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1 講義の目的 遺伝子で生理現象を説明する

2 最新の研究例の紹介 記憶 ( 力 ) を支配する遺伝子 BDNF ( 脳神経栄養因子 ) 遺伝子の個人差 (= 変異 ) と記憶力の差異

3 Cell, Vol. 112, , January 24, 2003 ( セル誌 112 巻 2003 年 1 月号 P ) The BDNF val66met Polymorphism Affects Activity-Dependent Secretion of BDNF and Human Memory and Hippocampal Function BDNF( 脳神経栄養因子 ) の 66 番目のバリンがメチオニンになっている多型が神経活動に依存する BDNF の分泌やヒトの記憶力 海馬機能に影響する Michael F. Egan, Masami Kojima, Joseph H. Callicott, Terry E. Goldberg, Bhaskar S. Kolachana, Alessandro Bertolino, Eugene Zaitsev, Bert Gold, David Goldman, Michael Dean, Bai Lu, and Daniel R. Weinberger

4 この論文の骨子 遺伝子のわずかな違いが 神経細胞の成長と維持に働く物質にわずかな違い (1 アミノ酸変異 ) をもたらし 神経細胞内での分泌に違いが生じる そして脳の海馬機能に差が生じ ヒトのある種の記憶力の違いを説明できる

5 BDNF 遺伝子の変異とエピソード記憶力への効果 記憶力スコア val/val 型 val/met 型 met/met 型 BDNF 遺伝子の型 短期記憶力バリン型 > メチオニン型

6 BDNF 遺伝子の暗号 1 gctgccgccg ccgcgcccgg gcgcacccgc ccgctcgctg tcccgcgcac cccgtagcgc 61 ctcgggctcc cgggccggac agaggagcca gcccggtgcg cccctccacc tcctgctcgg 121 ggggctttaa tgagacaccc accgctgctg tggggccggc ggggagcagc accgcgacgg 181 ggaccggggc tgggcgctgg agccagaatc ggaaccacga tgtgactccg ccgccgggga 241 cccgtgaggt ttgtgtggac cccgagttcc accaggtgag aagagtgatg accatccttt 301 tccttactat ggttatttca tactttggtt gcatgaaggc tgcccccatg aaagaagcaa 361 acatccgagg acaaggtggc ttggcctacc caggtgtgcg gacccatggg actctggaga 421 gcgtgaatgg gcccaaggca ggttcaagag gcttgacatc attggctgac actttcgaac 481 acgtgataga agagctgttg gatgaggacc agaaagttcg gcccaatgaa gaaaacaata 541 aggacgcaga cttgtacacg tccagggtga tgctcagtag tcaagtgcct ttggagcctc 601 ctcttctctt tctgctggag gaatacaaaa attacctaga tgctgcaaac atgtccatga 661 gggtccggcg ccactctgac cctgcccgcc gaggggagct gagcgtgtgt gacagtatta 721 gtgagtgggt aacggcggca gacaaaaaga ctgcagtgga catgtcgggc gggacggtca 781 cagtccttga aaaggtccct gtatcaaaag gccaactgaa gcaatacttc tacgagacca 841 agtgcaatcc catgggttac acaaaagaag gctgcagggg catagacaaa aggcattgga 901 actcccagtg ccgaactacc cagtcgtacg tgcgggccct taccatggat agcaaaaaga 961 gaattggctg gcgattcata aggatagaca cttcttgtgt atgtacattg accattaaaa 1021 ggggaagata gtggatttat gttgtataga ttagattata ttgagacaaa aattatctat 1081 ttgtatatat acataacagg gtaaattatt cagttaagaa aaaaataatt ttatgaactg 1141 catgtataaa tgaagtttat acagtacagt ggttctacaa tctatttatt ggacatgtcc 1201 atgaccagaa gggaaacagt catttgcgca caacttaaaa agtctgcatt acattccttg 1261 ataatgttgt ggtttgttgc cgttgccaag aactgaaaac ataaaaagtt aaaaaaaata 1321 ataaattgca tgctgcttta attgtgaatt gataataaac tgtcctcttt cagaaaacag 1381 aaaaaaaaca cacacacaca caacaaaaat ttgaaccaaa acattccgtt tacattttag 1441 acagtaagta tcttcgttct tgttagtact atatctgttt tactgctttt aacttctgat 1501 agcgttggaa ttaaaacaat gtcaaggtga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

