【Webinar18】はじめようmicroRNA解析_

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1 はじめよう microrna 解析 効率的な精製方法と機能解析手法の最新技術を学ぼう 2014 年 11 月 21 日 ( 金 ) ライフテクノロジーズジャパン株式会社 サーモフィッシャーサイエンティフィックグループ The world leader in serving science 1

2 本日の内容 micrornaの基礎 microrna の発現解析と機能解析 さまざまなサンプルからの RNA 抽出 RNA シーケンスによる microrna の探索 リアルタイム PCR による microrna の発現解析 microrna mimic, inhibitor を利用した機能解析 2

3 microrna(mirna) とは? 18~25 塩基の RNA 分子で 植物 動物に認められる 特異的で普遍的な転写後の調節因子であり 相補的な配列を持つ mrna に結合して翻訳抑制による遺伝子の発現抑制をおこなう 真核生物で広く保存されており 進化的に保存された生命活動の維持に必須な遺伝子発現機構であると考えられる ヒトのゲノムには約 2000 種類の mirna がコードされており 約 50% の遺伝子が mirna による発現調節を受けていると推測される 多くの場合 一つの mirna は複数の mrna の発現調節を行っており また mrna の多くは複数の mirna による発現調節を受ける 3

4 mirna が細胞 生体におよぼす影響 分化 発生 細胞死 疾病 疾患 エピジェネティクス Timing Lee et al Cell proliferation Brennecke et al Baehrecke 2003 Chen et al Cancers Calin et al. 2002; 2004 Lu et al Voorhoeve et al Bao et al Henderson et al Diabetes Neuron Poy et al Hatfield et al.,

5 細胞内での mirna 合成経路 * プライマリー mirna(pri-mirna) は核内で転写後 プロセシングを受けて ヘアピン構造の mirna 前駆体 (Pre-miRNA) となる Pre-miRNA は細胞質へ輸送され RNA 分解酵素 Dicer によるプロセシングを受けて二本鎖の RNA となる タンパク質の複合体 (RISC) に取り込まれた mirna は相補的な配列を持つ mrna に結合してタンパク質の発現を抑制する 成熟 mirna が RISC 複合体に取り込まれる microrna と mrna の相同性により結合して 翻訳抑制もしくは mrna の分解を行う * 成熟 mirna( 遺伝子発現調節活性を持つ配列 ) 5

6 mirna 研究の課題 1 2 抽出 & シーケンス ( 探索 ) mirna の発現解析 & プロファイリング どのような mirnaが発現している? いつ どこで mirnaが発現している? mirna mimic & inhibitor ライブラリーによるスクリーニング どのような細胞内プロセスが mirna による制御を受けている? どの遺伝子が mirna により発現調節されている? 3 4 mirnaの機能解析 6

7 mirnaの抽出 mirna の抽出はあらゆる mirna 解析において重要な第一段階 正確な mirna の解析には解析手法やサンプルの種類に適した mirna 抽出技術が必要となる RNAqueous-Micro + LCM Staining Kits (2 separate kits) LCM エキソソーム Total Exosome Isolation Reagents 組織 RecoverAll for Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE サンプルの種類 mirvana Kits MagMAX FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit FFPE Samples 細胞 Cells-to-CT Kits 血液 LeukoLOCK Total RNA Isolation System TaqMan mirna ABC Purification Kit 7

8 高収量 高純度の small RNA 抽出の重要性 GFF カラム (mrna) mirvana mirna Isolation Kit Actin beta mrna GAPDH mrna U1 snrna 5.8S rrna mirna を含む small RNA のピーク 5S rrna Let-7 mir-16 抽出手法によっては small RNA が消失 8

9 組織 細胞からの mirnaの抽出 mirvana mirna Isolation kit 組織 (0.5~250mg) 細胞 (10 2 ~10 7 cells) から簡便に small RNA を含む Total RNA を抽出可能 mirna sirna および 10 塩基以上の RNA 分子の抽出 オプションで 200 塩基以下の RNA の濃縮が可能 Total RNA Small RNA(~200nt) 9

10 FFPE サンプルからの mirna の抽出 脱パラフィン :20 分 80μm 以下の FFPE 切片をキシレンで脱パラフィンし 洗浄する プロテアーゼ消化 :3 時間 / 48 時間 3 時間 (RNA) もしくは 48 時間 (DNA)50 でプロテアーゼとインキュベーション 分間 FFPE = Formalin Fixed Paraffin Embedded ( ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル ) RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit 20µm の切片 4 つあるいは 35mg までのサンプルを処理 FFPE サンプルから microrna を含む Total RNA および DNA を抽出 核酸分離 :10 分 フィルターカートリッジに核酸を吸着させる ヌクレアーゼ消化消化と核酸精製 :45 分 フィルターカートリッジに Dnase もしくは Rnase を加えて混合し (30 分インキュベート ) 洗浄後 核酸を溶出 (2 X 30μL) FFPE 切片および凍結サンプルより Total RNA を抽出し TaqMan MicroRNA Assay を用いて 5S U6 has-mir- 372 has-mir373 を測定 10

