研究成果報告書

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ひできうみのなか
4 years ago
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1 様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書平成年 4 月 1 日現在研究種目 : 若手研究 (B) 研究期間 :8~9 課題番号 :79133 研究課題名 ( 和文 ) ヒト口腔癌に対する緑茶カテキンの MAPK 経路を介するアポトーシス誘導機構研究課題名 ( 英文 ) Mechanism of green tea catechin-induced apoptosis through MAPK signaling pathway in human oral cancer cells 研究代表者加賀谷紀貴 (KAGAYA NORITAKA) 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科助教研究者番号 : 研究成果の概要 ( 和文 ): 本研究は 15 種類のヒト口腔癌細胞株を用い緑茶カテキン成分 (epigallocatechin-3-gallate) のアポトーシス誘導機構を明らかにすることを目的とする初めにアポトーシス誘導性の ZA 株においてによって誘導される細胞内シグナルを解析しカスパーゼ経路と同調して MAPK p38 経路が活性化されることを見出した次に p38 上流の因子として新規に経路に注目し処理後にの核局在化が起こることまた経路の阻害によりアポトーシスが抑制されることが実験により分かった一方アポトーシス非誘導性の HSC4 株では遺伝子を導入することによってによるアポトーシスを誘導することができた研究成果の概要 ( 英文 ):In the present study, I examined the mechanism of (a green tea catechin)-induced apoptosis in human oral cancer cell lines. After treatment, and caspases were activated accompanied with MAPK p38 activation in ZA cell. A non-receptor tyrosine kinase is known to activate MAPK p38 specifically. Therefore, role of in -induced cell apoptosis was examined using inhibitor imatinib or. Inhibition of signaling effectively suppressed -induced apoptosis in ZA cell. In addition, nuclear localization of was observed after treatment. In HSC4 cell in which apoptosis was not induced by, apoptosis was provoked by after the transfection of gene. In conclusion, it was suggested that have important roles in -induced cell apoptosis. 交付決定額 ( 金額単位 : 円 ) 直接経費間接経費合計 8 年度 1,6, 48,,8, 9 年度 1,3, 39, 1,69, 年度年度年度総計,9, 87, 3,77,

2 研究分野 : 分子腫瘍学科研費の分科細目 : 歯学形態系基礎歯科学キーワード : 口腔癌カテキンアポトーシス p38 1. 研究開始当初の背景口腔癌はタバコとアルコールを二大発癌要因とする比較的発症例の多い癌であり頭頸部において広域発癌や転移を引き起こすと生命にとって脅威となるこれに対し外科療法や放射線療法が一般に行われているが副作用や炎症などの課題を残す. 研究の目的本研究では新規で安全な抗癌物質の開発を目的として緑茶カテキンの効果について検討するとともにその作用機序の解明を目指したさらに口腔癌の原因物質として知られる噛みタバコに対するカテキンの発癌抑制効果についても検討を行った 3. 研究の方法 (1) カテキンの抗癌作用に関する研究細胞には本学で樹立した 15 種類のヒト口腔扁平上皮癌細胞株および対照として WI38 ヒト線維芽細胞を用いこれらを種々の条件下において処理した細胞の生物活性は WST-1 assay (Dojindo) により測定した mrna の定量は RNAiso Plus (TaKaRa) で核酸抽出後 RT-PCR (Bca BEST RNA PCR kit Ver1.1 (TaKaRa)) により行った各種タンパクの発現は Western blot により分析したまたタンパクの細胞内局在は NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific) で核および細胞質タンパクを分離抽出後 Western blot により分析した細胞周期は細胞を固定し PI 染色した後スライドグラス上に展開し Laser Scanning Cytometry により解析した Caspase-3 活性は Casoase-Glo 3/7 Assays (Promega) を用いて測定した細胞内シグナル阻害実験は SB358 (p38 阻害剤, 1µM) で h あるいは Imatinib ( 阻害剤, 1µM) で 16h 前処理することにより行ったまた遺伝子ノックダウン実験では Lentiviral Particles (Santa cruz) を導入後安定発現したコロニーを選択して用いた遺伝子導入実験は vector (Promega) を Lipofectamin (Invitrogen) によりトランスフェクションして行った () カテキンの発癌抑制作用に関する研究この実験では当初ヒトケラチノサイトである HaCaT 細胞に対し UV 照射や噛みタバコ成分処理により癌化誘導する予定であったがこの系では十分に癌化が起こらなかったそこで増殖が早くより癌化誘導が容易な V79 チャイニーズハムスター肺線維芽細胞 (RIKEN RCB) を用いて実験を行った癌化を測定するために核酸合成系の酵素である HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase) 遺伝子の変異を利用する方法を用いた初めに V79 細胞を HAT 培地 (Sigma) で 3days 培養し HPRT 遺伝子に変異があってサルベージ経路を利用できないものを予め除いた続いて細胞をで h 前処理した後に噛みタバコ成分 ANE (areca nut extracts, Pure land ethnobotanicals) で 4h 処理することによって HPRT 遺伝子の変異を誘発したその後変異タンパク発現のために 5days 培養を行った HPRT 遺伝子における変異を確認するためにグアニンアナログである 6-thioguanine (Sigma) 含有培地で 1days セレクションを行いギムザ染色後に生存コロニー数をカウントした 4. 研究成果 (1) カテキンの抗癌作用に関する研究初めにヒト口腔扁平上皮癌由来の ZA 細胞株に対しを種々の濃度で作用させた 4h 後の生物活性を測定した結果よりに濃度依存的な殺細胞効果があることがわかった (IC 7 =.34mM) またウェスタンブロットにより種々の濃度条件下においてアポトーシスの指標であるおよびカスパーゼ 3 の断片化を測定した結果 IC 7 近辺に最適濃度があることがわかったこれを踏まえ以降の実験では IC 7 の.34mM を基準濃度として用いた次に ZA 細胞をで処理後各タンパクの発現レベルをタイムコースで測定した (Fig.1) およびカスパーゼ 3 の断片化は処理後 4h から急激に増加し 6h 付近で最大値を示したまた近年細胞死誘導への関与が多く報告されている MAPK のうち JNK は処理後 1h で活性化するのに対し p38 は 1h および 4-6h の段階で活性化されることがわかった従来の研究はによって生成される酸化ストレスを原因と考える 1h の現象に注目したものがほとんどであるが本研究ではカスパーゼ経路の活性化状態との比較から 4-6h における p38 の活性化に注目し新規なアポトーシス誘導機構の提案を目指したなお内因性の活性酸素種の発生

