エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターおよびマイクロプレート法 M P R システムを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 2015 年 2 月改訂

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さみらさくいし
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1 エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターおよびマイクロプレート法 M P R システムを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 205 年 2 月改訂

2 目次比濁比色時間分析装置トキシノメーターを用いたエンドトキシン試験における標準操作法用意する器具および試薬測定手順比濁比色時間分析装置マイクロプレートリーダーを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 4 用意する器具および試薬測定手順日本薬局方におけるエンドトキシン試験法 6 検量線の信頼性確認試験反応干渉因子試験定量試験参考 8 エンドトキシンの添加方法 CSE の力価検定最大有効希釈倍数の求め方日本薬局方 FDA ガイドライン比較表 Es-Eapp プロット法について生物学的製剤中のエンドトキシン測定

エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法用意する器具及び試薬希釈用試験管ピペットバイオクリーンチップワコー Ⅱ 反応用試験管 ( リムルステストチューブ S) アルミキャップ ( アルミキャップ S) ミキサートキシノメーターライセート試薬コントロールスタンダードエンドトキシン (CSE) (

3 エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法用意する器具及び試薬希釈用試験管ピペットバイオクリーンチップワコー Ⅱ 反応用試験管 ( リムルステストチューブ S) アルミキャップ ( アルミキャップ S) ミキサートキシノメーターライセート試薬コントロールスタンダードエンドトキシン (CSE) ( または日本薬局方エンドトキシン標準品 USP 標準品など ) エンドトキシン試験用水使用する器具についてエンドトキシン試験用水とはガラス製の用具及び器具は少なくとも 250 で30 分間の乾熱滅菌を行ったものを使用して下さいまた吸着の恐れもありますので確認して使用して下さいプラスチック製品を用いる場合はエンドトキシンの汚染がないこと及び測定に対する干渉がないことが確認されたものを使用して下さい水 0.mL とライセート試薬 0.mL を混合トキシノメーターで測定しゲル化判定されないことを確認します通常は注射用水が使用できます (JISK8008 生化学試薬通則には 0.006EU/mL 以下と規定されています ) またガラス容器に入っている注射用水を使用する場合にはガラスアンプルからの金属の溶出による影響を受ける場合 ( エンドトキシンの失活 ) があるので確認してから使用して下さい測定手順. ライセート試薬の溶解分注 ( シングルテストを使用する場合はこの操作は必要ありません ) ❶ アルミキャップをはずす ❷ゴム栓をゆっくりと持ち上げエンドトキシン試験用水を加え注再び栓をする ❸ ふたに液がつかないようにゆっくりと振り混ぜる ❹ 反応用試験管に 0.mL ずつ分注しすみやかにアルミキャップをかぶせる注 2 注 3 注バイアル内部は真空になっているので粉末が舞い上がらないように注意して下さい注 2 分注時にはなるべく気泡ができないようにして下さい注 3 試験管の底は測光部なので手で触れないようにして下さい

4 エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 2. エンドトキシンの溶解及び希釈各希釈溶液は次の希釈操作を行う前に 30 秒以上撹拌して下さい ❶000EU/mL となるようエンド注トキシン試験用水を加える注 2 注 3 ❷ミキサーで約 2 分間激しく撹拌 ❸ 段階 0 倍を超えない範囲で順次希釈を行う注日本薬局方エンドトキシン標準品 (JP-RSE) は0000EU/mL となるようにエンドトキシン試験用水を加えて下さい注 2 保存していたものを使用する時は分間以上撹拌して下さい注 3 日本薬局方エンドトキシン標準品の場合は 5 分間参考日本薬局方エンドトキシン標準品は 0000 ~ 20000EU/ バイアルになるように調整されています USP 標準品は0000EU/ バイアルですエンドトキシン希釈例 ( 使用するライセート試薬の感度が 0.033EU/mL の場合 ) 0.2mL 0.2mL 0.2mL ml ml ml ml ml ml CSE 000EU/mL 水エンドトキシン濃度 (EU/mL).8mL 検量線として使用水はあらかじめ分注しておくと操作が簡単です試薬の保存についてライセート試薬の保存溶解したライセート試薬は氷冷下または冷蔵庫内で保存しできるだけその日のうちに ( カラー KY テストは6 時間以内 ) 使用して下さい後日使用する場合は各ライセート試薬毎に設定されている保存温度にて凍結保存を行い2 週間以内に使用して下さいまた凍結する場合はバイアルのまま凍結させ使用時に融解し反応用試験管に分注してご使用下さい凍結融解は回にとどめて下さいエンドトキシンの保存 CSE は溶解後 2 ~ 0 で保存しヶ月以内に使用して下さい JR-RSE USP-RSEは溶解後は冷蔵保存 (2 ~ 8 ) で 2 週間以内に使用して下さい ES-II シリーズ :-0 ~-30 ES-F シリーズ :-0 ~-20 カラー KY シリーズ :-80 以下 J/F シリーズ :-20 ~-30 2 実際の保存条件はそれぞれの現品説明書に従って行って下さい