7 推定されるアミノ酸配列 問題のバリン MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTH GTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPN EENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAA NMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMS GGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGID KRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCT LTIKRGR

8 aagagtgatgaccatccttttccttactatggttatttcatactttggttgcatgaaggctgcccccatg M T I L F L T M V I S Y F G C M K A A P M aaagaagcaaacatccgaggacaaggtggcttggcctacccaggtgtgcggacccatgggactctggag K E A N I R G Q G G L A Y P G V R T H G T L E agcgtgaatgggcccaaggcaggttcaagaggcttgacatcattggctgacactttcgaacacgtgata S V N G P K A G S R G L T S L A D T F E H V I g ( グアニン ) が a ( アデニン ) へ変化 atg M 一塩基多型 (SNP) シングル ヌクレオチド ( 塩基 ) ポリモルフィズム ( 多型 ) 人は 2n 生物なので 同じ遺伝子は一組 2 つある 一つは母親から 一つは父親から遺伝する この 66 番がバリンがメチオニンに変異した遺伝子が存在する val/val ( 優性ホモ ) val/met( ヘテロ型 ) met/met ( 劣性ホモ )

9 BDNF 遺伝子の変異とエピソード記憶力への効果 記憶力スコア BDNF 遺伝子の型 val/val 型 val/met 型 met/met 型 バリン型 > メチオニン型

10 val 型に比べて met 型では神経細胞内での発現が弱い 細胞の端の方では 発現していない BDNF が神経細胞内で作られているかどうか色を付けて見えるようにすると

11 遺伝子 (gene) この講義の Key Words: 細胞がタンパク質を作る際の設計図 遺伝子の発現 (gene expression) 遺伝子がよみとられタンパク質がつくられること塩基配列 (sequence) 遺伝子がもっている情報の本質 A,T,C,Gの4 文字で表される遺伝暗号 (codon) 3 つの塩基の並びかたである一つのアミノ酸を意味する

12 転写因子 ゲノム 生命活動の基本型 遺伝子 (gene) DNA 転写 (transcription) 発現 mrna (expression) 翻訳 (translation) タンパク質 ( 酵素 :enzyme) 素材分子 酵素反応 生体分子 細胞への働きかけ 生理現象

13 ゲノム (genome) 親から子に伝わる遺伝情報の全体を意味する半分は母親から 半分は父親から ゲノム 染色体 常染色体 1 番染色体 2 番染色体 22 番染色体 遺伝子 x 2 性染色体 X 染色体 Y 染色体

14 遺伝子の構造 染色体 (chromosome) 細胞分裂中期の像普段は 1 本で X 型ではない 5' ATCGCTTAAATTTAGGCGATCGCTTAAATTTAGGCG TAGCGAATTTAAATCCGCTAGCGAATTTAAATCCGC 3' 3' 5' Gene 1 Gene 2 5' 3'

