150205_博士論文要約

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ありあけいれい
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2 博士論文内容要約細胞核内アクチンフィラメントの機能と制御機構の研究東北大学大学院農学研究科応用生命科学専攻山崎祥他指導教員原田昌彦准教授

3 第 1 章序論細胞骨格の主要な構成タンパク質であるアクチンは細胞内において単量体の G-アクチン (Globular-actin), あるいは G- アクチンが重合繊維化した F- アクチン (Filamentous- actin) の二つの形態で存在するさらに F-アクチンのバンドル形成 ( 束化 ) は強固な細胞骨格を形成し細胞の形態維持や遊走などの様々な細胞機能を担っているまた細胞内にはアクチンに進化的構造的に関連性を有するアクチン関連タンパク質 (actin-related protein; Arp) が存在しアクチン結合タンパク質 (actin-binding protein; ABP) と共にアクチンの機能やダイナミクスの制御を担っている一例としては Arp サブファミリーの中でも F-アクチンの伸長や架橋反応には Arp2/3 複合体が寄与することが明らかになっており細胞質におけるアクチンの制御機構の詳細な研究が行われているその一方で近年細胞核内におけるアクチンの機能やダイナミクスも注目され始めている核内に局在するアクチンの存在は 1960 年代に既に示されていたがアクチンは細胞質に豊富に存在しているため核画分のアクチンは実験過程で混入した細胞質アクチンであると考えられその存在は否定的に捉えられてきたしかし 1970 年代には巨大な両生類の卵母細胞を用いた実験系により核内にもアクチンが存在することやその大部分が水溶性の単量体の G-アクチンであることが報告された (Clark et al., 1977) また核内アクチンの機能阻害はクロマチン構造の異常を示すことが発見された近年では核内の G-アクチンが Arp サブファミリーと共にクロマチンリモデリング複合体の構成タンパク質となることでクロマチンの構造変換や修飾など幅広いゲノム制御機構に関与することが明らかになっている (Oma and Harata, 2011) このような背景から現在では核内 G-アクチンによるクロマチンリモデリング複合体を介したエピジェネティック制御機構モデルが多数提唱されているこのように核内の G-アクチンの機能解 1

4 明が進む一方で核内における一過的な F-アクチンの形成が様々な生物で広く観察されているがその意義や機能については長い間不明であった Gurdon らによって卵母細胞に体細胞核を移植することで遺伝子の初期化が起きることが示されているが近年 Gurdon らはその際には一過的に核内アクチンフィラメントの形成が起きることを報告している (Gurdon, 1962; Miyamoto et al., 2011) また核内 F-アクチンの形成は初期化因子である Oct4 の発現誘導に重要な役割を持つことが示され核内における F-アクチンの転写制御への関与が注目され始めているしかし遺伝子の初期化における核内 F-アクチンの形成は一過的で迅速に脱重合されるため卵母細胞を用いた機能解析は非常に困難であったこれらの背景から本博士論文では培養細胞を用いた核内 F-アクチンの機能解明を主要な目的とした第 2 章では培養細胞系における核内アクチンの重合を任意に誘導可能な実験系の確立を行った第 3 章第 4 章では第 2 章で確立した実験系を用いて核内 F-アクチンによる遺伝子発現への影響とそのメカニズムの解明を行った最後に第 5 章では核内におけるアクチンの制御因子としての Arp4 の解析を行った 2

