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ゆきささんきち
6 years ago
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Sympsium Sympslum n the chemistry hemlstry f natural prduts prducts 5 植物ポリケタイド合成酵素の潜在的触媒能力を活用した非天然型新規アルカロイド骨格の創出山下誠, 鰐渕清史 ( 静岡県大薬, 史社坡, 東大院薬, 森田洋行 Z ), 野口博司, 阿部郁朗天然物の基本骨格を構築する二次代謝酵素の中には,

1 Sympsium Sympslum n the chemistry hemlstry f natural prduts prducts 5 植物ポリケタイド合成酵素の潜在的触媒能力を活用した非天然型新規アルカロイド骨格の創出山下誠, 鰐渕清史 ( 静岡県大薬, 史社坡, 東大院薬, 森田洋行 Z ), 野口博司, 阿部郁朗天然物の基本骨格を構築する二次代謝酵素の中には, 活性部位の微妙な構造の違いで反応様式が大きく変化するものがあり, これが天然物の分子多様性を生み出す大きな要因の一つとなっている. 一方一, 般に酵素の基質特異性は厳密で自由度が低いものとされているが, 植物ポリフェノールの基本骨格を構築する皿型ポリケタイド合成酵素 (PKS ) が示す広範な基質特異性と触媒能力は特筆に値する ). これらは, 反応の立体化学が厳密に制御された精巧な酵素システムであるとは言い難く, むしろ単純なアシル基転移の繰り返しによる炭素鎖伸長マシンと捉えることができる. Cys His Asn からなる活性中心触媒残基は, 全ての皿型 PKS において例外なく保存されており, 同一のケミストリーで, マロニル CA の脱炭酸を伴った Claisen 縮合の繰り返しによる炭素鎖伸長反応が進行するものと考えられる. 従って, こうした酵素が示す寛容な基質特異性と潜在的触媒能力を活用して, 一連の工基質を作用させることにより, 非天然型新規化合物の効率的な生産が可能になる. また, C,H, 原子で構成される単純なカルボニルの化学を触媒する m 型 PKS に, さらに N などヘテロ原子を導入した人工基質を作用させれば, N 原子の塩基性を利用した新たな C N あるいは GC 結合の形成も可能になる. 反応性に富む β 一ポリケトメチレン中間体からシッフ塩基の形成を介した分子内環化反応が進行して, 複雑なアルカロイドの骨格を一挙に効率的に構築することができれば, m 型 PKS 酵素触媒機能の可能性をさらに大きく拡張することになると考え, 本研究に着手した. ( ) 含窒素人工基質を用いた非天然型新規アルカロイド骨格の創出当研究室でクローニングに成功したトウゲシバ Huperzia serrata 由来 PKS I は, 比較的大きな基質結合部位を有する新規 III 型 PKS であり, クマロイル CA を開始基質として 3 分子のマロニル CA を順次縮合の後, カルコンを生成する (Fig.IA) 3 4). ( A ) 冊濾曹ぴ 3 漕 KS 冗葱 mabnyi C 納 H c uma yic A na ing nln 齟 IC n 人 H (B ) : い漕鳶 X =C 齟伽ゾbenz 屮く )A X = N 3rearbarnyipgelinyl CA (c ) ( 磯急漕 R3HrCH3 H H 弧 l H 3rcarb 臼 rnyl 曹. aphthyicea Fig. H. serrata PKS が示した潜在的触媒能力と非天然型新規アルカロイド骨格の創出 : NH n SEni X R ζ 二 85 N 同 s,, n N NX 虹 I R R H R = H r CH3 ζ Σ NII-Electrnic N 工工一 Eletrnl Llbrary Library Service

