mrna 品質管理機構 DNA Pol AAAA pre-mrna EJC (Exon Junction Complex) Cap AAAA elfs リボソーム Trans-acting element Nuclear export receptor AAAA PABP AAAA AAAA RIS

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1 研究用試薬 遺伝子発現の転写後調節の新規解析ツール TM RiboCluster 免疫沈降 抽出 RIP-Certified Antibody AAAAA NA 子mR A遺伝 AGO RBP-X elfs mirna RISC RBP-Y RBP-Z B遺伝 40S AAAAA 子mR NA 60S RiboCluster とは ある特定の疾患や機能に関連した mrna や mirna などの RNA と RNA 結合タンパク質 RBP が集合体 クラスター を形成していると考える概念です RBP は クラスターを介して RNA のスプライシング 核外輸送 細胞質内局在 安定性及び翻訳効 率の調節などの転写後の遺伝子発現を制御しています RiboCluster ProfilerTM は 特定の疾患や生物学的に関連した遺伝子群を網羅的 に解析するために最適化されたユニークなツールです RIP-Chip技術はRibonomics, Inc. の特許技術 (USP# 6,635,422 USP# 7,504,210 ) です MBLはRibonomics, Inc.からワールドワイドな通常実施権を得てキットを開発しています

2 mrna 品質管理機構 DNA Pol AAAA pre-mrna EJC (Exon Junction Complex) Cap AAAA elfs リボソーム Trans-acting element Nuclear export receptor AAAA PABP AAAA AAAA RISC AGO AAAA コドン mrna が核内で DNA から転写されリボソームで翻訳されるまでの間には 様々な品質管理 制御機構が介在しています これらのプロセスにおいて中心的な役割を担っているのが RBP であり 機能的に関連性のある mrna 群の細胞内挙動をクラスター形成を介して制御していると考えられています 広がる RNA 世界 タンパク質に翻訳される mrna に対し タンパク質をコードしない RNA を総称して non-coding RNA (ncrna) と呼びます 従来から知られているリボソーム RNA(rRNA) やトランスファー RNA(tRNA) も ncrna に分類されます RNA interference (RNAi) 経路において機能的に重要な役割を担っている small ncrna (mirna sirna pirna) や 核内機能ドメイン構築への関与が多数報告されている長鎖の mrna 型 ncrna などが注目を集めています non-coding RNA カテゴリー長さ (nt) 分布既知機能 リボソーム RNA (rrna) 全生物種 翻訳 トランスファー RNA (trna) 全生物種 翻訳 核内低分子 RNA (snrna) 真核生物 スプライシング mrna プロセシング 核小体低分子 RNA (snorna) 真核生物 古細菌 RNA 修飾 rrna プロセシング mirna 真核生物 翻訳制御 mrna 安定性制御 sirna small RNA 真核生物 感染防御 mrna 安定性制御 pirna 真核生物 ゲノム安定性制御 mrna 型 ncrna 数百 数十万 真核生物 転写制御 スプライシング制御 輸送制御 2

3 AAAAAA AAAAAA mirna 経路 AAAAAA sirna 経路 dsrna DGCR8 TRBP Target mrna Guide 鎖 Deadenylation AAAAAA Guide 鎖 Target mrna short interfering RNA (sirna) は ウイルス感染などの様々な要因で生じる長い 2 本鎖 RNA (dsrna) が由来とされています Dicer により 長い dsrna が nt の 2 本鎖 RNA (sirna duplex) へと変換されます sirna duplex のうち guide 鎖が RISC (RNA-induced silencing complex) 中の AGO に取り込まれ silencer として機能します RISC に取り込まれなかった passenger 鎖は分解されます リボソーム microrna (mirna) は 核内で stem-loop 構造を保ったまま Drosha などによって切り出され precursor mirna (pre-mirna) として細胞質へと輸送されます pre-mirna は RNase III 活性を有するDicerにより ntの2 本鎖 RNAへと変換された後 Argonaute タンパク質 (AGO) に取り込まれます 2 本鎖 RNA のうち passenger 鎖が除去 / 分解されることで guide 鎖が標的 mrna の 3' 非翻訳領域 (3'-UTR) に結合できるようになり 翻訳抑制機構が働くと考えられています mrna 型 ncrna と核内機能ドメイン pirna 経路 Antisense pirna Sense transposon transcript PIWI-interacting RNA (pirna) は トランスポゾンの転写産物の 1 本鎖 RNA が由来とされ Dicer などの RNase III 活性を持つタンパク質によるプロセシングを必要としない primary processing pathway を介して生合成されます 生殖細胞特異的な発現が認められている PIWI タンパク質にローディングされることにより トランスポゾンの silencing に寄与していると考えられています 近年のトランスクリプトーム解析の発展により ヒトにおいては 全ゲノム領域の 9 割以上が転写されているとの知見が得られています また ヒトの場合 RNA に転写されるゲノム情報の 95% 以上が ncrna であると見積もられています つまり 転写されて生じる RNA の大部分は ncrna であるということになりますが これらの ncrna の大半がアノテーションをつけられておらず どのような機能を有しているのか理解されていないのが現状です これらの中には タンパク質はコードしないが転写後のプロセシングを受ける mrna 型 ncrna の存在も確認されています RNA 研究が盛んになるにつれて mrna 型 ncrna の大半は核内に留まり 様々な機能ドメイン構築に関与しているという事が次第に明らかとなってきました ncrna や RBP などで構成される核内機能ドメインにおいては 機能単位ごとに ncrna や RBP が時空間的に制御 配列されてクラスター ( 集合体 ) を形成しており MBL の提唱している RiboCluster という概念を裏付けるものとして注目されています Cajal body 核小体と密接な関 があり snrnpの生合成の場として機能する 核小体非クロマチン領域 Nuclear speckle 核内で10 30の 点状構造としてされ 転写やスプライシング 輸送に関与する多数の因子の局在が認められる クロマチン領域 Paraspeckle 核内で10 20の 点状構造としてされ mrnaのスプライシングや核内 留 転写制御に関与する PML body 核内で10 20の 点状構造としてされ Sp100や転写因子などが局在する 細胞の癌化にも関 する 3

