Microsoft Word - 分析精度と測定限界の関係 docx

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こごろうあんさい
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1 Ⅱ 分析機器試薬アナリストのための Web 勉強会資料比色分析における分析精度と測定限界の関係 - 分析装置の性能から考えた精度と限界 - 生物試料分析科学会分析機器試薬アナリスト認定員会 - 1 -

2 1 測定上限はどうして決まる比色分析の場合測定限界 ( 測定下限測定上限 ) は使用する比色計の限界に左右されることは言うまでもありませんどこまで高い吸光度の測定が可能かどこまで小さな吸光度の測定が可能かで測定下限と上限が決定しますこの吸光度によって検出物質のモル吸光係数とサンプル量試薬量で測定上限と測定下限が決定しますでは具体的に測定上限を求めてみますサンプル 20μl 試薬 A250μl 試薬 B50μl で分子量 200 の物質を測定したとしますこの時の検出物質のモル吸光係数が l/mol/cm で使用する吸光度測定装置の測定上限の吸光度が 1.5 であったとすると式 (1) は以下のように計算できます測定上限 = ଷ =60 mg/dl 式 (1) 吸光度 (Abs) 12 Absから試料のmol 濃度を求めるにはモル吸光係数 (ε) の単位は mol/l ちょっと Break 終濃度 or 分析時の試料濃度 (mol/l) は 1 に試料希釈倍数 ( 総反応液量 (TV) / サンプル量 (SV)) を乗じたものモル濃度から mg/dl への変換は分子量 (MW) を乗じて g/l としこれに 1000 を乗じて mg/l としさらに 10 で除して mg/dl とします Abs から試料濃度 (mg/dl) を求める一連の式は下記のとおりです Abs ε TV SV MW (1) 10 この式で分子量は変えることができません変えることができるのは 1 測定物質のモル吸光係数 ( 発色させる物質を変えれば変更できる ) 2 サンプル量 3 試薬量の 3 つです測定上限を高くしたければ 1 モル吸光係数の小さな発色物に変更する ( 発色感度の悪い試薬に変える ) 2 サンプル量を減らす 3 試薬量を増やすの 3 点ですなお測定上限吸光度は迷光によって決まります ( 比色計に関する項を参照 ) 2 測定下限と分析分解能とは測定下限も測定できる最小の吸光度で決定され式 (2) で計算できます分析できる最小の吸光度が 0.01 で測定条件が同じであれば測定下限は 0.4mg/dl となります測定下限 = ଷ 20 =0.4 mg/dl 式 (2) 測定下限と有意な差で測定仕分けることの出来る吸光度差とは相違します後者は吸光度測定の分析分解能と称しますもし吸光度との差を正確で有意な差として測定できるとすると吸光度測定の分析分解能はとなります測定に使用する装置の分析分解能がであった場合分析分解能を濃度で計算すると式 (3) のようになります分析分解能 = ଷ =0.04 mg/dl 式 (3) すなわちこの濃度以下を正しく測定仕分けることはできないことになりますもしこの濃度を高くしたければ先ほどの逆で 1 モル吸光係数の大きな発色物に変更する ( 発色感度の高い試薬に変える ) 2 サンプル量を増やす 3 試薬量を減らすようにすればよいわけですこの分析分解能は測定精度そのものを表しており分析分解能を小さくすれば精度の高い分析ができ大きくすると精度が悪くなりますバーネットは医学的意志決定濃度における測定精度を具体的に記述しています例えば血糖値 120mg/dl を 4.2% 以下の再現性で測定すべきことを提言していますそこでこの要望を満たす測定方法を組んでいるのかを考 - 2 -