15 5 側 遺伝子の記録方法 1 actaggcaaa ggacttgtgt caaaatcagg actgaaatac attaatgtgg gtgatttagc 61 tcaagaagtc tgatcatcgt atatcatgga gtctggcaag atggcttctc ccaagagcat 121 gccgaaagat gcacagatga tggcacaaat cctgaaggat ctgggaatta cagaatatga 181 gccaagactt ataaatcaga tgttagagtt tgccttccgt tatgtgacca caattctaga 241 tgatgcaaaa atttactcca gccatgctaa gaaagctacc gttgatgcag atgatgtgca 301 gttggcaatc cagttccacg ctgaccagtc ttttacctct cttcccccaa gagatttttt 361 tattagatat cgcaaggcaa agaaatcaaa ccccttttcc attaatcaag ccatattcag 421 gtcctagatt gccacctgat agatattgct taacagctcc aaattatagg ctgaaatctt 481 tacagaaaaa ggcatcaact tccacgggaa gagtaacagt cccgcagtta agtgttggtt 541 cagttgctag cagaccaagt actcccacac taggcacacc aaccccacag accatgtctg 601 tttcaactaa agtagggact cccgtgtccc tcacagggca aaggtttaca gtacagatgc 661 ctacttcaca gtctccagct gtaaaatctt caattcctgc aacatcagca gttcagaatg 721 ttctgattaa tccatcatta attgggtcca aaagcttctt attaccacta atacggtgtt 781 atcacaaaat actgccaatg aatcatcaaa tgcattgaaa aagcgtgaag aagatgatta 841 tgataatttg taatttagcc ttgctgcatg taacatgtat acttggtctt gaattcattg 901 tactgatact aaacatgcgt gctggatgtt ttcaagttgt attttagaaa act 3 末端側

16 A T 水素結合 2 3 G C

17 DNA RNA の部品 塩基 (Bases) ピリミジン (pyrimidine) シトシン (C) チミン (T) ウラシル (U) プリン (purine) アデニン (A) グアニン (G)

18 糖 DNA RNA の部品 ヌクレオチド (Nucleotide) デオキシリボース Deoxyribose H OH リボース Ribose デオキシアデノシン一リン酸 (Deoxyadenosine monophosphate)

19 5 末端 (5 end) N 3 2 炭素の位置番号 ヌクレオチドのつながり方 3 末端 (3 end)

20 5 側 遺伝子の記録方法 1 actaggcaaa ggacttgtgt caaaatcagg actgaaatac attaatgtgg gtgatttagc 61 tcaagaagtc tgatcatcgt atatcatgga gtctggcaag atggcttctc ccaagagcat 121 gccgaaagat gcacagatga tggcacaaat cctgaaggat ctgggaatta cagaatatga 181 gccaagactt ataaatcaga tgttagagtt tgccttccgt tatgtgacca caattctaga 241 tgatgcaaaa atttactcca gccatgctaa gaaagctacc gttgatgcag atgatgtgca 301 gttggcaatc cagttccacg ctgaccagtc ttttacctct cttcccccaa gagatttttt 361 tattagatat cgcaaggcaa agaaatcaaa ccccttttcc attaatcaag ccatattcag 421 gtcctagatt gccacctgat agatattgct taacagctcc aaattatagg ctgaaatctt 481 tacagaaaaa ggcatcaact tccacgggaa gagtaacagt cccgcagtta agtgttggtt 541 cagttgctag cagaccaagt actcccacac taggcacacc aaccccacag accatgtctg 601 tttcaactaa agtagggact cccgtgtccc tcacagggca aaggtttaca gtacagatgc 661 ctacttcaca gtctccagct gtaaaatctt caattcctgc aacatcagca gttcagaatg 721 ttctgattaa tccatcatta attgggtcca aaagcttctt attaccacta atacggtgtt 781 atcacaaaat actgccaatg aatcatcaaa tgcattgaaa aagcgtgaag aagatgatta 841 tgataatttg taatttagcc ttgctgcatg taacatgtat acttggtctt gaattcattg 901 tactgatact aaacatgcgt gctggatgtt ttcaagttgt attttagaaa act 3 末端側

21 遺伝子の始まりと終わりをしめす暗号 Gene 1 Gene 2 5' 3' ATG TAA, TAG, TGA mrna 中の AUG を開始 trna がみつけて結合する mrna 中の UAA あるいは UAG あるいは UGA のところでリボゾーム遊離因子が結合 翻訳の終了 Open reading flame(orf)

22 triplet codon コドンの 3 番目の塩基は置換されてもアミノ酸が代わらない例が多いことに注意 ( 分子進化の中立説 )

23 遺伝情報の読み枠 (flame) L S V T 5 CTC AGC GTT ACC AT 3 S A L P 5 3 C TCA GCG TTA CCA T Q R Y H CT CAG CGT TAC CAT 5 3 Open reading flame: オープンなフレームはどれか?