4 RIP-Certified Antibody スプライシング ゲノムから転写された precursor mrna (pre-mrna) は スプライシングにより intron 配列が除去され exon 部分が連結した mrna へと変換されます 様々な RBP が関わる事によりオルタナティブスプライシングが誘発され タンパク質のバリエーションが維持されています RIP-Certified Antibody pre-mrna RBP RBP コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN045P anti-slbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HBP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN019P anti-hnrnpk Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPK) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN014P anti-tia1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN015P anti-ybx1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN011P anti-ptbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (hnrnpⅠ) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN021P anti-khdrbs1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (p62, SAM68) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN041P anti-khdrbs2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (SLM1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 機能 局在など Histone pre-mrna の 3' 末端の stem-loop 構造に結合し プロセシングや 輸送 翻訳 分解に関与する 細胞周期の制御にも関与する hnrnp 複合体の構成因子の一つで 核と細胞質をシャトルする mrna のスプライシングや輸送 翻訳制御に関与する リン酸化による細胞質への集積が細胞の移動度や転移能に大きく寄与する 核と細胞質の間をシャトルし Fas や FGFR2 のオルタナティブスプライシングに関与する コールドショックタンパク質ファミリーに属する 細胞質 mrnp particle の主要な構成因子で 細胞死や腫瘍抑制因子関連の mrna を標的とする スプライシングへの関与の報告がある オルタナティブスプライシングに関与する pre-mrna の intronic cluster に結合することで スプライスサイトをネガティブに制御する (exon skipping) DNA/RNA 結合タンパク質 CD44 の exon v5 の inclusion に関与することでスプライシングを制御する HIV RNA の export にも関与する mrna の安定化や翻訳制御への関与も推測されている 有糸分裂の際にリン酸化され SH2 3 ドメインをもつタンパク質に結合する スプライスサイトの選択や exon inclusion を制御することにより オルタナティブスプライシングに寄与する RBP Antibody 4 コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN047PW anti-ptbp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl WB,IPP Hu 48,000 RN002MW anti-cugbp1 3B1 mo IgG1 κ 100 μl (CELF1) WB,IPP Hu,Mo,Rat 48,000 RN034PW anti-cugbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (CELF1) WB Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 RN035PW anti-cugbp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (CELF2) WB Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 RN042PW anti-mbnl1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl WB Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 RN043PW anti-nova1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl WB Hu 48,000 RN044PW anti-nova2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (ANOVA) WB,IPP Hu,Rat 48,000 RN046PW anti-syncrip Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (NSAP1, HNRPQ) WB,IPP Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 機能 局在など pre-mrna の intronic cluster に結合することでオルタナティブスプライシングに関与する 脳特異的な発現が認められている premrna に結合し スプライスサイトをネガティブに制御する オルタナティブスプライシングおよび mrna 分解制御に関与する DM1(I 型筋強直性ジストロフィー ) の発症への関与も報告されている オルタナティブスプライシングおよび mrna 分解制御に関与する DM1 では発現量や細胞内分布異常により様々な遺伝子のスプライシング異常が生じる 筋組織だけではなく ユビキタスに高発現している がん細胞においては Mcl-1 mrna の 3'-UTR に結合してアポトーシスを誘導することが報告されている DMPK mrna の 3'-UTR の CUG リピートの伸張と MBNL1 の結合状態の変化が DM1 の発症につながると考えられている ニューロン特異的スプライシングファクター 自己免疫疾患である POMA 患者血清から発見された pre-mrna の YCAY cluster に結合することでニューロン特異的オルタナティブスプライシングファクターとして機能する スプライソソームの構成因子で pre-mrna の効率的なスプライシングに関与する

5 輸送 核内で転写され 一連のプロセシング (5'- キャッピング スプライシング 3'- ポリアデニレーション ) を受けた TAP p15/nxt AAAA ARE (AU-rich element) を持つ mrna HuR AAAA mrna は TAP や RanGTP 及び様々な RBP を介して細胞質へと輸送されま 核内 EJC (Exon Junction Complex) Ran GTP TRN2 ARE 領域 す RNA の核から細胞質への輸送は厳 密に制御されており RBP はこの品質管理機構においても重要な役割を担っ 細胞質 ています AAAA AAAA RIP-Certified Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN001P anti-eif4e Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN004P anti-elavl1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuR) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN001M anti-igf2bp1 6H6 mo IgG2a κ 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN007P anti-igf2bp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN008P anti-igf2bp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP2) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN009P anti-igf2bp3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP3) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN045P anti-slbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HBP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN019P anti-hnrnpk Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPK) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN021P anti-khdrbs1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (p62, SAM68) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN016P anti-fmr1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (FMRP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN017P anti-fxr1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN018P anti-fxr2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN012P anti-stau1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN013P anti-stau2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN020P anti-ilf3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (NF90) WB,IPP,RIP Hu 60,000 機能 局在など翻訳開始因子の一つで mrna の m 7 G キャップ構造に結合する 抑制性タンパク質 4E-BP との結合により eif4g1 との結合が阻害される mrna の核から細胞質への輸送にも関与する 幅広い組織に存在し poly(a) と AU-rich element(are: mrna の不安定化配列 ) の両方に結合する 核と細胞質の間をシャトルし mrna の輸送に関与すると考えられている FMRP とともにβ - アクチンの mrna に結合して 核から細胞質への輸送を行う FMRP とともにβ - アクチンの mrna に結合して 核から細胞質への輸送を行う 発生や増殖に関連する IGF2 leader 3 mrna の UTR に結合し 翻訳を制御する 発生や増殖に関連する IGF2 leader 3 mrna の 5'-UTR に結合し 翻訳を制御する Histone pre-mrna の 3' 末端の stem-loop 構造に結合し プロセシングや 輸送 翻訳 分解に関与する 細胞周期の制御にも関与する hnrnp 複合体の構成因子の一つで 核と細胞質をシャトルする mrna のスプライシングや輸送 翻訳制御に関与する リン酸化による細胞質への集積が細胞の移動度や転移能に大きく寄与する DNA/RNA 結合タンパク質であり HIV RNA の export に関与する mrna の安定化や翻訳制御への関与も推測されている 神経の形態形成に必須であり poly(g) 配列に強く結合する Fragile X 症候群 ( 精神発達障害 ) の患者には FMR 遺伝子の中に CGG リピートの伸張が認められている FMR1 のパラログとして知られている 核と細胞質の間をシャトルし ポリソームの 60S サブユニットと結合することが報告されている AGO タンパク質との関連報告もある FMR1 FXR1 と機能的に類似したファミリータンパク質であり FXR1 と高い相同性を示す RNA 結合能やポリソーム結合能 核 - 細胞質間のシャトルなど ファミリー間で同様の機能を示す 神経細胞において RNA granule を構成する dsrna 及び微小管に結合し mrna の輸送や局在化に関与する NMD への関与や 40S 及び 60S ribosomal subunit との結合が報告されている STAU1 と高い相同性を示す 神経細胞において STAU1 と共局在しないことから 異なる RNA granule の構成に関与すると考えられている 核と細胞質の間をシャトルするが 詳細な機能は不明 dsrna に結合する IL-2 mrna の 3'-UTR の AU-rich element (ARE) に結合し mrna を安定化する mrna の核から細胞質への輸送にも関与する 交差反応種 : Hu: Human, Mo: Mouse, Rat: Rat, Hm: Hamster 使用法 : WB: Western blotting, IPP: Immunoprecipitation, RIP: RIP-assay 5