2 Sympsium エ n セ the chemistry エ f natural ユ prducts 5 今回, 本酵素に化学合成した一カルバモイル安息香酸の CA チオエステルを開始基質として作用させた場合, 分子しマ n = ル CA ( またはメチルマロニル CA ) を順次縮合の後,6 5 6 縮合環構造を有する 3 環性非天然型新規アル 8 % で単一生成物として与えることを見出した (Fig.B, A ). 一方こ, れとは対照カロイドを収率的に, 後述するキダチアロ az Ale arbrescens 由来オクタケタイド合成酵素 (KS ) では, 一カルバモイル安息香酸 CA はほとんど開始基質として受け入れられず, 8 分子のマロニル CA の縮合によりオクタケタイド SEK4!SEK4b が主生成物として, 一カルバモイル安息香酸 CA に 3 分子のマロニル CA が縮合したラクトンがまた, 副生成物として得られるのみであった (Fig.B ), 次に, 一カルバモイル安息香酸 CA の芳香環を, ピリジン環やナフタレン環で置換した修飾基質を化学合成し, トウゲシバ由来 PKS に作用させた場合, 同様にして, 分子のマロニル CA を順次縮合の後, 閉環反応が進行して, 3 環性および 4 環性の非天然型新規アルカロイドを高収率で単生成物として生成することを見出した (Fig,IB, IC ). いずれの場合も, トリケタへイド中間体炭素鎖伸長の後シ, ッフ塩基の形成を介して, れる (Fig.3). (A ) H.serrata PKSI 訟磯酵素的に C N 結合形成と閉環反応が進行するものと考えら避窟 di N NH SEni 聖 4 晒騨繭膈弧 H N 戀嘱山 (B ) A.arbrescens KS ロ島 3 h 廼窟 NH ノ lm SEK4b EK4 c 転,!\ 証畝一 _ み. へ 6 卩 n / の if. 号 T 騨 /._, 弗 rftt 十 N NH Q h 髄噛酬ゆ偽 H Fig. H.serrrata PKS と A.arbrescens KS との酵素反応生成物 (HPLC ) の比較 i > t ヤ n X enanima N 貝眠 SEnz Fig.3 予想される H.serrata PKS 酵素反応トリケタイド中間体と閉環反応機構 86 ( ノ酬 rh 卿 e 証 ) 皿 NII-Electrnic N 工工一 Eletrnl Llbrary Library Service

3 Sympsium Sympslum n the chemistry hemlstry f natural prduts prducts 5 ( ) 結晶構造に基づく非天然型新規 C カルコンおよび Clg スチルベン骨格の創出上述したキダチアロエ由来 KS は, 8 分子のマロニル CA の繰り返し縮合により Ct6 芳香族オクタケタイド SEK4SEK4b の骨格を構築する新規皿型 PKS である (Fig.4A ) 5). 既に我々は, 本酵素の X 線結晶構造解析に.6 A の分解能で成功しており, 同じく 8 分子のマロニル CA の縮合を触媒するキダチアロエ由来ペンタケタイドクロモン合成酵素 (PCS ) の M7G 変異型酵素とほぼ同一の大きさと形状からなる活性中心キャビティをもつことを明らかにした 6 D. また, 活性中心 Cys74 を起点としてポリケタイド鎖が伸張していく際に壁となる Asn 残基にランダム変異を導入した結果 Gly, 置換体でマロニル CA 縮合数が分子まで拡大して, 非天然型 C ベ, ンゾフェノン誘導体 SEK5 を一単生成物として与えることを見出している (Fig.4B ) 9 ). さらに, KS NG 変異型酵素についても, X 線結晶構造解析に成功し, 変異の導入により実際に活性中心キャビティが拡大することも確認した. (A ) (B } Sx ASY x 螂瓢 mebn Y ( 坩屮 ea Y H }yi (ta mnbr l KS KS 堕偽櫨 Sεn 署慌 S εk 場 5 熱鞠 tu 鮒町謀 SEK 4 H w.c じ H CH3 HK ) 爆 s εk5 C S εk 4b Ct6 l _ 9 翩稽し丿 _., 馳籌脚 η KS WT KS NG t6 SubS 町 a 竃 e ε 葡 an V35 66F7SNfi YeN C43tT4 r ゾ s.lvye. ty : Fig.4 A,arbrescens KS 野生型及び NG 変異型酵素の活性部位構造と反応機構の比較 87 NII-Electrnic N 工工一 Eletrnl Llbrary Library Service