5 3. 試料溶液の調製試料溶液と試料溶液のエンドトキシンを添加した陽性製品コントロールを調製する希釈を行う場合は次の希釈動作の前に 30 秒以上ボルテックスミキサーで撹拌して下さいまた段階の希釈で 0 倍を超える希釈はしないで下さい 4. 測定 ( 測定する 20 分以上前にスイッチを入れておいて下さい ) 試料溶液又はエンドトキシン溶液ライセート試薬 ❶ 試料溶液又はエンドトキシン溶液を 0.mL( シングルテストは 0.2mL) 注加える ❷ 数秒間撹拌する ( 泡がないことを確認 ) 注 2 ❸トキシノメーターにセットする注ライセート試薬に加える前の試料溶液またはエンドトキシン溶液を 20 秒以上撹拌して下さい注 2 振動が測光に影響するので測定中の試験管には触れないようにして下さいまたミキサーは振動を避けるためトキシノメーターと同じ台に置かないようにして下さい 5. 判定陰性コントロール (NC) が測定時間内にゲル化判定されないこと検量線の相関係数 r の絶対値は以上であること注 ( エンドトキシン溶液の濃度の対数値とゲル化時間の対数値の直線回帰式を最少自乗法によって求め検量線とします ) 以上の条件を満たしたとき試験は有効となります求めた検量線から試料溶液の Tg をエンドトキシン濃度に換算します注検量線の濃度範囲を広くとると検量線が曲がる場合がありますその場合にはゲル化時間を 2 回対数をとると検量線が直線になり検量線の範囲からはずれたゲル化時間の濃度換算の誤差が少なくなります 3

6 エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置マイクロプレートリーダーを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法用意する器具及び試薬希釈用試験管ピペットバイオクリーンチップワコー Ⅱ 連続分注器 ( 推奨品 :eppendorf 社マルチピペットプラス 498) チップ ( 推奨品 :eppendorf 社コンビチッププラスバイオピュア 2.5mL) 96 穴マイクロプレート ( 推奨品 : バイオクリーンプレートワコー ) 恒温機能付きマイクロプレートリーダーとデータ処理ソフトウェア (405nm と650nm の2 波長カイネティック測定可能な機種 ) ライセート試薬コントロールスタンダードエンドトキシン (CSE) ( または日本薬局方エンドトキシン標準品 USP 標準品 ) エンドトキシン試験用水 ES-F/plate 使用時は 405nm 波長カイネティック測定が可能な機種測定手順 ( リムルスカラー KYテストワコー使用時 ). マイクロプレートリーダーの準備 ( 下記測定条件を設定 ) カイネティック法 (Onset time 法 ) 測定温度 :37 測定波長 :405nm( 主波長 )-650nm( 副波長 ) * Onset OD:0.05 測光間隔 :40 秒測定時間 :20 分 ( 測定したい濃度範囲によって短縮する事も可能 ) *2 攪拌条件 : 測定開始時に 5 秒間自動撹拌 * ES-F/Plate 使用時は405nm( 主波長 ) のみ *2 ES-F/Plate 使用時は60 分 2. エンドトキシンの溶解及び希釈各希釈溶液は次の希釈操作を行う前に 30 秒以上撹拌して下さい ❶ 000EU/mL となるようにエンド注トキシン試験用水を加える注 2 注 3 ❷ミキサーで約 2 分間激しく撹拌 ❸ 段階 0 倍を超えない範囲で順次希釈を行う注日本薬局方エンドトキシン標準品 (JP-RSE)0000EU/mL となるようにエンドトキシン試験用水を加えて下さい注 2 保存していたものを使用する時は分間以上撹拌して下さい注 3 日本薬局方エンドトキシン標準品の場合は5 分間 4