3 については NF-κB の誘導を指標として分析したが顕著な増加は見られなかった Imatinib (h) Trigger signal caspase-3 p-p38 caspase-3 MAPK p38 pathway Caspase pathway p38 p-jnk Apoptosis JNK Control p-p38 subg1=1.% Imatinib subg1=34.% subg1=14.% p38 そこで処理後 6ｈでは p38 のみ活性化されるという知見に基づいて上流シグナル因子の探索を行ったところが候補として挙がり Fig.に示すようなモデルを仮定したは細胞膜非結合性のチロシンキナーゼであり細胞接着に伴う増殖シグナルを担う一方アポトーシスにも関与することが報告されているここで p38 の上流因子としてを考慮したものの阻害剤を用いた実験から p38 自体はアポトーシスには直接関与していないことが示唆された次に ZA 細胞を阻害剤である Imatinib で前処理した場合のによって誘導されるアポトーシスへの影響について検討したその結果 Imatinib によりおよびカスパーゼ 3 の断片化が抑制されさらに p38 のリン酸化も抑制された(Fig.) 次に同様の条件で処理した細胞を PI で染色後細胞周期を解析した処理により subg1 領域の割合は 34 まで増加したものの Imatinib で前処理するとその割合は半分以下に抑えられた(Fig.) またカスパーゼ 3 活性も同様ににより上昇した活性が Imatinib により抑制されることがわかった(Fig.(c)) ZA 以外の口腔癌細胞株についても同様の実験を行ったがほとんどの細胞株においてにより誘導されたの断片化は Imatinib により抑制されることがわかった次に ZA 細胞において遺伝子をノックダウンしたときの影響について検討を行った vector を導入した細胞では control と比べ発現が低下していることを確 (c) Caspase-3 activity [fold induction] Fig.1 Western blotting analysis for activations of caspase and MAPK pathways after treatment with in ZA cell. 1 8 p< Imatinib 1 3 Fig. Effect of Imatinib, a selective inhibitor, on induced apoptosis in ZA cell. 認した後各細胞における生物活性を測定した結果 control に比べを導入した細胞ではに対する保護作用が増強されることがわかった(Fig.3) また等濃度のによって誘導されるの断片化も control と比べでは低く抑えられた(Fig.3) 次に当研究室で所有する 15 種類のヒト口腔癌細胞株および対照として正常細胞である WI38 肺線維芽細胞におけるの作用の違いについて検討を行った初めに各細胞株をで 4ｈ処理後の生物活性を測定した次に各細胞をの IC7 で 6ｈあるいは 1ｈ処理した後のを分析した結果ほとんどの口腔癌細胞株での断片化が見られたものの HSC4 Tsu HOC65 および正常細胞の WI38 では検出されなかったそこでこれら 4 株についてさらに詳細に検討するために濃度を変化させた条件においての分析を行ったこのうち Tsu と HOC65 では濃度を変えた場合にの断片化が検出されたのに対し HSC4 では WI38 と同様全く検出されなかった HSC4 についてはさらにでタイムコースの分析も行ったが

