15K21619 研究成果報告書

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こうたあわたけ
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2 様式 C-19 F-19-1 Z-19 CK-19( 共通 ) 1. 研究開始当初の背景日本国内においては食品衛生法に基づく微生物規格基準により食品毎に汚染指標菌に対する培地検査方法が定められているが培地による従来法は検査に時間がかかることが問題である一方従来法にかわる迅速検査手法として DNA プローブ法や PCR 法といった分子生物学的手法が開発されているが対象菌種が限られ操作が複雑かつ試薬が高価であることが問題であるこのような状況の中新たな細菌検出手法として細菌細胞内の自家蛍光分子による蛍光特性に関する基礎的研究が行われておりモでル系においては菌種判別の可能性が示唆されているしかし国際的な基礎研究の進展に比して日本における食品および細菌の自家蛍光の研究は極めて少なくまた先行研究で扱われている菌種は限られているこれを踏まえて研究代表者はこれまでに蛍光指紋と多変量解析による食品中の菌数推定手法の研究開発に取り組んできたさらに研究代表者は国内において問題とされる菌種について蛍光指紋による菌種判別の可能性を見出し報告してきたこの自家蛍光指紋分光法は細菌の検知同定のための非接触試薬不要迅速簡便な手法となる可能性があり実用化のために今後は各種細菌種菌株の蛍光指紋ライブラリの構築や菌種を識別する蛍光パターンの規格化などの基礎データの蓄積とそれを基にした細菌の判別定量技術の研究開発が必要であると考えられた. 研究の目的本研究は蛍光指紋分光法によって食品に関連した病原性細菌を迅速に検出する手法の開発を目的とした具体的な研究項目として 1 蛍光指紋による菌種判別手法の開発蛍光指紋による菌数定量手法の開発 3 ファイバープローブによる蛍光指紋計測と 1 を組み合わせた迅速化のための多検体検査システムの構築の 3 つを計画した 3. 研究の方法本研究のキーテクノロジーである蛍光指紋とは励起光の波長を連続的に変化させながら測定した複数の蛍光スペクトルを並べた 3 次元でータのことである ( 励起蛍光マトリックスともいう ) 蛍光ピークの極大から裾野に至る蛍光特性を網羅的に観測することによって物質に固有のパターンを得ることができるまた幅広い励起蛍光波長範囲を走査することによって一度の測定で様々な蛍光物質を網羅的に測定することが可能でありスペクトルの多変量解析によって複数成分を同時に解析することが可能である 3 つの研究項目のうち第一段階として蛍光指紋によって細菌の菌種を判別する手法の開発を行ったまず各種細菌の蛍光指紋を収集し細菌毎にでータを平均化しこれをその菌種および菌株の参照蛍光指紋として定義することで蛍光指紋ライブラリを構築する次に未知の試料の蛍光指紋と既知の参照蛍光指紋のパターンが似ている度合いを類似度などで数量化することによって対象菌種を判定する手法の開発を行った第二段階として各種細菌の増殖過程において一定時間毎に蛍光指紋および生菌数の計測を行い多変量回帰分析によって蛍光指紋による菌数定量のための手法の開発を行った具体的には検出対象とする各種細菌について濃度の異なるサンプルで測定した蛍光指紋を説明変数コロニーカウント法などで測定した生菌数を目的変数とし PLS 回帰分析などの多変量解析手法によって蛍光指紋から各種細菌の生菌数定量モでルの構築を行った第三段階として光ファイバープローブと自動 XY ステージを用いた迅速化のための多検体検査システムの開発を行ったまず第一第二段階で開発した手法を基にファイバー光学系での菌種判別菌数定量のモでルを構築するその上で取得したでータに対し 1 蛍光指紋の類似度で菌種判別を行い確定した菌のモでルを適用して菌数定量を行う判別定量手法を構築するそして XY 方向に走査可能なステージとマイクロプレートを用いて複数検体の測定を自動化することによって多検体検査システムの構築を行った 4. 研究成果本研究で得られた成果について 3 つの研究項目に分けて以下に示す 1 蛍光指紋による菌種判別手法の開発簡便かつ迅速な菌種判別手法として細菌の自家蛍光に関する研究が 000 年初頭から行われており微生物はエネルギー生成反応に関連した無数の細胞内生体分子を有しているその蛍光特性はこれらの生体分子を有用な自家蛍光プローブたらしめると考えられているそのような細菌に含まれる自家蛍光分子の一覧を表 1にその蛍光指紋データを図 1にそれぞれ示す各蛍光分子の励起および蛍光極大波長は異なるため全ての蛍光分子はそれ表 1 蛍光分子の一覧ぞれ固有の蛍光特性を有しているがそのスペクトルは互いに重なり合ったものとなることが図 1 から判るこれが蛍光指紋データの解析に多変量解析などが用いられる所以である