11 エキソソームからの mirna 抽出 エキソソームとは? RNAやタンパク質を運ぶ微小胞 すべての細胞から分泌される 様々な体液中に認められる - 血液, 尿, 唾液, 母乳, CSF - 1µL あたり数百万個 多くの重要な働きを持つ - 細胞間コミュニケーション from: The Scientist, July 細胞内老廃物の廃棄 Total Exosome Isolation Reagents インタクトなエキソソームの収量が最大 時間のかかる超遠心が不要で シンプルなプロトコルにより簡単にエキソソームを回収 サンプル量によってスケールアップ / スケールダウンが可能 様々なサンプル専用の試薬及びプロトコールを用意 ( 培養上清 血清 血漿 尿など ) from: The Scientist, July

12 RNA シーケンスによる mirna の探索 RNA シーケンスは最も精度の高い mirna 解析手法であり 新規 mirna の探索を可能にする 新規な mirna の数は次世代シーケンスが広まってから飛躍的に増えている Isoform の正確な検出が可能 Number of Entries Sanger mirbase 登録数の増加 mirbase Version NGS Ion Torrent (PGM ) Distribution Run time Throughput 非常に高い導入およびランニングコスト 導入容易なランニングコスト 約 2 週間 約 2 時間 mirna 解析には必要以上のスループット 3 種類の small RNA サンプル (Ion 318 Chip) 12

13 RNA シーケンス vs. マイクロアレイ解析 高感度 配列の識別能 相関性 ダイナミックレンジ 13

14 トランスクリプトームライブラリーの作製 Ion Total RNA-Seq Kit v2 ライブラリー作製 small RNA と whole transcriptome ライブラリを構築可能 発現ストランドの方向性維持を可能にするユニークな原理 アダプターのライゲーション逆転写反応増幅 input RNA 1 ng enriched mirna 1 ng poly(a) RNA or 25ng rrna-depleted RNA ライブライ作製にかかる時間は5-6 時間 ゲルによるサイズセレクト不要 バーコード対応 (1-16) 14

15 Pri-miRNA, mirna, 全 Non-codingRNA の発現解析 TaqMan Assays 様々な RNA の信頼性の高い発現解析を可能にする 高感度 高い特異性 広いダイナミックレンジそして品質の高いデータの提供が可能 直ぐに使用可能 デザイン済み 全てのアッセイが同一条件でワーク Pri-miRNA mirna および noncoding RNA をそれぞれ特異的に検出可能 TaqMan PrimiRNA Assays TaqMan MicroRNA Assays 15

16 TaqMan MicroRNA Assay Step1: 逆転写 mirna 特異的 RT プライマーを用いた逆転写反応 mirna Specific RT primer Mature mirna (21nt) Mature mirna (21nt) 1miRNA Specific Looped RT primer Step2: リアルタイム PCR mirna Specific forward primer reverse primer mirna Specific TaqMan probe 2miRNA Specific forward primer Q 3miRNASpecific TaqMan probe F reverse primer 16

17 TaqMan MicroRNA Assay のワークフロー mirnaの抽出 逆転写反応 試薬調製 リアルタイム PCR 反応 データ解析 Expression Suite mirvana mirna Isolation Kit + TaqMan MicroRNA Assay = 3 時間 30 分 17

18 リアルタイム PCR による mirna 発現解析システムの比較 SYBR Green を用いた mirna の RT-qPCR TaqMan MicroRNAAssayは特異性特異性の高い mirnaの発現解析発現解析システム 18

19 mirna の新しい機能解析ツール mirvana mirna mimic 細胞へトランスフェクションされると 目的の成熟 mirna が mirna パスウェーに入り ターゲット遺伝子の発現調節を行う mirvana mirna inhibitors 成熟 mirna のアンチセンスオリゴであり mirna に結合して mirna の働きを抑制する 19

20 mirna の機能解析のプロセス TaqMan assay によるスクリーニング & mirna Mimics/Inhibitors によるバリデーション例 :mirvana mimic 例 :mirvana inhibitor 正常細胞 疾病細胞 正常細胞 疾病細胞 mirna TaqMan による発現プロファイリング mirna TaqMan による発現プロファイリング 結果 : 疾病細胞でmiRNAの発現量低下 機能解析 結果 : 疾病細胞でmiRNAの発現量増加 疾病細胞へ mirvanamimic をトランスフェクションして表現系が正常に戻るか確認 疾病細胞へ mirvanainhibitor をトランスフェクションして表現系が正常に戻るか確認 20