7 CSE 希釈方法 0.mL 0.mL 0.mL 0.5mL 0.mL 0.mL 0.mL CSE 000EU/mL エンドトキシン試験用水 (ml) エンドトキシン濃度 (EU/mL) 試薬の保存についてライセート試薬の保存溶解したライセート試薬は氷冷下または冷蔵庫内で保存しできるだけその日のうち ( カラー KYテストは 6 時間以内 ) に使用して下さい各ライセート試薬毎に設定されている保存温度にて凍結保存を行い 2 週間以内に使用して下さいまた凍結融解は付属のバイアル瓶にて回にとどめて下さいカラー KY テストワコー :-80 以下 ES-F/Plate:-0-20 実際の保存条件はそれぞれの現品説明書に従って行って下さい 3. 試料溶液の調製試料溶液と試料溶液にエンドトキシンを添加した陽性製品コントロールを調製する希釈を行う場合は次の希釈動作の前に 30 秒以上ミキサーで撹拌して下さいまた段階の希釈で 0 倍を超える希釈はしないで付属のバイアル瓶にて下さい 4. ライセート試薬の溶解分注ライセート試薬にエンドトキシン試験用水を加えゆるやかに振り混ぜて溶解し氷冷する注 ❶アルミキャップをはずす ❷ゴム栓をゆっくりと持ち上げエンドトキシン試験用水を加え注 2 再び栓をする ❸ふたに液がつかないように注ゆっくりと振り混ぜる 5. 測定 ( 測定する 20 分以上前に加温スイッチを入れておいて下さい ) 50μL 50μL NC ❶ エンドトキシン溶液又は試料溶液 ❷ ライセート試薬をすばやく加える 96 ウェルプレート ❸ プレートの蓋をはずしてリーダーにセットして測光を開始する注分注時にはなるべく気泡ができないようにして下さい注 2 バイアル内部は真空になっているので粉末が舞い上がらないように注意して下さい 6. 判定測定時間内に陰性コントロール (NC) の測定値 (Onset time) が得られないこと log( エンドトキシン濃度 )-log(onset time) モードで作成した検量線の相関係数 rの絶対値は以上であること以上の条件を満たしたとき試験は有効となります求めた検量線から試料溶液の Onset time をエンドトキシン濃度に換算します 5

8 エンドトキシン試験法日本薬局方におけるエンドトキシン試験法予備試験検量線の信頼性確認試験用いるライセート試薬に規定されているエンドトキシンの濃度範囲で少なくとも 3 種の濃度のエンドトキシン標準溶液を 3 回以上測定します検量線を作成して相関係数 r を求めその絶対値は0.980 以上でなければなりません Time(log) (λ ) 0.05(λ 2) 0.5(λ 3) 5 濃度追加 50(λ 4) EU/mL(log) エンドトキシンの濃度範囲が一桁広がるごとに濃度追加しなくてはなりません反応干渉因子試験 ( 阻害促進試験 ) (0 倍を超える濃度間隔をとらないこと ) 薬剤中のエンドトキシンを測定する場合は既知の濃度のエンドトキシンを添加しその回収率を調べ薬剤がエンドトキシン試験に及ぼす影響についてあらかじめ調べる必要があります ( 同一成分及び同一分量の医薬品の場合試料ごとに行う必要はありません ) まず検量線の最少濃度 λ と最大濃度 λ n(n 3) の中央値のエンドトキシン濃度 m を求め m 又は m 付近の濃度を添加します m 値の求め方例 )λ = λ 2 = λ 3 = 0.25 の場合等倍希釈で奇数点の場合は真ん中の値が m 値となります m = 例 2 )λ = λ 2 = λ 3 = 0.25 λ 4 = 0.25 の場合 log m =(log λ + log λ 4 )/2 =( ( ))/2 =-.053 m = 反応干渉因子試験を行う試料溶液濃度は最大有効希釈倍数を超えない範囲まで希釈できます ( 参考の最大有効希釈倍数の求め方を参照して下さい ) A 液試料溶液又は最大有効希釈倍数を超えない範囲で希釈した試料溶液注 B 液 A 液にエンドトキシン濃度が検量線の中点付近となるようにエンドトキシンを添加した試料溶液 A B 液を各 n = 2 以上で測定算出方法 B 液の平均エンドトキシン量 - A 液の平均エンドトキシン量 = エンドトキシンの平均回収量判定添加回収率が 50% 以上 200% 以下であれば反応干渉因子が存在しない 6