4 同様に検出されなかった 1 control 8 Viability [%] [mm] 次にアポトーシスの非誘導性の HSC4 株に対しベクターを導入することによりの作用にどのような影響が現れるか検討を行った (Fig.5) ベクターを導入したつのクローンにおいて control と比べ mrna レベルおよびタンパクレベルで十分なの発現上昇が確認された (Fig.5) 次にこれらの細胞および empty vector を導入した細胞においての作用の違いを調べた各細胞をで 6h 処理した場合 control および empty vector ではの断片化が検出されなかったのに対し vector を導入した場合が検出されるようになり誘導によるアポトーシスにおけるの重要性が示唆された (Fig.5) control ZA C E C E C E C: control E: HSC4 V1 V HSC4 V1 V β-tublin Fig.3 Effect of gene knock-down on -induced apoptosis in ZA cell. が関与するアポトーシスにおいてはの核局在化が重要と考えられており近年抗癌剤のような DNA damaging agent や酸化ストレスにより処理後間もない 1h ほどでの核局在化が起こることが報告されているそこでアポトーシス誘導性の ZA 株とアポトーシス非誘導性の HSC4 株において処理後のの細胞内局在をタイムコースで測定した (Fig.4) ZA 株では処理後 4-6h に核における量が増加しているのに対し HSC4 株においてはほとんど検出されなかったなお ZA 株ではカスパーゼの活性化と同様の核局在化は処理後 4-6h と比較的遅い時間に起こっていることからこれまで報告されているものとは異なる作用によっての核局在化が誘導されているものと考えられるは培地に添加後 4h ほどで酸化重合によるダイマーの形成がピークに達しまたダイマー形成により細胞膜への結合性が高まることが知られておりこれがの作用機構の一つとして推察される ZA HSC (h) Fig.4 Effect of on the nuclear localization of c-abl in ZA and HSC4 cells. Control vector1 vector C E C E C E C: control E: Fig.5 Effect of gene transfection on -induced cell apoptosis in HSC4 cell. () カテキンの発癌抑制作用に関する研究初めに V79 細胞に対する ANE の発癌誘導作用について最適条件の検討を行った V79 細胞を種々の濃度の ANE で処理すると 1~ 15µg/ml の条件をピークとして変異コロニー数が増加することがわかった (Fig.6) 次に ANE 処理に先立ち予め細胞を所定濃度ので処理したこのとき濃度は細胞毒性がなく分析に影響を与えない 1µM 以下の濃度に設定したその後 ANE 1µg/ml で処理しが ANE の発癌誘導作用にどのような影響を与えるか検討を行った (Fig.6) その結果 5µM 以下のでは濃度依存的にコロニー数を抑制する傾向が見られたもののその効果は十分とは言えず逆に 1µM ではコロニー数が増加したこれは ANE が癌化誘導すると同時に細胞障害作用を有するのに対してが ANE の障害から細胞を保護することによって逆に癌化を促してしまったのではないかと考えられる

5 5 Colony number [/6mm dish] Colony numberr [/6mm dish] ANE [µg/ml] [µm] Fig.6 Effect of on ANE-induced mutagenesis in V79 cell. 5. 主な発表論文等 ( 研究代表者研究分担者及び連携研究者には下線 ) 学会発表 ( 計件 ) 1 加賀谷紀貴原征彦ヒト口腔癌細胞に対する緑茶カテキンの細胞死誘導機構日本分子生物学会 8 年 1 月 9-1 日神戸ポートアイランド加賀谷紀貴口腔癌細胞において緑茶カテキンが誘導するを介するアポトーシスシグナル歯科基礎医学会 9 年 9 月 9-11 日朱鷺メッセ新潟コンベンションセンター 6. 研究組織 (1) 研究代表者加賀谷紀貴 (KAGAYA NORITAKA) 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科助教研究者番号 : () 研究分担者なし (3) 連携研究者なし

センシンレンのエタノール抽出液による白血病細胞株での抗腫瘍効果の検討

センシンレンのエタノール抽出液による白血病細胞株での抗腫瘍効果の検討 Evaluation of anti-tumor activity with the treatment of ethanol extract from Andrographis Paniculata in leukemic cell lines Hidehiko Akiyama 1), Kazuharu Suzuki 2), Toshiyuki Taniguchi 2) and Itsuro Katsuda