21 mirna の結合領域の解析 pmir-report mirna Expression Reporter Vector System mirnaの結合領域 ( 配列 ) 解析のためのレポーターベクター レポーター遺伝子の下流にmiRNA 結合領域を組み込む mirvana mirna mimic/ inhibitorをコトランスフェクションレポーターベクター + mirvana mirna mimic レポーター遺伝子の発現抑制レポーターベクター + mirvana mirna inhibitor レポーター遺伝子の発現増加 Luciferase mirna binding site pmr-report TM 21

22 mirvana mirna mimic mirna mirvana mirna mimicのmature strandは特異的に機能し star strand は不活性化されている Mature mirna (Guide) strand Star (Passenger) strand Luc mirna Target Luc Reverse Target Fold Change Fold Change mirna mirna mirna mirna mirna mirna mimic 1 mimic 2 mimic 3 mimic 4 mimic 5 mimic 6 Neg mirna mimic 1 mirna mimic 2 mirna mimic 3 mirna mimic 4 mirna mimic 5 mirna mimic 6 Neg 22

23 mirvana mirnamimic の機能確認 レポーターアッセイ 23

24 mirvana mirnainhibitor の機能確認 レポーターアッセイ 24

25 mirna プロファイリングとターゲット遺伝子 (mrna) 推測 mirna mir-143 mir-143 mir-143 mir-143 mir-143 mir-143 mir-143 mir-145 let-7 let-7 Predicted Gene Target breakpoint cluster region (BCR) MCF.2 derived transforming sequence (MCF2) von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL) v-ki-ras2 sarcoma oncogene (KRAS2) v-ki-ras2 sarcoma oncogene (KRAS2) Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) nras, kras, nras (multiple binding sites) MYC (multiple binding sites) TaqMan microrna Array を用いたプロファイリングにより肺がん組織で Let-7 の発現量の低下を確認 データベース検索により Let-7 がターゲットとする mrna を推測 25

26 肺がん組織での Let-7とRAS の発現レベルの相関性の確認 肺がん組織では著しい Let-7 の発現量の低下と RAS タンパク質の発現量増加を確認 Let-7 の発現量と Ras タンパク質量の高い相関関係を確認 RAS mrna 発現量と RAS タンパク質量との相関関係は低い 26

27 Let-7がRAS, MYC の発現抑制効果を示すか確認 Gain-of-Function : mirvana mirna mimic タンパク質減少 Loss-of-Function: mirvana mirna inhibitor タンパク質増加 mirvana mirna mimic (let-7) および mirvana mirna inhibitor (let-7) の細胞への導入 RAS および MYC タンパク質の発現を確認 時間培養 27

28 Gain of Function:mirVanamiRNAmimic を細胞に導入 HepG2 細胞への mirna mimic (let-7) の導入 (HepG2 細胞では let-7 が低発現 ) Negative Control mirna mimic (let-7) HepG2 細胞は内在性 let-7 が低発現なのでターゲット mrna からの翻訳が抑制されず RAS, MYC タンパク質の発現が見られる RAS 抗体 let-7 分子の導入 ターゲット mrna からの翻訳が阻害され RAS, MYC タンパク質の発現が抑制される MYC 抗体 mirna mimic (let-7) の導入により RAS MYC の発現量低下 28

29 Loss of Function:mirVanamiRNAinhibitor を細胞に導入 HeLa 細胞への mirna inhibitor (let-7) の導入 (HeLa 細胞では let-7 が高発現 ) Negative Control mirna inhibitor (let-7) HeLa 細胞は内在性 let-7 が高発現なのでターゲット mrna からの翻訳が抑制され RAS, MYC タンパク質の発現が抑えられる RAS 抗体 let-7 inhibitors の導入 内在性の let-7 が阻害され ターゲット mrna からの翻訳が促進 RAS, MYC タンパク質の発現が増加する MYC 抗体 mirna inhibitor (let-7) の導入により RAS MYC の発現量増加 29

30 肺がんにおける mirnalet-7 の関与モデル Let-7 の発現の減少 RAS MYCの発現の誘導 細胞の異常な増殖の誘導 癌化 Let-7 によるがん遺伝子 (RAS MYC) の発現制御ができなくなり がん化が進むと考えられる 30

31 まとめ : mirna の抽出 - 探索 - 発現解析 - 機能解析ツール mirvana mirna Isolation kits RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit Ion PGM Sequencer Ion RNA-seq kits mirna の抽出 mirna の探索 mirna Mimics & Inhibitors Transfection reagents Reporter Assays mirna の機能解析 mirna の発現解析 Taqman MicroRNA Assays 31