9 A 液が反応促進作用又は反応阻害作用を示す場合試料溶液の希釈 ( 最大有効希釈まで希釈していない場合又は検量線の濃度を変更した場合 ) 反応干渉因子の除去限外濾過法エンドトキシン特異的吸着剤リムルス PSシングルテストを用いたパイロセップ法酸アルカリ界面活性剤緩衝液などによる反応干渉因子の中和法透析法など ph の調整 A 液の ph が反応至適 ph7.0 ~ 7.5( 薬局方では ph6.0 ~ 8.0) の範囲から外れている場合は以下の試薬を用いて注 2 ph を調整する必要があります ( ライセート試薬との混合液が範囲以内になれば試料溶液の ph 調整の必要はありません ) 注エンドトキシンの添加方法については参考を参照して下さいエンドトキシン特異的でないライセート試薬は ( 3)-β-D- グルカンとも反応するので試料溶液中に ( 3)-β-D- グルカンの存在が否定できない場合にはエンドトキシン特異的ライセート試薬を使用下さい注 2 ph 調整用に用いる試薬例エンドトキシン試験用 0.mol/L 水酸化ナトリウム試液エンドトキシン試験用 0.mol/L 塩酸試液定量試験 A 液反応干渉因子試験に適合するもので最大有効希釈倍数を超えない範囲で希釈した試料溶液 B 液 A 液と同一濃度の試料溶液にエンドトキシンを終濃度が検量線の中点付近となるように添加した液 C 液検量線の信頼性確認で使用される少なくとも 3 濃度以上のエンドトキシン標準溶液 D 液エンドトキシン試験用水 (NC) A,B,C,D 液をn = 2 以上で測定します算出方法 C 液により作成した検量線を用いて A 液及び B 液のエンドトキシン濃度を算出します判定 C 液より作成した検量線の相関係数 r の絶対値が以上であること B 液 - A 液のエンドトキシンの回収率が 50 ~ 200% の範囲であること NC である D 液がゲル化判定されない以上の条件を満たし A 液のエンドトキシン濃度に基づき被験試料のエンドトキシン濃度を求めその値が医薬品各条に規定された規格を満たすとき適合と判断されます 7

10 参考エンドトキシンの添加方法についてサンプルを希釈して反応干渉因子試験を行う場合は下記方法 ❶ のような : の添加を行いサンプル濃度を変えずに添加したい場合 ( 原液などに添加する場合 ) は方法 ❷ のような添加法で行うと便利です方法 ❶ 等量添加 ml ml 方法 ❷ 00 倍添加 ( 原液などに添加する場合 ) 20 μl 980 μl 0.25EU/mL 4% サンプル 6.25EU/mL サンプル原液 2% サンプル EU/mL 原液 EU/mL CSE の力価検定方法 ( トキシノメーター法 ) 日本薬局方では特に記載されていませんが FDA のガイドラインでは標準品以外でのエンドトキシン (CSE) を使用する場合には CSE の力価を標準品と対比して求めなければならないという記載がありました尚 USP24 局から CSE の記載はなくなっていますこの CSE の力価は CSE の製造ロット使用するライセート試薬によっても異なりますのでこれらの変更に伴い再検定する必要があります CSE 力価検定エンドトキシン標準品 (RSE) の希釈系列 (EU/mL) コントロールスタンダードエンドトキシン (CSE) の希釈系列 (ng/ml) を4 バイアル各 n 2 で測定判定 CSE の3 濃度以上が RSE の最大濃度と最少濃度のゲル化時間の範囲内であること RSE の検量線の相関係数 r の絶対値が以上であること RSE の検量線をもとに CSE の重量あたりのエンドトキシン活性を求める注 )USP23 局から力価検定に用いる CSE のバイアル数が 4 バイアルからバイアルに変更になりました ( ゲル化法のみ ) 8