細菌の蛍光指紋の例として大腸菌のデータを図に示す表 1に上げた蛍光分子のうち実際には 3 種類の物質 (1 芳香族アミノ酸 NAD(P)H 3FAD およびフラビン ) に由来すると思われる自家蛍光が観測された芳香族アミノ酸は細胞中のタンパク質やペプチド中のアミノ酸残基として存在しその微小環境の情報を含むと考えられるまた補酵素の

波長条件の選択やスペクトルの前処理を行った後 PLS 判別分析などを行うことによって菌種の判別モデルを構築することができた菌種判別結果の例として次の種類の菌種 (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Salmonella 100% 0% Staphylo 100% 0% Total 80% % 表菌種判別結果の例 Error Rate Precision 10% 7% 10% 7% 0% 0% 0% 100% 0% 100% 8% 78% TPR: True Positive Rate FPR: False Positive Rate

サンプル調製後の迅速な測定が求められるしたがってサンプル調製の迅速化を目的として細菌懸濁液の濁度調整システムを構築した同システムは分光光度計超小型スターラーシリンジポンプなどから構成され ( 図 3) 自作の制御プログラムにより濁度をモニタリングしながらポンプで細菌懸濁液を送液し目標濁度に到達した時点で停止する ( 図 4)

3 細菌の蛍光指紋の例として大腸菌のデータを図に示す表 1に上げた蛍光分子のうち実際には 3 種類の物質 (1 芳香族アミノ酸 NAD(P)H 3FAD およびフラビン ) に由来すると思われる自家蛍光が観測された芳香族アミノ酸は細胞中のタンパク質やペプチド中のアミノ酸残基として存在しその微小環境の情報を含むと考えられるまた補酵素の NAD(P)H や FAD 及びフラビン由来と思われる自家蛍光も観測され微生物の代謝活性や生理状態に密接に関係する物質の情報を得ることができると考えられるこのような蛍光指紋データを取得するための細菌の自家蛍光指紋測定の実験プロトコルを確立した図 1 各種蛍光分子の蛍光指紋データ菌種判別では測定によって得られた図のような蛍光指紋データから波長条件の選択やスペクトルの前処理を行った後 PLS 判別分析などを行うことによって菌種の判別モデルを構築することができた菌種判別結果の例として次の種類の菌種 (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis) を対象とした場合の混合行列を表に示す全体では図大腸菌の蛍光指紋データ 78% 程度の判別精度が得られているがリステリア (Listeria) の精度が低い点などはさらなる改善が求められる Class TPR FPR Bacillus 100% 13% Ecoli 7% % Listeria % % Salmonella 100% 0% Staphylo 100% 0% Total 80% % 表菌種判別結果の例 Error Rate Precision 10% 7% 10% 7% 0% 0% 0% 100% 0% 100% 8% 78% TPR: True Positive Rate FPR: False Positive Rate Error Rate: Precision: また細菌の蛍光指紋を測定するための実験プロトコルに関して懸濁液サンプルの調製においてサンプルの濃度を標準化するために濁度を調整する段階での労力が大きく時間がかかることが課題の遂行において問題であった細菌の濃度は蛍光強度に大きく影響しまた生体試料は時間とともに変化しやすくサンプル調製後の迅速な測定が求められるしたがってサンプル調製の迅速化を目的として細菌懸濁液の濁度調整システムを構築した同システムは分光光度計超小型スターラーシリンジポンプなどから構成され ( 図 3) 自作の制御プログラムにより濁度をモニタリングしながらポンプで細菌懸濁液を送液し目標濁度に到達した時点で停止する ( 図 4) 目標とする濁度に応じて流速などのポンプ制御パラメータを適切に選択することにより迅速かつ高い精度での調整が可能となりこれによって蛍光指紋測定のためのサンプル調製が大幅に迅速化および省力化された原液 : 蒸留水 1 ml 送液 : 濁度標準液 (PS) 流速 : 0.1 ml/min 目標濁度 : 0.0 誤差 : ±0.001 図 3 濁度調整システムの外観図 4 濁度調整の例