5 第 2 章ヒト培養細胞を用いた核内アクチン重合を任意に誘導可能な実験系の確立緒言本章では核内 F-アクチンを任意に誘導可能な実験系を確立することを目的として実験を行ったアクチンの細胞質 - 核間シャトルは核輸送因子である Importin9 (Ipo9) と核排出因子である Exportin6 (Exp6) によって制御されることが知られている (Dopie, et al., 2012) 通常は核排出因子 Exp6 によって核内のアクチンが迅速に細胞質へ排出されるため大部分のアクチンは細胞質に存在しているこれはアクチンがその立体構造中に二か所の核外移行シグナル (Nuclear export signal; NES) サイトを持つことに起因するアクチンの NES 配列の変異はアクチンの核内集積を引き起こしさらに核内アクチン濃度の上昇によってアクチンバンドル形成がおこることが報告されている (Wada, et al., 1998) 輸送因子による NES 配列をターゲットにしたアクチンの核外排出は核膜孔複合体 1 (NPC) を介していることがわかっており核外輸送に関わる CRM1 の機能を特異的に阻害する Leptomycin B (LMB) 処理でも同様にアクチンの核内集積が観察されることから核内においてもアクチンは重合能を有していることが示唆されていたしかしアクチンは細胞内シグナルを制御する様々な転写因子と共に細胞質 - 核間をシャトルしているため NES 配列の変異によるアクチンの核外排出の阻害では細胞質のアクチン繊維の形成阻害を介した間接的な影響が予想されたそこでアクチンの NES 配列は維持したまま核移行シグナル (Nuclear localization signal; NLS) をアクチンに付加することでアクチンの細胞質 - 核間シャトル機能を維持した状態で核内アクチン量を増加させ核内アクチンフィラメントを人為的に形成することを目指した 3

6 結果考察まず NLS 付加アクチン (NLS-actin) をヒト培養細胞である HeLa に一過的に発現させ共焦点顕微鏡による観察を行った (Fig. 1) その結果核内におけるアクチン局在量の増加が認められ核内でバンドル状の GFP 蛍光も観察されたそこで次にこれらのバンドルが確かに F-アクチンのバンドルであるかを二つの実験により検証したまず F-アクチンのプローブである Phalloidin に蛍光タグである Alexa594 を付加した Phalloidin プローブを用い免疫染色を行った (Fig. 2) 1 時間のプローブ染色では核内バンドルへの Phalloidin の結合は認められなかったがプローブの反応時間を 24 時間まで延長したところ核内バンドルへの結合が観察され NLS-actin の発現により形成されたバンドルが F-アクチン由来であることが示された次に F-アクチンの切断によって脱重合を誘導する Mycalolide B 処理を行いタイムラプス ( 経時 ) 観察を行った (Fig. 3) その結果薬剤処理の 30 分後にはほぼ全てのバンドルの消失が観察されたこれらの二つの検証から NLS-actin の発現により核内 F-アクチンのバンドルが形成されることまた核内においてもアクチンは重合機能を保持していることが明らかになったそこで次にバンドルを形成せずに核内に蓄積したアクチンが全て G-アクチンとして存在しているかを解析したまず Lifeact プローブによって核内アクチンの状態解析を行った Lifeact は F-アクチンに結合する一方でアクチンの重合脱重合には影響しない性質を持つ (Riedl et al., 2008) この特性を利用し Lifeact-mCherry 発現ベクターを NLS-actin と共発現させることで核内アクチンへの結合が認められるか顕微鏡による観察を行った (Fig. 4) その結果 Lifeact と核内アクチンの共局在が認められバンドルを形成していない細胞でも核内アクチンの少なくとも一部は F-アクチンの状態で存在することが示されたこれらの検証結果から NLS-actin の発現によってヒト培養細胞で核内 F- アクチンを人為的に誘導可能な実験系を確立した 4