11 エンドトキシン標準品 CSE 希釈例 ( 使用する LAL のゲル化感度が 0.033EU/mL の場合 ) 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL ml ml ml ml ml ml RSE 0000EU/mL 水エンドトキシン濃度 (EU/mL).8mL mL 0.2mL 0.2mL ml ml ml ml ml ml CSE 00ng/mL 水エンドトキシン濃度 (ng/ml) 日局標準品の場合 USP-RSE は 2000EU/mL CSE の平均換算係数の求め方 RSE の濃度とゲル化時間 RSE(EU/mL) Tg(min.) Log Tg RSE の検量線 CSE の Tg log Tg = log C +.43 r = EU 換算値 Log Conc CSE の濃度とゲル化時間平均 Tg(min.) 4vial の平均 Tg EU 換算値 EU 換算係数 CSE(ng/mL) vial vial2 vial3 vial4 (min.) EU/mL EU/ng > 60.0 > 60.0 > 60.0 > 60.0 > 平均換算係数 0.07EU/ng ゲル化法による力価検定方法はリムルス HS-J シングルテストワコーまたは J シングルテストワコーの現品取扱説明書をご参照下さい 9

12 参考最大有効希釈倍数の求め方 ( 日本薬局方の参考情報を参照して下さい ) 最大有効希釈倍数 (Maximum Valid Dilution, MVD) とは反応促進又は反応阻害などの作用により試料溶液での試験ができない場合許容範囲内で希釈した希釈試料溶液を調製することによってエンドトキシン規格値の測定ができる最大希釈倍数のことをいいます ) 医薬品各条でエンドトキシン規格値が規定されている場合最大有効希釈倍数 = (MVD) エンドトキシン規格値濃度試料溶液濃度 λ 試料溶液濃度 : エンドトキシン規格値濃度が重量あたり (EU/mg) で規定されている場合は mg/ml エンドトキシン規格値濃度が単位あたり (EU/unit) で規定されている場合は Unit/mL エンドトキシン規格値濃度が容量あたり (EU/mL) で規定されている場合は.0mL/mL λ: ゲル化法の場合のライセート試薬の表示感度 (EU/mL) 比濁法または比色法の場合の検量線の最小エンドトキシン濃度 (EU/mL) 2) 医薬品各条にエンドトキシン規格値が規定されていない場合 ❶ まず最小有効濃度 (Minimum Valid Concentration, MVC) を求める MVC= λ M K λ: ゲル化法の場合はライセート試薬の表示感度 ( E U / m L ) 比濁法または比色法の場合は検量線の最小エンドトキシン濃度 (EU/mL) K: 静脈内投与で 5.0EU/kg, 脊髄腔内投与で 0.2EU/kg, 静脈内投与の放射性医薬品で 2.5EU/kg, その他の投与経路で 5.0EU/kg M: 体重 kg 当たり時間以内に投与する最大量注 )kg 当たりの最大ヒト投与量を算出するとき平均ヒト体重として USP では 70kg 日局では 60kg を用いる注 2) 小児投与量が設定されている場合その量が成人投与量より多いときは小児投与量に基づく ❷ MVD を求める MVD = 試料溶液濃度 MVC エンドトキシン規格値 = K M 0

13 最大有効希釈倍数算出例 ) エンドトキシン規格値が規定されている場合 a エンドトキシン規格値が容量で表示されている場合試薬感度 (λ):0.033eu/ml エンドトキシン規格値 :0.5EU/mL b エンドトキシン規格値が重量で表示されている場合製剤力価 :20mg/mL( 試料溶液濃度 ) 試薬感度 :0.033EU/mL エンドトキシン規格値 :0.7EU/mg 0.5EU/mL ml/ml MVD = = EU/mL 0.7EU/mg 20mg/mL MVD = = EU/mL 2) エンドトキシン規格値が規定されていない場合 a 重量 /kg で投与する医薬品製剤力価 :20mg/mL 最大投与量 /kg:30mg/kg 試薬感度 :0.033EU/mL b 容量 /kg で投与する医薬品最大投与量 /kg:0.00ml/kg 試薬感度 :0.033EU/mL MVC= 0.033EU/mL 30mg/kg 5.0EU/kg MVC= 0.033EU/mL 0.00mL/kg 5.0EU/kg = 0.878mg/mL = mL/mL 製剤力価 ( 試料溶液濃度 ) MVD = MVC MVD = ml/ml mL/mL = 20mg/mL 0.878mg/mL = 6 = 06