4 Sympsium Sympslum n the chemistry hemlstry f natural prduts prducts 5 今回, 本来 8 分子のマロニル CA を縮合する KS にクマロイル CA を開始基質として作用させた場合, クマロイル CA に 5 分子あるいは 6 分子のマロニル CA が縮合, ポリケタイド鎖が伸長の後, アルドール型縮合により芳香環を形成した, これまでに例のない, 非天然型新規 C カルコン及び C g スチルベン骨格が生成することを見出した (Fig.5) 9 ). ただし, 収率は芳しくなく, さすがに基質がこれだけ嵩高くなると酵素反応がうまく進行しないのも当然に思われた. しかし, 上述した, 結晶構造に基づき活性中心キャビティを拡大した KS NG 点変異酵素 ( マロニル CA のみを基質とした場合には分子縮合により C, ベンゾフェノン SEK 5 を生成する ) にクマロイル CA を開始基質として作用させた場合, 酵素反応生成物の割合が劇的に変化して, 非天然型新規 C 且カルコンの生成量が飛躍的に増大し, 主生成物として与えることを見出した 9}. c Asrv 鰯 :6 窟 malnyi く ) cuma yk )QA + 5xc ds 一ヘ ) mab ガ H 噸 {) 畝ジノ 7 ク SEni SEnz H ζ H C 7rt > H C 6/C H H H f 転 H 黛 A 8 H ζ H C9 KS WT SEK4b / _ 5 g 36 剛 n 唱 m 5 3 聖 Fig.5 A.arbrescens KS が示した潜在的触媒能力と非天然型新規ポリケタイド骨格の創出以上, 皿型 PKS の異例とも言える寛容な基質特異性と潜在的触媒能力を活用することにより, また, 合理的な人工基質の設計と結晶構造に基づく機能改変酵素を組み合わせることにより, 新規生体触媒と非天然型新規化合物の効率的な生産が可能になる. 今後, 酵素による閉環芳香環形成反応機構の解明と制御を進めるとともに, さらなる複雑骨格を有するアルンロイド分子のへ創製挑戦したい. 88 NII-Electrnic N 工工一 Eletrnl Llbrary Library Service

5 Sympsium n thechemistry chemistry f fnatural natural prducts rtl, nt e,retzrie (a)pfzzasra, y trty FaJatpt#hentuene$upmt,,eree,stefz yr t#e "Chemistry es-a;elf, (8). (b)i.abe, and bichemistryf type III (9). (c)i.abe, "Engineered plyketide synthases", IVat,Prd. Rep.,in preparatin bisynthesisf plantplyketides: structure-based and precursr-directed 7bpicsin CurrentChemistry,in press(9). "Substrate I. Abe, H. Mrita, A. Nmura, H. Nguchi, specificity apprach", f chalcne synthase: enzymatic frmatin f unnatural plyketides frm synthetic cinnamyl-ca analgs". J.Am, Chem. Sc.,,4(). K. Wanibuchi, P.Zhang, T. Abe, H. Mrita,T. Khn, G. Chen, H. Nguchi, I.Abe. "An acridne-prducing nvel rnultifunctinal type III plyketidesynthase frm Huperziaserrata", FEBS J.,74,73 (7). H. Mrita,S. Knd, R. Kat, K. Wanibuchi, H. Nguchi,S.Sugi,I.Abe, T.Khn, "Crystaizatin and preliminary crystallgraphic analysis f an acridne-prducing nvel multifunctinal type III plyketidesynthase frm HLiperziaserrata", Acta Crystallgr., F63, 576 (7). I.Abe, S.gur,Y.Utsumi,Y. San, H. Nguchi, "Engineered bisynthesis f plant plyketides: chain lengthcntrl inan ctaketide-prducing plant type III plyketide synthase". J.Am. Chem. Sc.,7, 79 (5). H. Mrita,S. Knd, R. Kat,K. Wanibuchi, H. Nguchi, S. Sugi, I.Abe, T. Khn, "Crystaizatin and preliminaryc lstallgraphicanalysis f an ctaketide-prducing plant type III plyketidesynthase". ActaCrystallgn, F63, 947 (7). H. Mrita,S.Knd, S.gur,H. Nguchi,S.Sugi,.Abe, T. Khn, "Structural insightintchain lengthcntrl and prduct specificity f pentaketide chrmne synthase frm Ale arbrescens". Chem. Bil.,4, 359 (7). I.Abe, H. Mrita,S. gur, H. Nma, K. Wanibuchi, N. Kawahara, Y. Gda, H. Nguchi,T. Khn, "Structure-based engineering f a plant type IIIplyketide synthase: frmatin f an unnaturai nnaketide naphthpyrne". J.Am. Chem. Sc., 9,5976 (7). S.-R Shi,K, Wanibuchi, H. Mrita,K. End, H. Nguchi, I. Abe, "Enzymatic frmatin f unnatural nvel chalcne, stilbene, and benzphenne scafflds by plant type IIIplyketidesynthase". rg.lett.,,55 (9) NII-Electrnic Library Service