3 察してみましょう測定方法はヘキソキナーゼ-グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ法 (HK 法 ) で吸光度の分析分解能は0.001 NADHのモル吸光係数は l/mol/cm 試薬 A250μl 試薬 B50μl サンプル量 1.0μlとしグルコースの分子量は180として計算しますまず 120mg/dlの試料を4.2% 以下の再現性で測定するために分析分解能をどの様に設定すべきかを計算します 120mg/dlの4.2% は次の濃度です 120mg/dl 0.042=5.04mg/dl このことから分析分解能が 5.04mg/dlより小さくする必要がありますこれを式 (3) にあてはめると吸光度差 ) のあることを前術しましたこの 3 者が決まれば分析段数が決定します測定できる最大の吸光度を 1.5 とし測定下限の吸光度を 0.01 分析分解能をとすると測定できる段階は次のように計算できます分析段数 = 要するに比色分析法では測定装置の問題から分析できる段数が決定されています一つの階段の高さが分析分解能階段の数が分析段数一番最初の階段の高さが測定下限階段の一番上の高さが測定上限となりますこれをある程度自由に動かすことで測定精度とダイナミックレインジ ( 測定可能範囲 ) を決定します = 1490 段 ଷ ( 吸光度測定上限 ) 測定上限 =0.86mg/dl( 5.04mg/dl) となりこの条件においては分析分解能が 0.86 mg/dl でバーネットの要望より 5.8 倍も精度良く測定できることになります 3 測定精度と測定上限の関係測定上限を求める式と分析分解能を求める式は同じでしたということは測定上限を 2 倍に上昇させることは測定精度を半分に落とすことになりますつまり両者は切っても切れない関係にあるのですよって分析システムを構築する時は先ず測定の精度を決定します ( バーネットの考え方だけでなく自施設の診療医の要望する精度で組み立てること測定精度は分析分解能だけでなく吸光度によって測定精度が変化する後述する項目参照 ) 次いで測定上限から再検査率を求め検査に携わる方々の納得できる測定上限 ( 試薬の限界によって測定上限が決まることもあるため試薬の限界の項を参照下さい ) となるように設定すべきです 4 分析段数とは何? 吸光度を測定する装置には測定下限上限分析分解能 ( 一定の精度で測定できる最小の分析分解能 ( 吸光度分析の最小値 ) 測定下限 ( 吸光度測定下限 ) 図 1 5 レートアッセイでも同じか? レートアッセイもほぼ同様な計算が成り立ちます測定できる最大の吸光度変化量最小の変化量があり分析分解能としての検出限界もあります 1 分間に 0.3/min の吸光度変化を測定できる装置があったとしますまた分析分解能としての検出限界は /min としますすると分析段数としては 30,000 段となりますダイナミックレンジ ( 測定可能範囲 ) 分析段数と分析分解能の関係エンドポイント法でも同様ですが試薬の限界も存在します試薬の限界についてはその内容を試薬の項で詳細に解説します 6 再現性と分析分解能の関係分析分解能は吸光度測定の立場でこれ以上小さな吸光度差を測定できないことから生 - 3 -

4 まれた数値ですたとえば分析分解能が 1.0mg/dlの分析システムを用い 50mg/dlの管理試料により同時再現性を測定した場合に CVがほぼ2% になることを意味していますもう少し具体的に記述してみましょう次のような測定系でAST 活性をJSCC 勧告案に準じて測定したとします血清 2.0μl 試薬 A 100μl 試薬 B20μl 分析分解能としての最小速度が0.0001/minであるとすると分析分解能は次のように計算できます分析分解能 (U/l)= /min ଷ = 1.0U/l この様な測定システムで40U/lの管理血清の測定を実施した場合同時再現性のCVは 2.5%(1.0/40 100=2.5%) 以下を期待してはならないことを意味しています 7 グルコース測定法の組み立て血糖値を測定する方法において具体的な測定法を組み立ててみましょう医師の要望分析装置の性能試薬の能力および検査技師の要望の全てを満たすことができる測定法が構築できるかを考えたいと思いますただし次に示す性能と要望があるものとします 1. 吸光度の測定できる範囲は0.01から1.0 の範囲であること 2. 正確に測定仕分けることの出来る吸光度差は0.001であること 3. 最も正確に測定できる吸光度は0.34であること 4. サンプルの採取量は1.0μl 刻みで 50μl 以下であること 5. 試薬は1 種類であること 6. 吸光度測定には最低でも反応液量が 2.5ml 必要で 3.5mlを超えないこと 7.800mg/dlを超える濃度を測定することは1.0% 以下 600mg/dlを超える測定は 2.0% 以下 500mg/dlは4.0% 以下とすること 8. 医師から要望されている再現性は50 mg/dl 付近で10% 100mg/dl 付近で 5.0% 120mg/dl 付近で4.2% 以下であること (Barmett) 9. 再検査率は検査技師の中で 5.0% 以下となるように要望されていること 10. 総反応液量は 3.0ml とすること以上の条件をなるべく満足できる試薬調整法を次に示す条件から順次考えることにしましょう 1)800mg/dl まで希釈することなく測定できる 2) 医師が要求する精度を満足させる測定方法を構築する 3) 測定下限を 30mg/dl とする 4) 反応を 5 分以内に終了させる 1 2 GOD の添加量を考える測定原理に出てこなかった試薬で添加すべき試薬はあるのか考える 5)POD は 300U/l 添加するものとして考える 6)4- アミノアンチピリン (4-AA) は 1.0 mmol/l フェノールは 10.0mmol/l( 終濃度 ) とする 7) 試薬は 1 試薬系とする 1)800mg/dl まで希釈することなく測定する方法を考えるこの目的を達成するためのサンプル量 (SV) と総反応液量 (TV) を考えますただし SV を 3.0ml MW180 とします ε: l/mol/cm( キノン体のモル吸光係数 ) 800mg/dl = ΔAbs ε TV SV MW = ସ SV SV=0.0107ml=10.7μl すなわちサンプル量を10.7μl 以下とすれば良いことになります ( 注 )GOD/POD 法の場合は下記の反応式のようにグルコース 1mol から過酸化水素が 1mol できますがキノン色素 1mol は過酸化水素 2mol から生じますしたがってキノン色素濃度からグルコースの濃度を求める際にはキノン色素濃度を 2 倍する必要がありま - 4 -