14 参考三極薬局方比較表三極薬局方におけるエンドトキシン試験法光学的定量法日本薬局方エンドトキシン濃度繰り返し数判定検量線の信頼性確認検量線 3 濃度以上 3 相関係数 r 反応干渉因子試験試料溶液又は希釈試料溶液無添加 2 中点付近 2 添加回収率 50 ~ 200% エンドトキシン試験用水 ( N C ) (D 液 ) 2 ゲル化判定されない定量試験検量線 3 濃度以上 (C 液 ) 2 相関係数 r 無添加 ( A 液 ) 2 エンドトキシン規格を満たす試料溶液又は希釈試料溶液中点付近 ( B 液 ) 2 添加回収率 50 ~ 200% FDA ガイドライン (July 5, 99 Interium Guidance を含む ) 20 年に廃止されました ( 参考情報として掲載します ) FDA エンドトキシン濃度条件等繰り返し数判定実験室の資格検定標準曲線 3 濃度以上 3 相関係数 r 力価検定 RSE による標準曲線 6 濃度以上.0 ~ 0.03EU/mL 2 CSE 4 バイアル 2 少なくとも 3 濃度に関するゲル化時間が RSE の範囲内であること標準曲線 3 濃度以上最低濃度をλとする 2 相関係数 r 製品または製品希釈液による標準曲線 3 濃度以上最低濃度を λ とする 2 相関係数 r < 傾き<- 0. 阻害促進試験製品または製品希釈液無添加 4λ 0. ~ 0.5EU/mL λ< 0.0EU/mL 以下の場合は注意カットオフ値が.0EU/mL 以下.0 ~ 5.0EU/mL カットオフ値が上記以外 2 内在エンドトキシンなし 75 ~ 25% 内在エンドトキシンあり 50 ~ 50% 標準曲線 3 濃度以上最低濃度を λ とする 2 相関係数 r Archived standard curve mid-point 2 回収率 75 ~ 25% 日常試験製品または製品希釈液無添加 4λ 0. ~ 0.5EU/mL λ< 0.0EU/mL 以下の場合は注意カットオフ値が.0EU/mL 以下.0 ~ 5.0EU/mL カットオフ値が上記以外 2 内在エンドトキシンなし 75 ~ 25% 内在エンドトキシンあり 50 ~ 50% archived standard curve: 最低 3 日間続けて作成した検量線を回帰分析し相関係数 r の絶対値が以上であること (3 濃度,n = 2) 2

15 参考 Es-Eapp プロット法についてエンドトキシンの混入がない試料の入手が困難な場合最大有効希釈倍数まで試料を希釈しても反応阻害又は促進などの作用がある場合 Es - Eapp プロット法を使用すればエンドトキシンの混入量とエンドトキシン試験に対する影響が同時に測定できます試料がエンドトキシンの濃度によらず一定の割合 R というエンドトキシン活性出現率になるようにエンドトキシン試験に影響を与えていると仮定すると次式が成り立ちます Eapp = R(Ec + Es) = R Ec + R Es ❶ Eapp: 検量線をもとに求めた見かけのエンドトキシンの量 Ec: もともと試料に混入しているエンドトキシンの量 Es: 添加したエンドトキシン量実際に Es の値を求めたときの Eapp との関係を最小自乗法で求めると以下の回帰式が得られます Eapp = a + b Es ❷ ❶ 式と ❷ 式より a = R Ec b = R ❸ ここで R > のとき促進 R = のとき影響なし R < のとき阻害局方などを参考にして 50 ~200% を影響なしとするのであれば R>2.00 のとき促進 R<0.75 のとき阻害と判断できます仮定が成り立つかどうかは式で表される回帰式への実際のデ -タの適合性を検定することによって判断できます測定方法検量線及びサンプルに検量線と同濃度のエンドトキシンを添加した溶液を調製する Standard:0.25,0.0625,0.033,0.056EU/mL S a m p l e( エンドトキシン無添加 ) Sample( エンドトキシン添加 ):0.25,0.0625,0.033,0.056EU/mL 各サンプル n = 2 横軸を実際に添加したエンドトキシン量 ( E s ) 縦軸を測定より算出されたエンドトキシン回収量 ( E a p p ) としてプロットしますこのとき実際に添加した量より算出されたエンドトキシン量が多い ( 促進傾向 ) 場合直線の傾き (R) がより大きくなり添加量より算出量が少ない ( 阻害傾向 ) 場合直線の傾きがより小さくなります 3