6 安定化 分解制御 elfs HuR PTBP1 CDS TIA1 ARE TTP PABP 5-UTR 3-UTR AU-rich element (ARE) は おもに mrna の 3'-UTR に存在するアデニン (A) とウラシル (U) に富んだ領域です endonuclease 活性を有する RBP がこの領域に結合することで mrna の分解が開始されます 癌遺伝子やサイトカインなど 外部刺激に対する応答因子 いわゆる early response gene の mrna の半減期が短いのは これらの mrna に ARE が多く存在していることに起因します HuR など ある種の RBP は ARE に結合し endonuclease のアクセスを阻害することで標的 mrna の安定性を制御しています この他にも mrna の安定化 分解にかかわる cis-element は複数知られており 様々な機能をもつ RBP がこれらの領域に結合することで mrna の品質管理が行われています RIP-Certified Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN033P anti-tnrc6a Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (GW182, GW1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN001P anti-eif4e Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN004P anti-elavl1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuR) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN005P anti-elavl2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuB) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN006P anti-elavl3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuC) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN045P anti-slbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HBP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN011P anti-ptbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (hnrnpⅠ) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN021P anti-khdrbs1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (p62, SAM68) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN022P anti-pabpc4 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (PABP4, ipabp) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN024P anti-pcbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPE1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN025P anti-pcbp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPE2) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 機能 局在など RISC 構成因子に結合し翻訳抑制に関与する P-body/GW-body の構成要素とも報告されている RNA recognition motif (RRM) 及び複数の AGO binding domain を有し gene silencing に寄与する 翻訳開始因子の一つで mrna の m 7 G キャップ構造に結合する 抑制性タンパク質 4E-BP との結合により eif4g1 との結合が阻害される mrna の核から細胞質への輸送にも関与する 幅広い組織に存在し poly(a) と AU-rich element (ARE: mrna の不安定化配列 ) の両方に結合する 核と細胞質の間をシャトルし mrna の輸送に関与すると考えられている Hu ファミリータンパク質 (HuR, HuB, HuC, HuD) の一員で 神経特異的な発現が報告されている 核と細胞質の間をシャトルし ARE への結合を介して mrna を安定化させ 翻訳効率を制御する Hu ファミリータンパク質 (HuR, HuB, HuC, HuD) の一員で 神経特異的な発現が報告されている 核と細胞質の間をシャトルし ARE への結合を介して mrna を安定化させ 翻訳効率を制御する Histone pre-mrna の 3' 末端の stem-loop 構造に結合し プロセシングや 輸送 翻訳 分解に関与する 細胞周期の制御にも関与する CD40LG などの mrna の安定化に関与する 最近の知見では 他のスプライシングリプレッサーと競合することにより exon inclusion に関与することも報告されている DNA/RNA 結合タンパク質 CD44 の exon v5 の inclusion に関与することでスプライシングを制御する HIV RNA の export にも関与する mrna の安定化や翻訳制御への関与も推測されている PABPC1 と 79% の相同性を示し mrna の安定化 翻訳制御に関与する T cell の活性化によって mrna 量が約 5 倍になる Poly(A) への結合を介して mrna の安定化に関与する Poly(rC) および poly ピリミジンに結合し 種々の mrna を安定化させる (α - グロビン I 型コラーゲン mrna など ) 核と細胞質の間をシャトルする主要な PCBP アイソフォームの一つである PCBP1 および hnrpk と同様に poly(rc) に結合する Poly(rU) への結合も報告されている Stress granule や P-body への局在も認められている 6

7 コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN026P anti-pum1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN027P anti-pum2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN037P anti-auh Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN020P anti-ilf3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (NF90) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN032P anti-cirbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (CIRP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN003M anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 200 μl (AGO2) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN028P anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (AGO1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 機能 局在など発生を制御する PUF ファミリーに属し RNA binding domain として Pumilio homology domain を有する ターゲット mrna の 3'-UTR へ結合し 翻訳抑制や分解促進に関与する 発生を制御する PUF ファミリーに属し 様々な組織において PUM1 との共局在が認められ 重複した機能を有すると考えられる 生殖細胞分化への関与が報告されている Early response gene (IL-3 GM-CSF c-fos c-myc など ) の mrna の AU-rich element (ARE) に結合し 安定性を制御する dsrna に結合する IL-2 mrna の 3'-UTR の ARE に結合し mrna を安定化する GBA(acid beta-glucosidase)mrna の coding sequence(cds) に結合し ポリソームの働きを阻害する Cold stress 誘導性の細胞増殖抑制に関与する マイルドな cold stress 条件下においては翻訳を促進し translational activator として機能する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合 し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RBP Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN028PW anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO1) WB,IPP Hu,Mo 48,000 RN003MW anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 100 μl (AGO2) WB,IPP Hu 48,000 RN029PW anti-eif2c2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO2) WB Hu,Mo,Rat 48,000 RN030PW anti-dicer1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (DCR1) WB,IPP Hu 48,000 RN002MW anti-cugbp1 3B1 mo IgG1 κ 100 μl (CELF1) WB,IPP Hu,Mo,Rat 48,000 RN034PW anti-cugbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (CELF1) WB Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 RN035PW anti-cugbp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (CELF2) WB Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 RN023PW anti-pabpn1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (PABP2) WB,IPP Hu,Mo 48,000 RN031PW anti-zfp36 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (TTP) WB Hu 48,000 RN036PW anti-aco1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (IRP1, IREB1) WB,IPP Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 機能 局在など RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている dsrna や pre-mirna を切断し sirna duplex 及び mirna duplex へと変換する RNase の一種 切断により生じた 2 本鎖 small RNA を RISC へ loading する役割も果たしている DM1 の発症への関与が報告されている c-jun TNFRSF1B などの GU-rich element を持つ遺伝子に結合して mrna の分解に関与する DM1 の発症への関与が報告されている c-jun TNFRSF1B などの GU-rich element を持つ遺伝子に結合して mrna の分解に関与する 筋組織だけではなく ユビキタスに高発現している COX2 mrna の 3'-UTR への結合を介した安定化に寄与する 癌細胞においては Mcl-1 m RNA の 3'-UTR に結合してアポトーシスを誘導する 核に局在する PABP であり 転写後の初期 mrna の poly(a) に強く結合する Poly(A) tail の polyadenylation に必須で poly(a) の長さの制御を介して mrna の成熟に関与する Zinc finger 構造を有し mrna の ARE に結合する ARE への結合を介して deadenylase complex をリクルートし poly(a) tail の deadenylation を誘導する 鉄イオン濃度が低い場合 フェリチン mrna の 5'-UTR へ結合し 翻訳を阻害する また トランスフェリンレセプター mrna の 3'-UTR に結合し mrna を安定化することも報告されている 交差反応種 : Hu: Human, Mo: Mouse, Rat: Rat, Hm: Hamster 使用法 : WB: Western blotting, IPP: Immunoprecipitation, RIP: RIP-assay 7