6 Sympsium n the chemistry f natural prducts 5 Enzymatic Synthesisf UnnaturalNvel AlkalidaScafflds by PlantP( lyketidesynthases Makt Yamashitai, Kiyfumi Wanibuchii, Shep Shi, HiryukiMrita,HirshiNguchii, Ikur Abe ' SchlfPhar:maceutical Sciences,UniversitycvFShizuka GraduateSchlfPharmaceutical Sciences,7heUhiversity f7bky Planttype III plyketide synthases (PKSs) exhibit unusually brad, prmiscuus substrate specificities; the structurally simple hmdimeric prteins accept a variety f nnphysilgical substrates, includingarmatic and aliphatic CA thiesters, t prduce an array f chemically and structurally divergentunnatural plyketides Ḥere we present mst recent examples includingenzymatic frmatin f (i) tricyclicand tetracyclic unnatural nvel alkalidalscafflds by PKS frm Ehtperziaserrata, and (ii) a C,,hexaketidestilbene and a C, heptaketidechalcne by ctaketide synthase (KS) frm Ate arbrescens. Manipulatinf the enzyme reactins by cmbinatin f the precursr directedbisynthesis and structure-guided engineering f the enzyme wuld thus leadt furtherprductin f unnatural nvel plyketideand alkalid scafflds. c NII-Electrnic Library Service

biosynthesis

biosynthesis 天然物の合成生物学阿部郁朗東京大学大学院薬学系研究科はじめに学生時代モルヒネやペニシリンなどの薬用天然物に魅せられ薬学部の三川潮先生海老塚豊先生の研究室の門をたたいて以来 30 年一貫して天然物の生合成研究に取り組んできた生物がこうした多様な二次代謝産物を生産するのは何故か? どのようにしてあの複雑な構造を作り上げるのか? 生物の巧妙なものづくりの仕組みを解き明かしさらに我々にとって都合の良いように利用

Sympsium エ n セ the chemistry エ f natural ユ prducts 5 今回, 本酵素に化学合成した 一カルバモイル安息香酸の CA チオエステルを開始基質として作用させた場合, 分子し マ n = ル CA ( またはメチルマロニル CA ) を順次縮合の後,6

Sympsium エ n セ the chemistry エ f natural ユ prducts 5 今回, 本酵素に化学合成した一カルバモイル安息香酸の CA チオエステルを開始基質として作用させた場合, 分子しマ n = ル CA ( またはメチルマロニル CA ) を順次縮合の後,6