18 ② 蛍光指紋による菌数定量手法の開発 -0. 本研究項目では細菌懸濁液における菌数を vs -1 知るための手法として蛍光指紋による推定手 -1. 法の開発を行った比較対象として培養中に - 菌数を推定するのによく使われる濁度法も合わ -. せて実施した培地中で細菌が増殖すると細 -3 菌の増殖に伴って培地は次第に濁っていくた -3.

4 18 ② 蛍光指紋による菌数定量手法の開発 -0. 本研究項目では細菌懸濁液における菌数を vs -1 知るための手法として蛍光指紋による推定手 -1. 法の開発を行った比較対象として培養中に - 菌数を推定するのによく使われる濁度法も合わ -. せて実施した培地中で細菌が増殖すると細 -3 菌の増殖に伴って培地は次第に濁っていくた -3. めこの濁り具合濁度および吸光度を光学 -4 的に測定することで菌数を推定することができる一方蛍光指紋を用いた場合細菌の増 4 vs 殖に伴って細菌に含まれる蛍光分子の量が増加 3. するためその蛍光強度を測定することで菌数を推定することができる 3 8 (01) 14e0 D. Mita Mala et al. / LWT - Food Science Technology 例として図５に大腸菌を対象とした場合の生菌数と濁度および蛍光強度の関係を示す濁. 度の場合細菌による吸収散乱を捉えており 1細菌の検量線を作れる範囲はおよそ３桁程度の D. Mita Mala et al. / LWT - Food Science Technology 8 (01) 14e D. Mita Mala et al. / LWT - Food Science Technology 8 (01) 14e0 ダイナミックレンジが得られる一方蛍光の log CFU/mL 場合は細菌に含まれる蛍光分子の発光を捉えているため濁度に比べて検出感度が２３桁図５生菌数と濁度および蛍光の関係高く検出器の感度を変化させることで最大で６桁程度のダイナミックレンジが得られるここで示した例では濁度では約 CFU/ml のオーダーを推定することができるのに対して蛍光指紋では約 104 CFU/ml のオーダーからより高感度に菌数を推定できる可能性が示された ③ ファイバープローブによる蛍光指紋計測と多検体検査システムの構築本研究項目ではファイバープローブを用いた多点計測システムの作成を行った図６にシステムの概要を示す同システムでは蛍光分光光度計に接続された光ファイバープローブを暗室状態の試料室に導きプローブ先端と試料を一定距離に保った上で自動 XY ステージによって多点を移動させることで各点の蛍光指紋の測定を行うことができる同システムを用いることで菌数定量モデルの開発までは行うことができたが菌種判別の実装まではいたらなかったファイバープローブを用いた場合の菌数定量の例として牛肉表面の生菌数を推定した結果を図７に示すこの例では一般生菌数を対象として決定係数 0.89, Fig. 4. Fluorescence ﬁngerprints (FFs) beef (1 h) using ﬁber optics. (a) FF beef surface in range normal intensities (0e7000 intensity (a.u.)). (b)rff = beef surface shown with log-scale intensities. A: regions related to tryptophan; B: region related to porphyrins. 推定誤差 RMSEP = CFU/ml の推定精度が得られている Fig. 1. Flowchart for FF measurement through ﬁber optics experiment. Fig. 1. Flowchart for FF measurement through ﬁber optics experiment. Preprocessing LV number R Cal R Val RMSEP Mean center Auto scale Normalize þ Mean center Fig.. Schematic structure FF with ﬁber optics system. Fig.. Schematic structure FF with ﬁber optics system. 図６多点計測システムの構成例 not ﬂuorescence. (c) removal data with excitation wavenot ﬂuorescence. data with excitation lengths lower than(c) 0 nmremoval emission wavelengths higherwavethan lengths lower than nm noise emission higheretthan 80 nm, for which0 signiﬁcant wavelengths observed (Fujita 80 nm, for which signiﬁcant noise observed (Fujita et 010; Shibata et 011). A total 3991 FF intensities 010; Shibata et 011). A total 3991 FF intensities one-point measurement remained after preprocessing one-point measurement remained after preprocessing procedure. procedure..4.. Partial least square regression analysis.4.. Partial least square regression analysis Partial least squares regression () applied to develop a Partial least squares regression () applied to develop a for predicting APC beef using FF data as explan for predicting APC beef using FF data as explanatory variables. In total, 108 (two samples/storage time! nine Fig.. Predicted vs measured log(apc) calibration. atory variables. In total, 108 (two samples/storage time! nine points/sample! six storage times) APC FF data values were points/sample! six storage times) APC FF data values were used as calibration set, same amount data used used as calibration set, same amount data used as start test data for validation. data were transformed to logais known to shortly before All onset spoilage due to glucose as test data for validation. All data were transformed to logarithmic values n normalized mean-centered. exhaustionrithmic (Gill, 198). A corresponding to tryp- values refore, n region normalized mean-centered. tophan considered to have a high VIP score with a negative correlation because degradation amino acids including optimization latent variables (LVs) carried out venetian optimization latent variables (LVs) Oehlschlager, carried out blind cross-validation (Davis, Charlton, & venetian Wilson, blind Oehlschlager, Wilson, 00).cross-validation number (Davis, LVs Charlton, chosen searching for& local 00). number LVs chosen searching for local minima knee root mean square error crossminima knee root mean square error crossvalidation (RMSECV) drop curve. accuracy validation (RMSECV) curve. accuracy evaluated observingdrop RMSECV, root mean square error evaluated observing RMSECV, root square error (RMSEP) mean determination (R ). 