8 翻訳制御 mrnaは より効率的かつ安定的な翻訳を行うために closed-loop 構造を形成します 基本的には キャップ結合タンパク質 eif4e 及び poly(a) binding protein (PABP) が scaffold protein である eif4g を介してループを形成し その安定化に Hu タンパク質などが関連しているといわれています RIP-Certified Antibody mrna の closed-loop 構造 AAAAAA PABP eif4g1 eif4e eif3 40S eif4a 60S P-body コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN033P anti-tnrc6a Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (GW182, GW1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN001P anti-eif4e Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN002P anti-eif4g1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN003P anti-eif4g2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN038P anti-cpeb1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN004P anti-elavl1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuR) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN005P anti-elavl2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuB) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN006P anti-elavl3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HuC) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN010P anti-msi1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (Musashi1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN001M anti-igf2bp1 6H6 mo IgG2a κ 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN007P anti-igf2bp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN008P anti-igf2bp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP2) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN009P anti-igf2bp3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP3) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN045P anti-slbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HBP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN019P anti-hnrnpk Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPK) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN014P anti-tia1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 RN015P anti-ybx1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat,Hm 60,000 機能 局在など RISC 構成因子に結合し翻訳抑制に関与する P-body/GW-body の構成要素との報告もある RNA recognition motif (RRM) 及び複数の AGO binding domain を有し gene silencing に寄与する 翻訳開始因子の一つで キャップ結合タンパク質 抑制性タンパク質 4E-BP との結合により eif4g1 との結合が阻害される Ser209 のリン酸化により 5'-cap への親和性が高まるという報告もある Cap-dependent な翻訳開始に必要とされる様々な因子をつなぎとめ initiation complex の足場を形成する (scaffold protein) eif4g1 の C 末端に相同性を示し eif4a 及び eif3 と inactive complex を形成することにより翻訳抑制因子として機能する CPE への結合後 Maskin 様タンパク質を介して mrna の翻訳を抑制する Aurora キナーゼなどによってリン酸化されると poly(a) の伸張に関連する CPSF と相互作用し mrna の翻訳が促進される 幅広い組織に存在し poly(a) と AU-rich element (ARE: mrna の不安定化配列 ) の両方に結合する ARE に結合することで mrna を安定化する Hu ファミリータンパク質 (HuR, HuB, HuC, HuD) の一員で 神経特異的な発現の報告がある 核と細胞質の間をシャトルし ARE への結合を介して mrna を安定化させ 翻訳効率を制御している Hu ファミリータンパク質の一員で 神経発生への関与が示唆されている 核と細胞質の間をシャトルし ARE への結合を介して mrna を安定化させ 翻訳効率を制御している Numb mrna の 3'-UTR への結合による翻訳抑制を介して 神経幹細胞の分化を制御している 核内でβ - アクチンの mrna に結合し その翻訳開始を阻害するが 細胞質の目的地にてリン酸化されると mrna から遊離し β - アクチン mrna の翻訳が開始される β - アクチンの mrna に結合し 翻訳を制御する 発生や増殖に関与する因子である IGF2 の mrna の UTR に結合し 翻訳を阻害する Large RNP granule への局在も報告されている 発生や増殖に関与する因子である IGF2 leader 3 mrna の UTR に結合し 翻訳を制御する 発生や増殖に関与する因子である IGF2 leader 3 mrna の 5'-UTR に結合し 翻訳を制御する Histone pre-mrna の 3' 末端の stem-loop 構造に結合し プロセシングや 輸送 翻訳 分解に関与する 細胞周期の制御にも関与する hnrnp 複合体の構成因子の一つで 核と細胞質の間をシャトルする mrna のスプライシングや輸送 翻訳制御に関与する リン酸化による細胞質への集積が細胞の移動度や転移能に大きく寄与する 核と細胞質の間をシャトルする 免疫系の細胞におけるアポトーシス誘導や TNF-αや COX-2 mrna の翻訳制御などに関与する コールドショックタンパク質ファミリーに属する 細胞死や腫瘍抑制因子関連の mrna をターゲットとする DNA/RNA 双方に結合し 転写 / 翻訳レベルでの遺伝子発現制御に関与する 8

9 コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN021P anti-khdrbs1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (p62, SAM68) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN016P anti-fmr1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (FMRP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN017P anti-fxr1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN018P anti-fxr2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN024P anti-pcbp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPE1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN025P anti-pcbp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (HNRPE2) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN026P anti-pum1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN027P anti-pum2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN020P anti-ilf3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (NF90) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN032P anti-cirbp Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (CIRP) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN003M anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 200 μl (AGO2) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN028P anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (AGO1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 機能 局在など DNA/RNA 結合タンパク質であり HIV RNA の export に関与する mrna の安定化や翻訳制御への関与も推測されている ポリソームに結合する mrnp の構成因子であり 翻訳の際にネガティブレギュレーターとして機能する mirna 経路への関与も報告されている Poly(G) 配列に強く結合する FMR1 のパラログとして知られている 核と細胞質の間をシャトルし ポリソームの 60S サブユニットと結合することが報告されている AGO タンパク質との関連報告もある FMR1 FXR1 と機能的に類似したファミリータンパク質であり FXR1 と高い相同性を示す RNA 結合能やポリソーム結合能 核 - 細胞質間のシャトルなど ファミリー間で同様の機能を示す 核と細胞質の間をシャトルする主要な PCBP アイソフォームの一つである ポリオウイルスの IRES の stem-loop 構造に結合し translational coactivator として機能する PCBP1 および hnrpk と同様に poly(rc) に結合する Poly(rU) への結合も報告されている ポリオウイルスの IRES の stem-loop 構造に結合し translational activator として機能する 発生を制御する PUF ファミリーに属し RNA binding domain として Pumilio homology domain を有する ターゲット mrna の 3'-UTR へ結合し 翻訳抑制や分解促進に関与する 発生を制御する PUF ファミリーに属する 様々な組織において PUM1 との共局在が認められ 重複した機能を有すると考えられる 生殖細胞分化への関与が報告されている dsrna に結合する IL-2 mrna の 3'-UTR の ARE に結合し mrna を安定化する GBA(acid beta-glucosidase)mrna の coding sequence(cds) に結合し ポリソームの働きを阻害する 高塩濃度条件下においても poly(u) 配列に強く結合する Cold stress 誘導性の細胞増殖抑制に関与する マイルドな cold stress 条件下においては翻訳を促進し 翻訳活性化因子として機能する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RBP Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN028PW anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO1) WB,IPP Hu,Mo 48,000 RN003MW anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 100 μl (AGO2) WB,IPP Hu 48,000 RN029PW anti-eif2c2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO2) WB Hu,Mo,Rat 48,000 RN030PW anti-dicer1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (DCR1) WB,IPP Hu 48,000 RN039PW anti-cpeb2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl WB,IPP Hu,Rat 48,000 RN040PW anti-cpeb4 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl WB,IPP Hu 48,000 RN036PW anti-aco1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (IRP1, IREB1) WB,IPP Hu,Mo,Rat,Hm 48,000 機能 局在など RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合 し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている dsrna や pre-mirna を切断し sirna duplex 及び mirna duplex へと変換する RNase の一種 切断により生じた 2 本鎖 small RNA を RISC へ loading する役割も果たしている CPE に結合して mrna の polyadenylation や翻訳を制御する 低酸素刺激にて誘導される HIF-1α mrna に結合する CPEB1 と共に細胞周期の進行や mrna の polyadenylation 翻訳制御を行うことが報告されている 鉄イオン濃度が低い場合 フェリチン mrna の 5'-UTR へ結合し 翻訳を阻害する また トランスフェリンレセプター mrna の 3'-UTR に結合し mrna を安定化することも報告されている 交差反応種 : Hu: Human, Mo: Mouse, Rat: Rat, Hm: Hamster 使用法 : WB: Western blotting, IPP: Immunoprecipitation, RIP: RIP-assay 9