7 第 3 章転写制御における核内 F- アクチンの機能解析緒言第 2 章の結果より核内でもアクチンは細胞質と同様に繊維形成能を維持していることが明らかとなりこれまで報告されていた核内 G-アクチンの機能とは異なる役割を核内 F-アクチンが持つことが示された核内 F-アクチンの形成は Oct4 の発現に重要な役割を持つことが報告されているそこで本章では核内 F-アクチンが遺伝子発現に与える影響を検証するため第 2 章で確立した培養細胞の核内でアクチン重合を人為的に誘導可能な系を用いてマイクロアレイ解析を行い核内 F-アクチン形成に伴う遺伝子発現の変化を網羅的に解析したまたヒト培養細胞の内在性アクチンによる核内 F-アクチンの形成が遺伝子初期化因子である OCT4 の発現誘導に機能するか検証するためアクチン脱重合剤を用いてアクチン骨格のリモデリングを起こし内在性アクチンを核内移行させることで OCT4 の発現が誘導されるかについても解析を行った結果考察まず核内 F-actin の形成による転写への影響を網羅的に解析するため NLS-actin を発現させた HeLa 細胞を用いてマイクロアレイ解析を行ったその結果 OCT4 を含む 1293 遺伝子の発現上昇と 811 遺伝子の発現減少が認められた同様に定量 PCR による発現解析の結果 NLS-actin を発現した細胞はコントロールと比較して有意な OCT4 の発現上昇が確認された (Fig.5) そこで次に内在性アクチンの核内局在量を増加させることによって同様に OCT4 の発現誘導が認められるか検証を行ったアクチンの脱重合剤である Latrunculin B(LatB) は細胞質のアクチンを脱重合させ核内のアクチン局在量を増加させる作用が報告されているそこでまず Lat B の処理によって増加した核内アクチンが F-アクチンを形成するか解析を行ったその結果 5

8 Lat B の処理により核内における Lifeact プローブの蛍光が観察され Lat B は核内アクチンの重合を促進することが示された (Fig. 6A) また核内 F-アクチンの形成による OCT4 の発現上昇も認められた (Fig. 6B) これらの結果からヒト培養細胞でも核内 F-アクチンによる OCT4 の発現誘導が再現可能であることを明らかにしたこれまでアクチンの脱重合剤処理によるアクチン骨格リモデリングによって細胞の分化が誘導されることが報告されていたがそのメカニズムは明らかになっていなかったそのため今後本実験系を用いてアクチン結合性薬剤による核内アクチンへの影響を解明することにより遺伝子の初期化や分化の機構解明が可能であると期待される 6

9 第 4 章核内 F- アクチンによる転写制御機構と β-catenin 緒言第 3 章では核内 F-アクチンの形成が OCT4 を含む多様な転写因子の発現に関与していることを示したしかし核内 F-アクチンによる OCT4 の発現誘導メカニズムは未だ明らかになっていないそこで本章では核内 F-アクチンの転写メカニズムの一つとして F-アクチンが転写因子の活性化を介して OCT4 の発現制御に関与する可能性について検証した Wnt/β-catenin シグナルにおける主要な転写因子であるβ-catenin は Wnt シグナルの非存在下で細胞質のアクチンフィラメントに結合し安定化されるまた Wnt シグナルの活性化により核内へ移行し OCT4 を含むターゲット遺伝子の転写誘導を行う (Li et al., 2012) これらの背景から核内においてもβ-catenin は F-アクチンに結合することで安定化され核内局在量が増加し OCT4 を含むターゲット遺伝子を活性化する可能性を考えその検証を行った (Fig. 7) 結果考察マイクロアレイ解析の結果から変化した遺伝子のうち細胞内シグナルに関与した遺伝子に注目すると増加した 85 遺伝子の中の 16 個が Wnt 関連遺伝子である一方で減少した 55 の遺伝子中には1 個しか含まれていなかった (Fig. 8) この結果は Wnt/β-catenin シグナルの活性化に核内 F-アクチンが寄与することを示唆しているそこで次に核内 F-アクチンがβ-catenin の細胞内局在に与える影響を解析したところ NLS-actin を発現した細胞では核内のβ-catenin の増加が観察さた (Fig. 9A) 次に核内に蓄積したβ-catenin が転写活性化に寄与しているかを解析するためルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったその結果 NLS-actin 発現細胞でレポーター遺伝子の有意な発現上昇が確認され (Fig. 9B) 核内に蓄積したβ-catenin が転写活性に寄与して 7