5 す Mutarotase α-d-glucose β-d-glucose+o 2+H 2O β-d-glucose H 2O 2+Gluconic acid 2H 2O 2+4-Aminoantipyrine+Phenol 図 2 [Red pigment]+4h 2O GOD/POD 法によるグルコース測定原理 2) 医師に要求される精密度を満足させる測定方法を構築する医師が最も精度良く測定して欲しいと要望する濃度は 120mg/dl でありこの濃度における再現性が 4.2% 以下であることであり言いかえれば標準偏差 ( SD ) を 5.0mg/dl (120mg/dl 0.042) 以下にして欲しいということです測定者の立場からすると整数値で測定値を報告するのですから分析分解能が 5.0mg/dl で良いと言われても納得できませんもっと精度を上げて分析分解能を 1.0mg/dl とし 10% 以下の精密度で測定するためする方策を立案するための具体策としてサンプル量 (SV) と総反応液量 (TV) の比を計算します 1.0mg/dl = ΔAbs ε TV SV MW = ସ SV SV = ml = 8.57μl このことよりサンプル量が 8.57μl 以上であれば良いことが分かります GOD POD 前述の条件 1) の要望とこの精度の両方からサンプル量は 9μl か 10μl を選択するしかありませんそこでサンプル量を 10μl とした時の測定下限を計算すると ( 吸光度変化量 0.01 の時 ) 測定下限は 8.57mg/dl となり要望の測定下限 30mg/dl も測定できることとなります ସ = 8.57mg/dl 0.01 以上の結果より条件 1)~3) を満足させる測定操作はサンプル量を 9 もしくは 10μl とし総反応液量を 3.0ml とすることが適切ということになります ( 以下は 10μl(0.01ml) として記述します ) この条件で臨床上精度良く測定したい濃度がどの程度の再現性となるか考えます要するに mg/dl 付近の吸光度を計算します 50mg/dl = ΔAbs = mg/dl = ΔAbs = mg/dl を発色させた吸光度が 0.058Abs 120mg/dl を発色させた時で 0.140Abs となり最も再現性良く測定できる濃度は 290mg/dl 付近の濃度であることになりますなお 30mg/dl の試料を測定した時の ΔAbs は同様な計算からと演算でき測定下限の吸光度 0.01 を上回っているため十分測定できると判断されます 3)5 分以内に反応を終了させるための GOD 活性添加量の決定反応を所定の時間までに終了させるために考慮しなければならない点は次の事項です ΔAbs ସ ΔAbs ସ ムタロターゼの添加 GOD の添加活性 POD の添加活性 GOD は β-d- グルコースにのみ反応し α-d- グルコースには反応しないため化学平衡反応が終了するまで反応は終了しませんこのため図 2 に示すムタロターゼを添加する必要がありますこの反応と GOD の 2 段階の反応解析を演算することは難しいのですがムタロターゼ反応は素早く終了するため演算からは除外して考えることができますそこで 5 分以内に反応を終了させるために必要な GOD 活性添加量を演算しますなお酵素反応は一次速度定数にしたがって進行す - 5 -

6 ると考えます初期基質濃度を C t 時間後の基質濃度を C としこの反応が 99% 進行したとすれば次のように一次反応式を記すことができます 5 分間で反応を終了させたいので t=5 を代入しまた = mܭ/ なのでこれに今回使用した GOD の mܭ 値 mol/l を代入します = = ln = mܭ = ଶ 5 = ଶ 10 ଷ 5 = mmol/min/l (U/ml) V が U/ml とシミュレートされたので GOD は終濃度で U/ml 以上の活性が添加されていれば 5 分間で反応が終了できると予測されますなお POD の反応はとても早いため計算は割愛できます 4) 一剤化試薬としての操作法以上のことより具体的な操作法と一剤化試薬調整法を記述します試薬容量組成試薬 2.99ml 100mmol/l リン酸緩衝液 (ph7.0) 31U/ml GOD 1.0U/ml POD 1.0U/ml ムタロターゼ 1.0mmol/l フェノール 1.0mmol/l 4-AA 試料 0.01ml 37 にて5 分間加温後 505nmにて吸光度を測定するブランクとして精製水各種濃度の標準液を試料とし吸光度を測定して検量線を作成するフェノールと4-AAの終濃度に関しては干渉反応の項で記述します本資料は分析機器試薬アナリストのための Web 勉強会用テキストです無断転載を禁じます制作著作生物試料分析科学会分析機器試薬アナリスト認定委員会発行日平成 23 年 7 月 25 日発行責任者小川善資 - 6 -

IC-PC法による大気粉じん中の六価クロム化合物の測定

IC-PC法による大気粉じん中の六価クロム化合物の測定 Application Note IC-PC No.IC178 IC-PC 217 3 IC-PC ph IC-PC EPA 1-5.8 ng/m 3 11.8 ng/m 3 WHO.25 ng/m 3 11.25 ng/m 3 IC-PC.1 g/l. g/l 1 1 IC-PC EPA 1-5 WHO IC-PC M s ng/m 3 C = C 1/1 ng/m 3 ( M s M b ) x