10 局在化 DNA mrna AAAAA 40S AAAAA RBP 60S RBP RBP MP AAAAA MP AAAAA AAAAA 細胞骨格 核から細胞質へと輸送された RNA は 局在化を司る RBP や細胞骨格に結合するモータータンパク質およびアダプタータンパク質を介して末梢へと運ばれ 翻訳されます また RBP による結合は RNA が必要とされる場所に局在化されるまでの間 分解因子の攻撃から RNA を保護する役割も担っています RBP は 必要な時 に 必要な場所 で RNA が効率よく翻訳されるように時空間的な制御を行うことが明らかとなっています RIP-Certified Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN001M anti-igf2bp1 6H6 mo IgG2a κ 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN007P anti-igf2bp1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP1, ZBP1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN008P anti-igf2bp2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP2) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN009P anti-igf2bp3 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (IMP3) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 RN012P anti-stau1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN013P anti-stau2 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl WB,IPP,RIP Hu 60,000 機能 局在など核内でβ - アクチンの mrna に結合し その翻訳開始を阻害するが 細胞質の目的地にてリン酸化されると mrna から遊離し β - アクチン mrna の翻訳が開始される β - アクチンの mrna に結合し 翻訳を制御する 発生や増殖に関与する因子である IGF2 の mrna の UTR に結合し 翻訳を阻害する Large RNP granule への局在も報告されている 発生や増殖に関与する因子である IGF2 leader 3 mrna の UTR に結合し 翻訳を制御する 発生や増殖に関与する因子である IGF2 leader 3 mrna の 5'-UTR に結合し 翻訳を制御する 神経細胞において RNA granule を構成する dsrna 及び微小管に結合し mrna の輸送や局在化に関与する NMD への関与や 40S 及び 60S ribosomal subunit との結合が報告されている STAU1 と高い相同性を示す 神経細胞において STAU1 と共局在しないことから 異なる RNA granule の構成に関与すると考えられている 核と細胞質の間をシャトルするが 詳細な機能は不明 10

11 RNAi pathway (mirna/sirna/pirna) A-RISC eadenylation AAAAAAAA 12 A Slicer actiity eif4g1 eif4e Target mrna Suppression 真核生物において RNAi(RNA interference) は配列特異的な遺伝子サイレンシング機構として重要な役割を担っています RNAi や関連する遺伝子サイレンシング経路においては RISC(RNA-induced silencing complex) に取り込まれてガイド分子として機能する small ncrna の存在が重要であり microrna(mirna) short interfering RNA(siRNA) PIWI-interacting RNA(piRNA) の 3 種類に大別されます これらの small ncrna は 自分自身の塩基配列と対合できる標的配列をもつ様々な遺伝子の翻訳を抑制する働きがあり 生物の発生のタイミングや形態形成 細胞増殖や癌化など 非常に重要な生物学的機能を緻密に制御していることが知られています small ncrna はそれ単独で働くわけではなく RISC の中心的タンパク質である Argonaute ファミリータンパク質 (AGO) に取り込まれて初めて機能を発揮します RISC 中の small ncrna が標的 mrna を認識するガイドとして機能し AGO や GW182 からなる RISC 構成因子が作用することにより 標的 mrna の翻訳抑制や分解などが生じます 近年では このような small ncrna を介した転写後遺伝子発現制御に対する関心が非常に高まっています RIP-Certified Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN003M anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 200 μl (AGO2) WB,IPP,RIP Hu 60,000 RN033P anti-tnrc6a Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (GW182, GW1) WB,IPP,RIP Hu,Mo,Rat 60,000 RN028P anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 200 μl (AGO1) WB,IPP,RIP Hu,Mo 60,000 機能 局在など RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RISC 構成因子に結合し翻訳抑制に関与する P-body/GW-body の構成要素との報告もある RNA recognition motif (RRM) 及び複数の AGO binding domain を有し gene silencing に寄与する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合 し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RBP Antibody コード No. 製品名 クローン アイソタイプ 容量 RN028PW anti-eif2c1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO1) WB,IPP Hu,Mo 48,000 RN003MW anti-eif2c2 1B1-E2H5 mo IgG2a λ 100 μl (AGO2) WB,IPP Hu 48,000 RN029PW anti-eif2c2 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (AGO2) WB Hu,Mo,Rat 48,000 RN030PW anti-dicer1 Polyclonal rab Ig (aff.) 100 μl (DCR1) WB,IPP Hu 48,000 機能 局在など RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質 mirna/sirna と結合し mrna の翻訳を抑制する RISC を構成する RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている RNAi 経路で中心的な役割を担うタンパク質であり RISC (RNAinduced silencing complex) の主要構成因子 RNA 分解の場である P-body への局在が認められている dsrna や pre-mirna を切断し sirna duplex 及び mirna duplex へと変換する RNase の一種 切断により生じた 2 本鎖 small RNA を RISC へ loading する役割も果たしている 交差反応種 : Hu: Human, Mo: Mouse, Rat: Rat, Hm: Hamster 使用法 : WB: Western blotting, IPP: Immunoprecipitation, RIP: RIP-assay 11