24 塩基の挿入 (insertion) や欠失 (deletion) による突然変異 (mutation) R S T L S 5 -AGA TCG ACG TTA AGC-3 アミノ酸配列 C シトシンの挿入が起こると R S H V K 5 -AGA TCG CAC GTT AAG C-3

25 4 ー 4.ras 遺伝子塩基配列の比較と Rasタンパク質アミノ酸配列の比較 9.5'.-AGCG ATG ACG GAA TAT AAG CTG M T E Y K L GTG GTG GTG GGC GCC GGC GGT... V V V G A G G GGC G GTC V 正常 ガン細胞 塩基配列が GGC から GTC へ変化

26 乳ガンの遺伝子 BRCA1 遺伝子 :BRCA タンパク質は核内に存在 遺伝子の発現調節 コドン位置 塩基変異 ATG > ATT GTA > GCA ATC > GTC TTA > TCA アミノ酸変異 Met > Ile Val > Ala Ile > Val Leu > Ser BRCA1 の変異を持つと 80% の確率で乳ガンになる危険性 40% の確率で卵巣ガンになる危険性がある

27 遺伝子は目に見えるか? ミトコンドリア 核 細胞の電子顕微鏡写真 50μm 0.1μm DNA が複製されているところ

28 遺伝子を分離する 寒天を固める 電気泳動装置にセット 小さい穴が端にあけてある

29 孔に DNA 溶液を入れる ( 青い色素をまぜとく ) DNA は負電荷なのでプラス極 ( 左 ) へ引っ張られる

30 染色後 UV 照射すると光る DNA

31 DNA シーケンサー

32 分子生物学の勝利 = 肥満遺伝子の発見

33 年代にかけて確立された常染色体異常マウス 正常マウス +/+ ob/ob マウス db/db マウス 過食 肥満 糖尿病 不妊

34 併体結合実験 (1960 年代 ) ob/ob マウスの正常化 +/+ ob/ob +/+ ob/ob 摂食 体重増加抑制因子が血液中に存在? +/+ マウスの餓死 db/db マウスの肥満進行 +/+ db/db +/+ db/db 抑制因子に応答不全?

35 血液中の抑制因子の検索 精製と同定のこころみ

36 なぜレプチンが精製できなかったのか? あとになってわかったこと レプチンの血液中濃度 ng/ml kg g mg μg ng pg ng, ナノグラム 1, /1,000 1/1,000,000 1/1,000,000,000 1/1,000,000,000,000 レプチンを 1mg 得ようとすると 血液 100 リットル以上必要しかも簡単な生理活性測定法が確立されなかった

37 肥満遺伝子のクローニング 成功 肥満原因遺伝子の塩基配列解析遺伝子の異常解明ヒトにおける同一遺伝子のクローニングヒトにおける肥満の解明

38 マウス肥満遺伝子のクローニングの成功 (Friedman ら 1994) 手法 : ポジショナルクローニング 単離遺伝子 :ob 遺伝子 504 塩基対 (bp) 167 アミノ酸のタンパク質をコード 1 atgtgctgga gacccctgtg tcggttcctg tggctttggt cctatctgtc ttatgttcaa 61 gcagtgccta tccagaaagt ccaggatgac accaaaaccc tcatcaagac cattgtcacc 121 aggatcaatg acatttcaca cacgcagtcg gtatccgcca agcagagggt cactggcttg 181 gacttcattc ctgggcttca ccccattctg agtttgtcca agatggacca gactctggca 241 gtctatcaac aggtcctcac cagcctgcct tcccaaaatg tgctgcagat agccaatgac 301 ctggagaatc tccgagacct cctccatctg ctggccttct ccaagagctg ctccctgcct 361 cagaccagtg gcctgcagaa gccagagagc ctggatggcg tcctggaagc ctcactctac 421 tccacagagg tggtggcttt gagcaggctg cagggctctc tgcaggacat tcttcaacag 481 ttggatgtta gccctgaatg ctga

