物実験の適正な実施に向けたガイドライン等に従って, 動物実験を行わなければならないまた,3R の原則を踏まえて, より効率の良い PDX モデルの樹立が望まれる Ⅳ. まとめ近年, ヒト細胞の移植増殖分化が可能な新たな高度免疫不全マウスの開発により, 様々な腫瘍の患者腫瘍移植マウス (Patient Derived Tumor Xenograft:PDX マウス ) の作成が可能となった PDX はヒト腫瘍をか 55

6 Application of Patient-derived tumor xenograft なり忠実に再現しており, 腫瘍の病態研究個別化がん治療において有用なツールとなりつつある今後, 高度免疫不全マウスの改良や PDX ライブラリーの充実により, 個別化がん医療 (Precision cancer medicine) への応用が益々進んでいくことが期待される謝辞本総説で紹介された研究の一部は, 国立研究開発法人日本医療研究開発機構, 国立研究開発法人科学技術振興機構, 日本学術振興会, 厚生労働省, 文部科学省などの補助を受けて行われた利益相反本研究において利益相反に相当する事項はない参考文献 1. Kamb A: What's wrong with our cancer models? Nat Rev Drug Discov, 4: , Cho SY, Kang W, Han JY, et al. : An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient- Derived Xenografts. Mol Cells, 39: 77-86, Morton CL, Houghton PJ: Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc, 2: , Tentler JJ, Tan AC, Weekes CD, et al. : Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol, 9: , Kariya R, Matsuda K, Gotoh K, et al. : Establishment of Mice with Complete Loss of Lymphocytes and NK Cells and Application for In Vivo Bio-imaging. In Vivo, 28: , Gotoh K, Kariya R, Matsuda K, et al. : A novel EGFP-expressing nude mice with complete loss of lymphocytes and NK cells to study tumor-host interactions. Biosci Trends, 8: , Shultz LD, Goodwin N, Ishikawa F, et al. : Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harb Protoc, 2014: , 岡田誠治 : 高度免疫不全マウスの開発と医学生命科学研究への活用.Cytometry Research,27:1-7, Goto H, Kojima Y, Matsuda K, et al. : Efficacy of anti-cd47 antibody-mediated phagocytosis with macrophages against primary effusion lymphoma. Eur J Cancer, 50: , Shoemaker RH: The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen. Nat Rev Cancer, 6: , Ledford H: US cancer institute overhauls cell lines. Veteran cells to be replaced by human tumours grown in mice. Nature, 530: 391, Byrne AT, Alferez DG, Amant F, et al. : Interrogating open issues in cancer precision medicine with patientderived xenografts. Nat Rev Cancer, 17: , Gao H, Korn JM, Ferretti S, et al. : High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med, 21: , Morton JJ, Bird G, Refaeli Y, et al. : Humanized Mouse Xenograft Models: Narrowing the Tumor- Microenvironment Gap. Cancer Res, 76: , Shultz LD, Ishikawa F, Greiner DL: Humanized mice in translational biomedical research. Nat Rev Immunol, 7: , Goto H, Matsuda K, Srikoon P, et al. : Potent antitumor activity of zoledronic acid-induced Vgamma9Vdelta2 T cells against primary effusion lymphoma. Cancer Lett, 331: , Harada H, Suzu S, Ito T, et al. : Selective expansion and engraftment of human CD16+ NK cells in mice. Eur J Immunol, 35: , Holzapfel BM, Wagner F, Thibaudeau L, et al. : Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells, 33: , 鍵山直子 : 動物愛護管理法における 3R 原則の明文化と実験動物の適正な飼養保管. 日本獣医師会雑誌,63: , Russell WMS, Burch RL: The Principles of Humane Experimental Technique.: Okada S, Harada H, Ito T, et al. : Early development of human hematopoietic and acquired immune systems in new born NOD/Scid/Jak3null mice intrahepatic engrafted with cord blood-derived CD34 + cells. Int J Hematol, 88: , Bosma GC, Fried M, Custer RP, et al. : Evidence of functional lymphocytes in some (leaky) scid mice. J Exp Med, 167: ,

転移を認めた転移率は 13~80% であった立細胞株をヌードマウス皮下で ~1l 増殖させ, その組

転移を認めた転移率は 13~80% であった立細胞株をヌードマウス皮下で ~1l 増殖させ, その組 Title Author(s) Citation Issue date 1997-12 Resource Type Resource Version URL Kobe University Repository : Kernel ヒト口腔扁平上皮癌細胞および組織片のヌードマウス舌への同所性移植による浸潤リンパ節転移に関する実験的研究 (Experimental study of invasion