12 X X RiboCluster Profiler TM RiboCluster Profiler TM の製品群は どの分野で研究している方でもスムーズに RNA 研究分野に入っていただけるように設計されています 特定の疾患や組織に興味がある場合 まず RiboChip によって疾患 組織特異的 RBP を見つけます 次に 標的 RBP に対する抗体で RBP と RNA の複合体 (RNP) を免疫沈降 (RIP) し 結合していた RNA を抽出します MBL では RBP に結合している RNA を網羅的に解析するキット :RIP-Assay Kit (RN1001) RIP-Assay Kit for microrna (RN1005) と RIP-Assay に使えることが実証された RBP に対する抗体 :RIP-Certified Antibody を各種取り揃えております RIP-Assay で回収した RNA をマイクロアレイ (RIP-Chip) や高速シーケンサー (RIP-Seq) などの解析に供することで 従来の遺伝子発現解析では困難であったターゲットの絞込みが可能になります また ある特定の遺伝子に興味があり その RNA の制御機構に関連するタンパク質を同定したい場合 RiboTrap によってその RNA に結合する RBP を同定することが可能で MBL の RiboTrap Kit (RN1011/RN1012) をご利用いただけます RiboTrap により特定の RNA の制御に関わる RBP を同定した後で その分子に対する抗体を用いて RIP-Chip や RIP-Seq を行うことにより 機能的に関連性のある RNP 複合体 (RiboCluster) の全貌を知ることが可能となります 上記以外にも他の RIP-Certified Antibody や RIP 関連製品を順次開発 発売しています 最新の RIP 関連製品リストを Web ページ ( に公開していますので ご利用ください RiboChip る RBP Lung Brain Heart Breast Adipose Liver Muscle Colon Testicular and Ovarian 5 RNA と結合しているタンパク質を 動して分離し 質量分析によって同定します Bone in vitro transcription により 興味ある RNA を BrU で標識します その RNA に結合する RNP 複合体を抗 BrdU 抗体結合ビーズを使って精製します 質量分析 によるタンパク質同定 X 1 RNA 結合タンパク質 (RBP-X) に対する特異的抗体を選択します RiboChip を使って興味ある組織 細胞や疾患で発現している RBP を調べ 組織 細胞あるいは疾患特異的な RBP を見つけた後 Cycle に入ります RNA 結合タンパク質 X BrU 標識 RNA X Ribonomic Discovery Cycle 2 RNA 結合タンパク質 (RBP-X) に対する抗体を用いて 結合している特定の RNA サブセット (mrna/mirna) を免疫沈降します 興味ある RNA X Sequencing RiboTrap が る 子が の RNA の機能制御 る ン 質 因子 定 RiboTrap Kit Microarray mrna/mirna の同定 RT-PCR る RBP が の RBP 制御 る RNA (mrna/mirna) 定 RIP-Chip 特定の RBP(RBP-X) に結合している RNA サブセットを免疫沈降物から単離し マイクロアレイや RT-PCR またはシークエンシングなどの方法で同定します Reference Dale L. Beach and Jack D. Keene, Methods Mol. Biol., 419: (2008) RIP-Assay Kit RIP-Assay Kit for microrna RIP-Certified Antibody 12

13 RIP-Chip 解析例 Rapamycin 処理による eif4e と mrna の結合状態変化の解析 Moc Rapamycin 4E-BP eif3 40S eif3 eif4g1 eif4a eif4e eif4g1 40S eif4a 翻訳 PABP AAAAAA eif4e 4E-BP 翻訳 PABP AAAAAA RIP-Chip 解析は 細胞内の mrna 量を測定する従来の発現解析手法とは大きく異なり 特定の機能を有する RBP と RNA の結合状態を比較解析する手法です 例えば RIP-Chip 解析に使用する RBP を mrna の 5'-cap 結合タンパク質である eif4e とした場合 薬剤処理により eif4e との結合状態が変化する mrna ポピュレーションを検出することが可能となります eif4e は mrna の 5'- cap からの翻訳工程においてリボソームなどの翻訳装置を呼び込む重要な役割を担っているため eif4e と mrna の 5'-cap の結合状態の変化は mrna の翻訳効率に反映されます この eif4e と mrna の 5'-cap の結合状態を変化させる薬剤として知られているのが Rapamycin ( 一般名 :Sirolimus) であり 免疫抑制剤 / 抗癌剤として臨床の場で使用されています 解析結果 Total RNA () I RIP-Chip 解析 Gene 5 mrna 発現量 (Rapamycin 加, Log 2 ) Gene 4 Gene 12G Gene 4 Gene 5 Gene 12I mrna 発現量 (Rapamycin 加, Log 2 ) Gene 5 Gene 12G Gene 12I Gene 5 Gene 4 Gene 4 Family Genes mrna 発現量 (Mock, Log 2 ) mrna 発現量 (Mock, Log 2 ) mrna の 化 mrna の 化 (cap 化 ) で Rapamycin の Rapamycin 翻訳が 制 ン 質 化が ると る の で 出 解析 る が 能 緑の点で示した遺伝子群は Rapamycin 処理により mrna の発現量自体に変化は生じませんが elf4e と mrna の 5'-cap 結合効率が低下しています すなわち 薬剤処理によりこれらの mrna の翻訳効率が低下していることを意味し 転写レベルではなく翻訳制御レベルでタンパク質の発現量が調節されている可能性を示唆しています また RBP は機能的に関連性のある遺伝子群を cluster を介して制御していると考えられていますが その考えを裏付けるように一連のファミリー遺伝子が同様の発現プロファイルを示しました 13