10 いることが示されたこれらの結果から核内 F-アクチンがβ-catenin を介して転写制御に関与することが示唆されたこれまで核内アクチンの機能は主に G-アクチンが寄与していると考えられてきたが本研究結果から核内 F-アクチン特異的なエピジェネティック制御機構の存在が示唆されたその一方でこのような核内 F-アクチンやアクチンバンドルの形成は遺伝子の初期化や過度のストレス存在下でのみ報告されており通常の細胞核内では観察されないそこで核内には細胞質と異なるアクチンの制御因子が存在し核内アクチンの重合を厳密に制御していることが推測された 8

11 第 5 章核内アクチンの重合制御における Arp4 の機能解析緒言細胞質のアクチン重合や脱重合は ABP である Profilin や Gelsolin Arp サブファミリーである Arp2/3 複合体などによって制御されるがこれらのアクチン制御因子は一般的に核内には存在しないこれは細胞質と異なるアクチンの制御機構が核内に存在することを示唆しているそこで核内アクチンの制御因子として本研究ではアクチンファミリータンパク質の一つである Arp4 に焦点を当て解析をおこなった Arp4 はアクチンと高い相同性を持つ一方で核内に局在しておりアクチンのように繊維化しない性質を持っている加えて in vitro の解析からは濃度依存的にアクチンの重合を阻害する能力を持つことが報告されている (Fenn et al., 2011) これらの先行研究から Arp4 が核内でアクチンの重合を阻害することで核内 F-アクチンの機能制御に関与する可能性を考えたそこでヒト培養細胞内の Arp4 を減少させることで核内におけるアクチン重合の誘導が起きることかを解析するため RNA 干渉法による Arp4 のノックダウン (Arp4KD) 実験を行った方法としては GFP タグを持つ sirna 発現ベクターと共に核内アクチンの重合を観察する目的で Lifeact-mCherry を HeLa 細胞で共発現させ共焦点顕微鏡による観察を行った結果考察 RNA 干渉法による Arp4 のノックダウン (Arp4KD) 実験では核内の Lifeact 蛍光の増加が観察され Arp4KD により核内アクチンの重合化が認められた (Fig. 10) Arp4 はクロマチンリモデリング複合体の構成タンパク質であることから転写制御への影響特にアクチンの細胞質 - 核間の輸送因子である Ipo9/Exp6 への影響の可能性も考えられたがこれら輸送因子の発現に変化は認められなかった (Fig. 11) この結果 9

12 は Arp4KD 後の核内 F-アクチンの形成はアクチンの輸送を介した間接的な現象ではなく Arp4 のアクチンへの結合が減少したことによるものであることを示している次にノックダウンした Arp4 の機能相補を目的に sirna の Arp4 ターゲット領域のアミノ酸配列を変更せずに塩基配列を置換した sirna 回避型の Arp4 cdna を作成したこの cdna と sirna の共発現では核内アクチンの増加や F-アクチンの形成が観察されなかったことから sirna による結果が Arp4 のノックダウンにより観察されたものであることが示されたこれらの結果から Arp4 が核内アクチンの重合制御因子であることが示唆された本研究の第 2~4 章で述べたように核内アクチンフィラメントによる転写制御機構が存在するがその上流には Arp4 による核アクチンダイナミクスの制御機構が存在することが新たに示唆されたこのような核内におけるアクチンの重合脱重合メカニズムを解明することで核構造を介したエピジェネティック制御の分子機構が解明できさらにその農学医学への応用も可能になると考えている 10

