3. エンドトキシンの測定法と応用高橋淳吉和光純薬工業株式会社バイオメディカルシステム部はじめにエンドトキシンは近年, カブトガニの血球抽出物であるライセート試薬を使用した高感度な測定法が広く利用されるようになったここでは測定法の原理とその応用例について紹介する 1. エンドトキシンとラ

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ありあけいれい
4 years ago
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1 3. エンドトキシンの測定法と応用高橋淳吉和光純薬工業株式会社バイオメディカルシステム部はじめにエンドトキシンは近年, カブトガニの血球抽出物であるライセート試薬を使用した高感度な測定法が広く利用されるようになったここでは測定法の原理とその応用例について紹介する 1. エンドトキシンとライセート試薬の反応機構 ( カスケード ) ライセートとエンドトキシンの反応機構 ( カスケード ) は図 1 に示したとおりで,FactorC がエンドトキシンにより活性化し活性化 FactorC に, FactorB が活性化 FactorB に順次連鎖的に活性化し最終的に Coagulogen が Coagulin に加水分解されてゲル化が起こるこのゲル化は濁度増加をともなうために比濁法が可能になるまた, 合成基質 (Peptide-pNA) を共存させ pna(p-ニトロアニリン ) が遊離して黄色に着色することで発色合成基質法が可能になる 2. エンドトキシン特異的試薬の調製法図 1 で示したエンドトキシンとリムルスの反応機構 ( カスケード ) で b-グルカンと反応するファクター G が存在するためにリムルス試薬はエンドトキシンに特異的ではないそのためいくつかのエンドトキシンに特異的なリムルス試薬の作成方法がある 2-1. 大過剰の b-1,3-グルカンの添加 ( 和光純薬の ES テストシリーズ, 図 2) ライセートに 1 mg/ml の CM-カードランを共存させることにより, 試料中の b-グルカンとの反応を完全に阻止してエンドトキシンに特異的な測定試薬になっている 1) 図 1 ライセートとエンドトキシンの反応機構 113

2 図 2 エンドトキシンに特異的な LAL(ES) の原理 CM-カードランと LAL の反比性トキシノメーター ET-201 の測定時間を 99 分に設定し,LAL-HS を用いて測定した :99 分以内にゲル化判定されなかったもの : ゲル化判定されたもの土谷正和ら. 大過剰のカルボキシメチル化カードランによる G 因子系阻害作用を利用したエンドトキシン特異的リムルステストの開発とその応用 : 日本細菌学雑誌 45, , トキシノメーター法によるエンドトキシンの測定 ( 比濁法, 比色法 ) トキシノメーター 2 4) は 1985 年に ET-201( 第一世代 ) が発売されて以来, 第二世代の ET-301, ET-2000, 第三世代の ET-5000 と改良を経てエンドトキシン定量手法として用いられている第二世代から光源は 430nm の高輝度 LED を採用しているので比濁時間法, 比色時間法, ゲル化法の局法全ての試験法をサポートしているまた, 局法以外のエンドトキシン一般測定,b-グルカン測定, ペプチドグリカン測定 (SLP 試薬 ) が可能であるトキシノメーターは光源が 430 nm の高輝度 LED をはじめとして, 図 3 のような光学系がポジションの数だけセットされており ( トキシノメーター ET-5000 の場合は 32 ポジション ),0.2 分 (12 秒 ) ごとに透過光量比を計測し測定を開始してから設定した閾値 (94.9%) に達するまでの時間 (Tg) でエンドトキシン濃度が決まるつまり, エンドトキシン量が高いと Tg が短く, 少ないと Tg が長い負の相関が得られる (Y 軸,X 軸共に対数によるプロット, 図 4.5. タイムコースデータと検量線参照 ) 4. 検量線の種類検量線の作成はさまざまな形式が考えられるが, ゲル化法を意識する場合は 2 倍希釈系列 5 濃図 3 測定系模式図 114

3 技術資料編図 4 比濁時間分析法の検量線と反応タイムコース図 5 比色時間分析法 ( 合成基質法 ) の検量線と反応タイムコース度もしくは 4 倍希釈系列 4 濃度が用いられるまた, より広い検量関係を望むならば 10 倍希釈系列で 3 濃度,4 濃度,5 濃度と測定する試料のエンドトキシン濃度や濃度範囲によって選択すればよい ( 表 1) 5. 測定法の応用例エンドトキシンの測定条件の決定は, 測定する試料に既知量 ( 検量線の中点付近 ) のエンドトキシンを添加して反応させ, 得られた測定値を添加した値で割った割合 ( 回収率 ) で判断する薬局 115

4 表 1 検量線の種類図 6 促進, 阻害の典型的な例注射用薬剤がエンドトキシン試験の回収率に与える影響通常のサンプルは希釈により 100% に近くなる方では回収率は % の範囲が許容されている 5-1. 希釈による方法通常は水希釈により回収率が限りなく 100% に近づくので測定可能だが感度は低下する希釈で測定できれば通常は他の方法の検討の必要はない今までに経験した数多くの試料のうち 90% 以上はこの水希釈法で測定できている水希釈により限りなく 100% に近くなる典型的な例を示す ( 図 6) 5-2. 水に難溶な試料の測定方法 ( アルカリ溶解法 ) 試料が水に難溶, 不溶の場合アルカリ溶解法が可能である L-Tyrosine,Ketoprofen,N-Acetyl-L-Triptophan 等は化学構造に-COOH を有しており等容量の NaOH(0.2 M) で溶解すると 0.5% と高い濃度で測定が可能になる ( 但し, 過剰のNaOH はエンドトキシンの活性に変化を与えるので注意を要する ) 116