007b (RMSEP) Inc., determination (R ). MATLAB (MathWorks, USA) along with PLS Toolbox MATLAB 007b (MathWorks, Inc.,USA) USA)were along with Toolbox.7.1 (Eigenvector Research, Inc., used to PLS develop.7.1 (Eigenvector Inc., wereused to develop. At Research, same time, USA) variable importance projec.score At same variable importance tion (VIP) time, projecwere tion (VIP) score were calculated. calculated. While used numerous FF variables for predict used numerous FF variables forusing predictingwhile APC, important variables for ing APC,could important variables for using be evaluating VIP regression could be evaluating VIP regression stro m, & Eriksson, 001). VIP score in (Wold, Sjo stro m, & Eriksson, 001). VIP score in o dicates (Wold, relativesjinﬂuence each independent variable is dicates inﬂuence variable's each independent diis sum relative effect each over all variable sum effect total eachexplained variable'svariation over all dimensions divided mensions divided Perez, total explained variation (Trap, Bureau, & Aubert, 013). On or h, Bureau, Perez, & Aubert, 013). On direction or h, sign (Trap, regression indicates sign between regression indicates direction correlation APC corresponding variable. correlation between APC corresponding variable. log CFU/cm log CFU/cm Table 1 Results PLS regression for three preprocessing methods. Fig.. Predicted vs measured log(apc) validation. 3. Results discussion 図７生菌数定量モデルの例牛肉の生菌数 3. Results discussion 3.1. Aerobic plate count tryptophan microorganisms on beef surface Aerobic plate count A positive regression comes from emission Fig. 3 shows load beef slices during storage Fig.an 3 aerobic shows beef during storage porphyrins (Fig. 7, region B). areslices a large group organic " C. under condition at Porphyrins 1load exponential growth phase " C. exponential growth phase under an aerobic at four 1 compounds that condition consist pyrrole methane occurred between 1 7 h. During thisrings phasejoined growth, not occurred between 1 7 h. During this phase growth, bridges. Porphyrins ﬂuorophores are found many foodsnot such as only load increasing butin(bio)chemicals on only load increasing but (bio)chemicals on meat surface were et also Martinko, dairy (Wold altered 00)(Madigan, meat (Ash Stahl, et &003; meat surface were also altered (Madigan, Martinko, Stahl, & Clark, 010). load in ﬁrst 1 h & Hattori, ﬁrst experveberg et 00; Wakamatsu, Nishimura, 004). Clark, 010). load in ﬁrst 1 h ﬁrst experiment porphyrin an average 4.8 loginvestigated CFU/cm. Thisinnumber increased ﬂuorescent species previous studies on iment an average 4.8 log CFU/cm. This number increased every 1 h until spoilage sample, that is, intense discoloration meat were protoporphyrin (PP) zinc every 1 hmeat until spoilage sample, that is, intense IX discoloration presence f-odors, observed at 48 h with a miprotoporphyrin (ZnPP), ﬂuorescence PP h ZnPP presence f-odors, observed at 48 with aintensities load approximately 8.4 log CFU/cm. In contrast, approximately 8.4 log CFU/cm. In contrast, in crobial freshload pork with storage load in meat ﬁrst 1 increase h second experiment time about load in ﬁrst 1 second experiment about temperature et h 008). shelf-life half that in(schneider ﬁrst experiment. Moreover, in second half thatmeat in ﬁrst under experiment. Moreover, second meat different storagein conditions can also be derived from ﬂuorescence phorphyrins (Durek, Bolling, gele, & Schlüter, 01). Porphyrins on a meat surface Knorr, Schwa