14 RIP-Assay Kit RIP-Assay 用に最適化されたバッファーセットです フェノールを使わない 独自の高収率な RNA 抽出試薬を採用しておりますので 廃棄物に困りません RIP-Assay 後の各種アプリケーションに適した 高収率 高品質の RNA 回収が可能です MBL では RBP に対する抗体で RBP と mrna の複合体 (mrnp) を免疫沈降 (RIP) し RBP に結合する mrna を網羅的に解析するキット :RIP-Assay Kit と RIP-Assay で使えることが実証された 様々な RBP に対する抗体 :RIP-Certified Antibody の開発 販売を行っております RIP-Assay Kit で分離された mrna を マイクロアレイ (RIP-Chip) や高速シーケンサー (RIP-Seq) などの解析に供することで Cell Lysis RIP-Assay 原理 細胞中 mrna と RBP 従来の遺伝子発現解析では困難であったターゲットの絞込みが可能になります 免疫沈降 RIP-Certified Antibody RIP-Chip 法は これまでに広く使われている ChIP-Chip 法と似た原理で RBP に特異的な抗体 プロテイン A/G アガロースビーズ RBP に対する抗体 によって細胞抽出物からリボヌクレオタンパク質 (Ribonucleoprotein;RNP) を免疫沈降します 続いて RNP から精製した mrna をマイクロアレイで発現解析します マイクロアレイは既知のシークエンス由来のプローブと mrna サンプルをハイブリダイズさせることによって mrna のシークエンスを同定しますが 直接シークエンスすることによっても (RIP-Seq 法 ) RBP のターゲットとなっている mrna を同定することができます RIP-Chip 法および RIP-Seq 法は 治療医薬のターゲットになり得るような新しい分子を見つけ出したり 医薬品が細胞に与える影響を調べるために使われています に結合する mrna の分離 mrna の抽出解析 沈降分画 マイクロアレイ RT-PCR シークエンシング データ解析例 細胞 : 細胞数 : 抗体 : 抗体使用量 : Jurkat cells/sample Normal Rabbit IgG Anti-PTBP1 pab (Code No. RN011P) 15 μg 1 免疫沈降 の RNP がると B で 2 分 RNA (Nanorop) Average quantity of isolated RNA (n=2) (kda) Lane 1: Input sample (Precleared cell lysate) Lane 2: post-ip beads of Normal Rabbit IgG Lane 3: post-ip beads of Anti-PTBP1 pab PTBP1 IB: Anti-PTBP1 polyclonal antibody (Code No. RN011P) Isolated RNA(ng) Antibody RNA (ng) Normal Rabbit IgG 51 Anti-PTBP1 pab 678 Total RNA Normal Rabbit IgG Anti-PTBP1 pab 14

15 [nt] S RNA intensity Nucleotide length Normal Rabbit IgG Anti-PTBP1 Total RNA S Lane 1: Ladder Lane 2: Normal Rabbit IgG Lane 3: Anti-PTBP1 pab Lane 4: Total RNA Jurkat 細胞内で PTBP1 に結合している RNA を RIP-Assay Kit で分離した後 遺伝子特異的プラ Material source: RIP sample QC sample (Input) イマーを使って RT-PCR で同定しました コント CD40LG (CD154) Lane 1: Normal Rabbit IgG Lane 2: Anti-PTBP1 pab Lane 3: Total RNA ロールの Normal Rabbit IgG では検出されなかったのに対し anti-ptbp1 pab で免疫沈降したサンプルでは CD40LG が有意に検出されました CD40LG は 文献ですでに PTBP1 のターゲッ ト RNA であることが知られています このことか ら RIP-Assay Kit は RNP 複合体中のターゲット mrna のプロファイリングに有用であることが示 されました キット構成品 試薬 Lysis Buffer Wash Buffer Normal Rabbit IgG High-Salt Solution RNA 抽出試薬 Solution I RNA 抽出試薬 Solution II RNA 抽出試薬 Solution III RNA 抽出試薬 Solution IV 容量 26 ml 35 ml 2 bottles 200 μl 6 ml 260 μl 10 ml 7 ml 55 μl キットに含まれない必要試薬 Protease inhibitor RNase inhibitor Protein A or Protein G Agarose beads DTT コード No. 製品名包装希望購入価格 RN1001 RIP-Assay Kit 10 assays 40,000 15

16 RIP-Assay Kit for microrna RIP サンプルから mirna/mrna を同時に回収可能です また 別々に分離回収する事もできます RISC コンポーネントの抗体や それ以外の RBP 抗体でも mirna/mrna の回収を行う事ができます 独自の高収率な RNA 抽出試薬を採用しており mirna/mrna を要する各種アプリケーションに最適です RIP-Assay Kit for microrna は RIP-Assay により機能的に関連する mrna 及び mirna を回収するために最適化されたキットです 本キットでは 実験デザインに合わせて RNA 抽出方法を選択可能です small RNA を迅速に回収 (1-step method) small RNA large RNA を同時に回収 (2-step method) small RNA large RNA を分離回収 (Separation method) どの抽出方法でも フェノールを用いる従来法よりも高効率に mirna を回収することができます 本キットは 特定の疾患や機能に関連する mirna の同定や mirna とターゲット mrna のマッチング解析に有用です RiboCluster RISC 構成因子での RIP R RISC 構成因子以外での RIP RISC RISC RNA 抽出ステップ 特定のクラスターに分類される mrna mirna 群を特異的に回収 1-step method 2-step method Separation method 同定 マイクロアレイ RT-PCR シークエンシング S S L S L 主に small RNA を迅速に回収 small RNA と large RNA を同時回収 small RNA と large RNA を分離回収 mrna-mirna のマッチング * 他 2 法に比較すると large RNA の回収率は低いですが ないステップでアッセイが します データ解析例 1 RISC 構成因子での RIP RISC の中心的役割を担う AGO2 に対する抗体を使って RIP-Assay を行いました 細胞 : 細胞数 : 抗体 : 抗体使用量 : RNA 抽出法 : Jurkat cells/sample Mouse IgG2a λ (Code No. M076-3) Anti-AGO2 mab (Code No. RN003M) 15 μg Separation method 16

17 (kda) EIF2C2/AGO2 Lane 1: Input sample (Jurkat cell lysate) Lane 2: post-ip beads of Mouse IgG2a Lane 3: post-ip beads of Anti-ElF2C2/AGO2 mab 50 Heavy chain IB: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M) 37 Light chain 18S rrna 28S rrna RNA intensity Mouse IgG2a EIF2C2/AGO2 Total RNA Nucleotide length RIP sample Mouse IgG2a Anti-AGO2 Total RNA 1 2 Lane 1: Mouse IgG2a Lane 2: Anti-ElF2C2/AGO2 mab c-myc (nt) EIF5 IRF2BP small RNA 画分 Artificial error Similar to mirna Sequencing error mirna: coverage90%, identity90% Similar to mirna: coverage80%, identity80% Artificial error: PCRのクローニング過程に起因すると考えられるエラー Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー RIP-Assay Kit for microrna を用いて分離した large RNA 画分には c-myc EIF5 IRF2BP2 などの mrna が濃縮されていることを確認しました また small RNA 画分のシークエンス解析を行い 多くが mirna である事を確認しました ( 解析 :96 クローン ) 17