39 マウス ob 遺伝子産物 : レプチン MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQAVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQS VSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIAHD LENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRL QGSLQDILQQLDVSPEC 血液中には N 末端側のシグナルペプチドがはずれた 146 アミノ酸からなるペプチドとして循環 ヒトレプチンとマウスレプチン 83% の相同性

40 ob 遺伝子の組織特異的発現 Northern blotting 法

41 肥満者の腹部 CT スキャン像 内臓脂肪型 皮下脂肪型 脂肪細胞

42 脳 ( 視床下部 ) 空腹感の発生 脳 ( 視床下部 ) 満腹感の発生 すい臓 インスリン レプチン 脂肪細胞

43 内分泌 (endocrine) 分泌細胞 標的細胞 血流 ホルモン

44 シナプス型 (sinaptic) 電気インパルス 標的細胞 神経細胞 軸索 神経伝達物質

45 情報伝達 はどうやって伝達されるのか レセプターとリガンド 細胞の分子生物学第 15 章参照

46 シグナル分子 細胞表層受容体 G タンパク質 ホスホリパーゼ 膜結合性アデニリル シクラーゼ ATP camp Ca 2+ イノシトールリン酸 小胞体 標的タンパク質の活性化

47 標的タンパクが PKC の場合 C- キナーゼ活性型 C- キナーゼ イノシトールリン酸 ATP ADP MAP キナーゼ 活性型 ATP ADP 遺伝子調節タンパク ELK-1 活性型 mrna 核膜

48 食物の摂取 レプチン (leptin) 作用のメカニズム Filterら (1996) インスリン分泌 脂肪組織中のob 遺伝子の転写レプチンの生成血中濃度増加 視床下部レセプターへの結合 レセプターがあいているとMCH ( メラニン濃縮ホルモン ) ニューロトランスミッター (GLP-1) グルカゴン様ペプチドー 1 視床下部 摂食の停止 摂食

49 ob 遺伝子産物 :leptin db 遺伝子産物 :leptin receptor ob - /ob - マウス :ob 遺伝子中の点突然変異で正常なレプチンタンパク質が作れない低レプチン血症 db - /db - マウス : レプチン受容体遺伝子の変異で正常なレプチン受容体が作れないレプチン抵抗性

50 肥満 = 白色脂肪細胞の過剰蓄積 肥満者の95%= 高レプチン血症レプチン分泌増加 5%= 低レプチン血症 ( ob /ob マウスと同じ ) レプチン抵抗性血液中レプチン結合タンパク質の異常脳血液関門の輸送障害レプチン受容体の異常 db /db マウス受容体以降のシグナル伝達系の異常 食欲抑制 エネルギー消費増大 レプチンによる飽食シグナルが視床下部につたわらない肥満の亢進

51 遺伝子が別の遺伝子を制御する : 遺伝子のネットワーク X 遺伝子の転写制御 タンパク質の修飾立体構造変化糖鎖の結合

52 遺伝子のネットワーク = 遺伝子発現調節ネットワーク IL-1 IL-1 Rs IL-2Rs JAM3 一つの遺伝子の発現が他の遺伝子の発現を促す つぎつぎに発現してゆく IRS2 JAM1 GeneX STATG CD23 ( 例 : 免疫関連遺伝子 )

53 遺伝情報解析の戦略図 遺伝子発現ネットワーク 遺伝病解明 ガン解明 ゲノム創薬 タンパク質情報 遺伝子発現情報 変異遺伝子情報 ゲノム情報

54 生理現象は 遺伝子の発現で説明できる個人差も遺伝子の変異で説明可能 病理現象の多くと違ってたいていの生理現象は 1 つの遺伝子の働きだけでは説明できない = 遺伝子ネットワークを解明する必要がある

55 動物への遺伝子導入 hgh 遺伝子 右 : ひと成長ホルモン遺伝子を導入したラット 左 : 対照ラット Science 222 巻 11/18 号 (1983)