13 第 6 章総合考察近年遺伝子の初期化の際に核内アクチンフィラメントが形成されこの繊維形成が初期化因子である Oct4 の発現誘導に重要な役割を持つことが報告されたことで核内 F-アクチンの機能が注目され始めている本研究ではヒト培養細胞の核内でアクチン重合を任意に誘導可能な実験系を確立し核内 F-アクチンの機能解明を行うことでヒト培養細胞の核内で形成されたアクチンフィラメントがツメガエル卵を用いた遺伝子の初期化の際と同様に初期化因子 OCT4 の発現を誘導することを明らかにしたこれらの結果は脊椎動物の核内においてもアクチンは重合能を有しておりさらに核内 F-アクチンによる OCT4 発現の誘導機構が進化的に保存されていることを示唆している次にヒト培養細胞による核内 F-アクチンの誘導系を用いて β-catenin に注目し核内 F-actin による OCT4 発現の誘導メカニズムの解析を行った細胞質と同様に核内アクチンフィラメントへのβ-catenin 結合が観察されさらに核内 F-アクチンの形成に依存して増加したβ-catenin は転写活性を誘導することを見い出し核内 F-アクチンが遺伝子の初期化を含む様々なエピジェネティック制御へ関与する可能性が示された (Fig. 12A) 興味深いことに核内 F-アクチンやアクチンバンドルの形成ではゲノムの核内空間配置にも影響が観察された (Fig. 1) ゲノムのエピジェネティック制御においてはクロマチンの構造と核内におけるクロマチンの空間配置が非常に重要であり特に核内クロマチンの空間配置は核内に存在する構造タンパク質の複合体で形成された核骨格によって制御されると考えられているしかし核骨格の構成タンパク質や機能作用機序などの詳細は不明である本研究では核内アクチンフィラメントの形成によるダイナミックなクロマチンの空間配置への影響を観察しており核骨格としてアクチンフィラメントが機能している可能性が示唆された (Fig. 12B) 11

14 薬剤の核内アクチンダイナミクスへの影響として本研究では Lat B が核内アクチン量を増加しさらに OCT4 発現を誘導することが明らかになっている現在遺伝子の初期化実験において初期化効率の向上が課題となっているが今後 Lat B などのアクチン阻害剤による核内アクチンへの効果を解析することで核内アクチンをターゲットにした遺伝子の初期化効率の向上への応用など他分野への貢献も期待できると考えている 12

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19 <References> Clark, T.G., Merriam, R.W. (1977) Diffusible and bound actin nuclei of Xenopus laevis oocytes. Cell, 12, Dopie, J., Skarp, K.P., Rajakylä, E.K., Tanhuanpää, K., Vartiainen, M.K. (2012) Active maintenance of nuclear actin by importin 9 supports transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, Fenn, S., Breitsprecher, D., Gerhold, C.B., Witte, G., Faix, J., Hopfner, K.P. (2011) Structural biochemistry of nuclear actin-related proteins 4 and 8 reveals their interaction with actin. EMBO J. 30, Gurdon, J.B. (1962) The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol., 10, Li, J., Li, J., Chen, B. (2012) Oct4 was a novel target of Wnt signaling pathway. Mol. Cell. Biochem., 362, Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J.B. (2011) Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes Dev., 25, Oma, Y., Harata, M. (2011) Actin-related proteins localized in the nucleus: from discovery to novel roles in nuclear organization. Nucleus, 2, Riedl, J., Crevenna, A.H., Kessenbrock, K., Yu, J.H., Neukirchen, D., Bista, M., Bradke, F., Jenne, D., Holak, T.A., Werb, Z., Sixt, M., Wedlich-Soldner, R. (2008) Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat. Method, 5, Wada, A., Fukuda, M., Mishima, M., Nishida, E. (1998) Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletal protein. EMBO J., 17,

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル

図 B 細胞受容体を介した NF-κB 活性化モデル 60 秒でわかるプレスリリース 2007 年 12 月 17 日独立行政法人理化学研究所免疫の要 NF-κB の活性化シグナルを増幅する機構を発見 - リン酸化酵素 IKK が正のフィーッドバックを担当 - 身体に病原菌などの異物 ( 抗原 ) が侵入すると誰にでも備わっている免疫システムが働いて異物を認識し排除するためにさまざまな反応を起こしますその一つに免疫細胞である B 細胞が