16 Detected endotoxin(eu/ml) Detected endotoxin(eu/ml) Spiked endotoxin(eu/ml) Spiked endotoxin(eu/ml) クエン酸ナトリウム 0.25% (ph 調整済み ) 生理食塩水 Eapp = 0.90 Es エンドトキシン混入量 = / 0.9 = EU/mL Eapp = 0.95 Es エンドトキシン混入量 = / グラフの y 切片がサンプルのエンドトキシン混入量となりますがその値はサンプルの阻害又は促進の影響を受けているため ( ❸ 式参照 ) 活性出現率 ( 直線の傾き ) で割ると実際のエンドトキシン混入量が算出されます 4

17 参考生物学的製剤中のエンドトキシン測定平成 5 年 0 月日付けの生物学的製剤基準の改正で一般試験法に新たにエンドトキシン試験法が追加されましたエンドトキシン試験法では比濁時間分析法を用いた場合製剤の内在エンドトキシン量の算出に平行線定量法を用いることが規定されています ( 現在エンドトキシン試験法が規定されているのは人血清アルブミン加熱人血漿タンパクインターフェロン製剤の一部 ) 平行線定量法とは一般的にはあるサンプルの内在エンドトキシンを定量するには検量線法が用いられていますこの方法では標準品のエンドトキシンの各農度に対するゲル化時間をプロットし用量反応直線 ( 検量線 ) を作成しこれに希釈サンプルによるゲル化時間を当てはめ希釈サンプルのエンドトキシン量を求めますそして求められた希釈サンプル中のエンドトキシン量に希釈倍率を乗じてサンプルの内在エンドトキシン定量値としていますこの方法にはエンドトキシン濃度の変化にともなうゲル化時間の変化はサンプルでも標準品でも同じ割合でありサンプルをどんな希釈倍率 ( ただしエンドトキシンの検出限界内 ) で定量しても求められるサンプル中のエンドトキシン定量値は同じになるという仮定が含まれています. これはすなわち標準希釈系列の用量反応直線とサンプル中のエンドトキシン濃度による用量反応直線は平行であるということを暗黙的に認めていることに相当しますしかし生物学的製剤等では反応系によっては前述の仮定が正しくないこともあります 2 つの用量反応直線が平行でない場合測定に用いたサンプルの希釈率によって製剤の内在エンドトキシン量の計算値が大きく異なってしまうことになります平行線定量法は標準品とサンプルのそれぞれの希釈系列による用量反応直線を作成し統計的手法を用いて標準品とサンプルの用量反応直線の平行性を検定することによって両用量反応直線が互いに平行である場合にサンプル中の被検物質 ( エンドトキシン ) 量を標準品に対する相対力価として定量する方法です S2 4 倍差 S S2 S 4 倍差 Log Log Tg 標準品 ( 検量線 ) サンプル Log Log Tg 標準品 ( 検量線 ) サンプル 4 倍差 Log( 相対濃度 ) 2 倍差 Log( 相対濃度 ) 2 つの用量反応直線が平行である場合図で S がサンプル原液,S2 がサンプルの 4 倍希釈液であるとする. この場合 S のエンドトキシン定量値 ( 検量線からの計算値 ) が.OEU/mL ならば S2 の定量値は S の 4 分のの 0.25EU/mL になり S2 を用いて求められるサンプル原液中のエンドトキシン濃度は 0.25EU/mL に希釈倍率 4 を乗じた.OEU/mL であり S から求めた値と - 致する 2 つの用量反応直線が平行でない場合図で S がサンプル原液,S2 がサンプルの 4 倍希釈液であるとするこの場合 S のエンドトキシン定量値 ( 検量線からの計算値 ) が.OEU/mL ならば S2 の定量値は S の 4 分のの 0.25EU/mL になるはずだがこの図の場合 0.5EU/mLとなってしまうよって S2 を用いて求められるサンプル原液中のエンドトキシン濃度は 0.5EU/mL に希釈倍率 4 を乗じた 2.OEU/mL となり S から求めた値とずれてしまう 5