18 データ解析例 2 RISC 構成因子での RIP RISC 構成因子以外での RIP RISC 構成因子ではない IGF2BP1/IMP1 と RISC 構成因子である TNRC6A/GW182 に対する抗体を使用して RIP-Assay を行いました 細胞 : K562 細胞数 : cells/sample 抗体 : Mouse IgG2a λ (Code No. M076-3) Anti-AGO2 mab (Code No. RN003M) Normal Rabbit IgG Anti-IGF2BP1/IMP1 pab (Code No. RN007P) Anti-TNRC6A/GW182 pab (Code No. RN033P) 抗体使用量 : Mouse IgG2a λと Anti-AGO2 は 15 μg その他 25 μg RNA 抽出法 : Separation method 1 分 lare RNA 画分 イ ライ 解析 RNA intensity Normal Rabbit IgG IGF2BP1/IMP1 Nucleotide length TNRC6A/GW182 18S rrna 28S rrna Total RNA 2 分 small RNA 画分 で 製 small RNA シ ンス解析 Sequencing error Artificial error Non-Identification Artificial error Sequencing error (nt) mirna (0) mirna (5) small RNA 画分 Non-Identification I2BP1/IMP1 TNRCA/12 Lane 1: Mouse IgG2a Lane 2: Anti-EIF2C2/AGO2 mab Lane 3: Normal Rabbit IgG Lane 4: Anti-IGF2BP1/IMP1 pab Lane 5: Anti-TNRC6A/GW182 pab mirna: (coverage90%, identity90%) Non-Identification: 同定できなかった配列 ( 新 mirnaの可能性を含む ) Artificial error: PCRのクローニング過程に起因すると考えられるエラー Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー RISC 構成因子ではない IGF2BP1/IMP1 の RIP サンプルからも多くの mirna が同定されました ( 解析 : 各 48 クローン ) キット構成品 試薬免疫沈降試薬 mi-lysis Buffer mi-wash Buffer Normal Rabbit IgG High-Salt Solution 容量 26 ml 1 bottle 35 ml 2 bottles 0.33 ml 1 vial 6 ml 1 vial RNA 抽出試薬 mi-solution I 0.26 ml 1 vial mi-solution II 6 ml 1 vial mi-solution III 4 ml 1 vial mi-solution IV 0.2 ml 1 vial small RNA 画分調製試薬 Gel Extraction Buffer 25 ml 1 vial 3 M NaOAc 1 ml 1 vial mispike TM 100 pmoles 1 vial コード No. 製品名包装希望購入価格 RN1005 RIP-Assay Kit 10 assays 60,000 for micro RNA 18

19 RiboTrap Kit RNA を bait にして目的の RNA に特異的な RiboCluster を回収するキットです RNA の標識に BrUTP を採用し 抗 BrdU 抗体の BrU/BrdU 交差反応性を利用して RNA に結合する RNP を回収します 酸などの変性剤を使用しない溶出法で RNP を回収するため 様々な実験に応用可能です 核画分と細胞質画分を分けて調製するため 両画分の RNP 構成因子を解析可能です RiboTrap は ある特定の遺伝子に興味がある場合 その RNA の転写後制御に関連するタンパク質を同定す RiboTrap Kit 原理 る技術です T7 プロモーターを付加した cdna をテンプレートとして 5-Bromo-UTP (BrUTP) がランダムに取り込 in vitro transcription Cell Lysate まれるように in vitro transcription 反応を行うことで BrU 標識 RNA を合成します BrU-RNA に抗 BrdU 抗体結合ビーズを反応させた後に 細胞抽出液を加えて BrU-RNA-RBP 複合体を形成させ BrdU による競合溶出により回収します この RNP 複合体を SDS-PAGE で分離 展開後 LC-MS/ MS による分析を行うことにより BrU 標識 RNA に特異的に結合する RBP を同定します 本キットでは RNP 複合体の精製過程に最適化された洗浄バッファーを 3 種類準備しております Wash Buffer I : mild な洗浄 ( 基本組成 ) Wash Buffer II : stringent な洗浄 ( イオン強度を改変 ) Wash Buffer III : stringent な洗浄 ( 強力な界面活性剤を使用 ) 実験デザインにあわせて洗浄条件を選択することができます 本キットは RNA のスプランシング 核外輸送 細胞質内局在 安定性及び翻訳といった転写後の遺伝子発現や small RNA の生合成 non-coding RNA 研究など 様々な研究にお使いただけます 抗 BrdU 抗体 BrU 標識 mrna 洗浄 / 溶出 核画分 or 細胞質画分 BrU-RNA-RBP 複合体の形成 BrU-RNA-RBP 複合体の回収 SDS-PAGE Number of Hits RBP- LC-MS/MS による分析 洗浄 Buffer 比較 Probability Based Mowse Score ash Buer ash Buer ash Buer Basic buer イ ン い 強い い 界 い い 強い 洗浄 い 強い 強い の ン 質の溶出 の ン 質の溶出 グランド 中程度 低い 低い 19

20 データ解析例 細胞 : 細胞数 : Cell lysate: Bait RNA: Wash 条件 : HEK293T cells 細胞質画分 p21 coding sequence (0.5 kb) p21 3'-UTR (1.5 kb) Wash Buffer Ⅰ 1 溶出 RNP SS-PA と CBB RiboTrap kda IGF2BP1/IMP1 PCBP2 ELAVL1/HuR Lane 1: Input (Cytoplasmic extract) Lane 2: Beads alone Lane 3: p21 coding sequence Lane 4: p UTR 2 C-MS/MS 定 RBP の estern Blot で IGF2BP1/IMP1 (Code No. RN007P) PCBP2 (Code No. RN025P) ELAVL1/HuR (Code No. RN004P) HEK293T 細胞の細胞質画分と BrU 標識した p21 mrna の 3'-UTR を用いて得られた1-3 のバンドを LC-MS/MS にて解析した結果 IGF2BP1/IMP1 PCBP2 HuR が同定されました またこれらのタンパク質は WB でも確認されました さらに 1-3 以外のいくつかのバンドも同様に解析したところ p21 mrna の 3'-UTR に結合する可能性のある RBP が複数確認されました キット構成品 試薬 容量 試薬 容量 [RN1012] 細胞溶解試薬 ( 保存温度 2-8 ) CE Buffer 15 ml 1 bottle CE Wash Buffer 13 ml 3 bottles NE Buffer 6 ml 1 bottle Dilution Buffer 9 ml 1 bottle Detergent Solution 0.75 ml 1 vial High-Salt Solution 0.45 ml 1 vial 洗浄試薬 ( 保存温度 2-8 ) Wash Buffer I 48 ml 1 bottle Wash Buffer II 48 ml 1 bottle Wash Buffer III 48 ml 1 bottle Beads Wash Buffer 38 ml 1 bottle Copyright 2011 Medical & Biological Laboratories, All Rights Reserved. [RN1011] RiboTrap 試薬 ( 保存温度 -20 ) Anti-BrdU mab 0.5 ml 1 vial BrdU/DMSO 0.05 ml 1 vial 5-Bromo-UTP (50 mm) ml 1 vial Column (For Elution) 10 columns Column の保存温度はどの温度帯でも構いません コード No. 製品名 包装 希望購入価格 RN1011 RiboTrap Kit 10 assays 78,000 RN1012 * * RN1011 と RN1012 はセット販売となっております また RN1011 と RN1012 は保存温度が異なりますのでご注意ください RN1011: -20 RN1012: E