5 . 主な発表論文等雑誌論文 ( 計 4 件 ) C. Feng, M. Yoshimura et "Estimation adenosine triphosphate content in readyto-eat sausages with different storage days, using hyperspectral imaging coupled with R statistics, Food Chemistry, 4, (018). DOI: /j.foodchem ( 査読有 ) C. Feng, M. Yoshimura et Real-time pre-cooked Japanese sausage color with different storage days using hyperspectral imaging, Journal Science Food Agriculture, 98, 4-7 (017). DOI: /jsfa.874 ( 査読有 ) C. Feng, M. Yoshimura et "Hyperspectral Imaging in Tem with R Statistics Image Processing for Detection Visualization ph in Japanese Big Sausages Under Different Storage Conditions, Journal Food Science, 83, 38-3 (017). DOI: / ( 査読有 ) D. M. Mala, M. Yoshimura, et "Fiber optics fluorescence fingerprint measurement for aerobic plate count on sliced beef surface, LWT - Food Science Technology, 8, 14-0 (01). DOI: /j.lwt ( 査読有 ) 学会発表 ( 計 4 件 ) 吉村正俊ほか, 蛍光指紋イメージングによる牛肉表面の生菌数可視化, 農業環境工学関連学会 01 年合同大会 (01). D. M. Mala, M. Yoshimura, et "Development fluorescence fingerprint monitoring system for content beef, 農業環境工学関連学会 01 年合同大会 (01). 吉村正俊ほか, 細菌の蛍光指紋測定のための濁度調整システム, 日本食品科学工学会平成 7 年度関東支部大会 (01). 吉村正俊ほか, 蛍光指紋分光法と PLS 判別分析による菌種判別の試み, 平成 8 年度日本分光学会年次講演会 (01). D. M. Dheni, M. Yoshimura et "A Novel Indirect Method for Microbial Growth Prediction on Meat Fluorescence Fingerprint, 農業食料工学会第 7 回年次大会 (01).. 研究組織 () 研究協力者研究協力者氏名 : 川崎晋ローマ字氏名 :KAWASAKI, Susumu 所属研究機関名 : 国立研究開発法人農業食品産業技術総合研究機構部局名 : 食品研究部門職名 : 上級研究員科研費による研究は研究者の自覚と責任において実施するものですそのため研究の実施や研究成果の公表等については国の要請等に基づくものではなくその研究成果に関する見解や責任は研究者個人に帰属されます

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Mikio Yamamoto: Dynamical Measurement of the E-effect in Iron-Cobalt Alloys. The AE-effect (change in Young's modulus of elasticity with magnetization) in the annealed state of iron-cobalt alloys has been