5 技術資料編表 2 血漿の前処理法と測定条件 5-3. 水に不溶な試料の測定法 1( 抽出法 ) 医療用具や水, 溶媒に溶けないものは抽出法で測定するただし, 粒子が多孔性なものは単純に水では抽出されないよってエンドトキシン検出用抽出液 (0.1% HSA 含有 ) に浸漬しながら超音波処理 ( 超音波洗浄器でよいが, 氷で冷却しながら行う ) を 30 分程度施行することにより抽出することができ, サンプルのエンドトキシン量を精度良く測定できる ( 例 : リン酸カルシウム, ハイドロキシアパタイト, 酸化チタン等 ) 5-4. 水に不溶な試料の測定法 2( リムルス PS シングルテストの応用 ) エンドトキシンを特異的に吸着するパイロセップゲル (PS) 5,6) のキャピラリカラムを利用した測定法がある水に不溶でもエタノールや有機溶媒に溶解する物質のエンドトキシン測定はリムルス PS シングルテストの応用により測定が可能となる ( 原理, 測定法の詳細は省略 ) < 応用例 > エタノール, アセトン, シリコンオイル (1% エタノール溶液 ), 大豆油 (1% エタノール溶液 ), 脂溶性ビタミン (1% エタノール溶液 ), プロスタグランディン E1(1% エタノール溶液 ), 卵黄レシチン (1% エタノール溶液 ), 生分解性プラスチックス (1 mg /ml クロロホルム, アセトン ), オイルアジュバント含有のワクチン ( エタノール溶液 ) 5-5. 動物の血液のエンドトキシン測定法動物の血液中 ( 血漿 ) のエンドトキシン測定は表 2の条件でサンプルを前処理 ( 希釈加熱処理 ) することで測定可能である ( トキシノメーター, リムルス ES Ⅱシングルテストを使用 ) *: 検証のためにエンドトキシン添加回収実験を行う場合の注意点としては, 血漿希釈液と添加するエンドトキシン溶液は十分冷却して ( 氷冷下 ) 混合することが重要である 5-6. 牛乳のエンドトキシン測定法健常な牛の乳汁は基本的にはエンドトキシン値はゼロと考えられる搾乳後の保存, 乳業メーカーでの製造過程での滅菌処理により生乳中の細菌がばらばらになりエンドトキシンが放出されるエンドトキシンレベルはさまざまであるものの水道水のエンドトキシンレベル (1 10EU/ml) をはるかに超える数値が認められるものも多いもちろん, 飲むものであるから健常人に対して, ただちに健康に被害を与えるものではないが, 生乳中に細菌が存在した証としての衛生状態が反映されるエンドトキシンを指標として管理する方法が現在検討されている乳汁, 市販牛乳はエンドトキシンフリーの水で 100 倍希釈することにより測定することが可能になる ( トキシノメーター, リムルス ES Ⅱシングルテスト使用 ) 市販牛乳 74 検体を測定したデータを図 7 に示す (2001 年の日本防菌防黴学会で発表 ) 5-7. 培地のエンドトキシン測定法細胞培養用の培地は, エンドトキシンが細胞毒性を発揮することから, 近年は高度な管理が求められてきている細胞培養用の代表的な培地 (D- MEM 培地 ) についての添加回収データを図 8 に示す ( リムルス ES Ⅱシングルテストを使用したトキシノメーターによる測定 ) 結果は,FBS 不含,10% FBS 含有とも 10 倍希 117

6 図 7 市販牛乳のエンドトキシン測定値図 8 D-MEM(High Glucose) 培地の希釈倍数と添加回収率釈で測定可能である図 8の他,RPMI-1640,Hams F-12,E-MEM 等の培地も同様 10 倍希釈することにより測定可能であるおわりにさまざまな試料のエンドトキシン測定が可能になった局法に関わるエンドトキシン試験は古典的なエンドトキシン検出法の一つであるウサギ発熱性物質試験に替わって, ライセート試薬を利用したエンドトキシン検出法は高感度な測定法としてさまざまな試料に応用されている文献 1) 土谷正和, 高岡文, 時岡信之, 他 : 日本細菌学雑誌 45:903,1990 2) 大石晴樹, 畑山泰道, 白石浩己, 他 : 薬学雑誌 105: 300,1985 3) Oishi H, Takaoka A, Hatayama Y, et al.:j Parenter Sci Teechnol 39:194, ) Oishi H, Fusamoto M, Hatayama Y, et al.:chem Pharm Bull 36:3012, ) Minobe S, Nawata M, Watanabe T, et al.:anal Biochem 198:292, ) 舛田誠, 美濃部敏, 福井知美, 他 : 薬学雑誌,115: 136,

pdf エンドトキシン試験法

pdf エンドトキシン試験法 00-0909.pdf.0 エンドトキシン試験法 3 5 6 7 9 0 3 5 6 7 9 0 3 5 6 7 9 30 3 3 33 3 35 36 37 3 39 0 3 5 6 次のように改める. 本試験法は, 三薬局方での調和合意に基づき規定した試験法である. エンドトキシン試験法は, カブトガニ (Limulus polyphemus 又は Tachypleus tridentatus)