18 価格表コードNo. 品名感度 (EU/mL) 容量希望納入価格 ( 円 ) ライセート試薬カブトガニ血球抽出物 J 回用 8, カブトガニ血球抽出物 HS-J 回用 9, カブトガニ血球抽出物 F 回用 8, カブトガニ血球抽出物 HS-F 回用 9, カブトガニ血球抽出物 ES-II 回用 55, カブトガニ血球抽出物 ES-Ⅲ 00 回用 55, PYROSTAR ES-F without CSE 回用 56, PYROSTAR ES-F/Plate without CSE 200 回用 64,000 マルチテストキット ( ライセート試薬 +CSE) リムルス Jテストワコー回用 23, リムルス HS-Jテストワコー回用 24, リムルス HS-Fテストワコー回用 24, リムルス ES-IIテストワコー回用 35, PYROSTAR ES-F CSE 回用 48, PYROSTAR ES-F/Plate CSE 60 回用 56, リムルスカラー KYテストワコー 60 回用 54,000 シングルテストキット ( 試験管入ライセート試薬 +CSE ただし PSにはCSE 添付無 ) リムルス Jシングルテストワコー回用 26, リムルス HS-Jシングルテストワコー回用 30, リムルス Fシングルテストワコー回用 26, リムルス HS-Fシングルテストワコー回用 30, リムルス HS-Tシングルテストワコー 25 回用 30, リムルス ES-IIシングルテストワコー回用 33, PYROSTAR ES-Fシングル回用 39, リムルスカラー KYシングルテストワコー 25 回用 50, リムルス PSシングルテストワコー 20 回用 98,000 標準品日本薬局方エンドトキシン標準品照会 USP 標準エンドトキシン 0,000units 照会 CSE E.coli UKT-B 株製 500ng 6,000 エンドトキシンフリー緩衝液 Mトリス塩酸緩衝液 ( ライセート試薬溶解用 ) ph7.3 at 30 5mL 0 2,500 エンドトキシン検出用抽出液エンドトキシン検出用抽出液 20 倍濃縮液 0mL 4 5,000 エンドトキシン試験用試験管リムルステストチューブ-Sアルミキャップ付 φ2 75mm 0 本 8 6, リムルステストチューブ-S φ2 75m 0 本 0 2, アルミキャップ-S φ4.7 8mm 0 個 0,200 エンドトキシン試験用プレートバイオクリーンプレートワコー 96ウェル 50 枚 30,000 エンドトキシンフリーチップバイオクリーンチップワコーエクステンドSⅡ 200 μl 用 00 本 6, バイオクリーンチップワコー 200Ⅱ 200 μl 用 00 本 3, バイオクリーンチップワコー 000Ⅱ 000 μl 用 00 本 3,200 6

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20 本社大阪市中央区道修町三丁目番 2 号 TEL: ( 機器システム部 ) 東京支店東京都中央区日本橋本町二丁目 4 番号 TEL: ( 機器システム部 ) 九州営業所 TEL: ( 代 ) 中国営業所 TEL: ( 代 ) 東海営業所 TEL: ( 代 ) 藤沢営業所 TEL: ( 代 ) 筑波営業所 TEL: ( 代 ) 東北営業所 TEL: ( 代 ) 北海道営業所 TEL: ( 代 ) URL: お問い合わせ先 : 機器お見積り : 機 0

pdf エンドトキシン試験法

pdf エンドトキシン試験法 00-0909.pdf.0 エンドトキシン試験法 3 5 6 7 9 0 3 5 6 7 9 0 3 5 6 7 9 30 3 3 33 3 35 36 37 3 39 0 3 5 6 次のように改める. 本試験法は, 三薬局方での調和合意に基づき規定した試験法である. エンドトキシン試験法は, カブトガニ (Limulus polyphemus 又は Tachypleus tridentatus)

エンドトキシン試験法 比濁 比色時間分析装置 トキシノメーター およびマイクロプレート法 M P R システム を用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 2015 年 2 月改訂

エンドトキシン試験法比濁比色時間分析装置トキシノメーターおよびマイクロプレート法 M P R システムを用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 2015 年 2 月改訂