平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 71 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN),Isogenome( 日本ジーン ) または High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche) を用いて DNA を抽出し

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はなさわなか
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1 70 平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 新潟県の日本紅斑熱患者発生地域におけるマダニ保有リケッチア群調査新井礼子, 加藤美和子, 青木順子, 池田菫 1), 田村務,Marcello Otake Sato 2) 1), サトウ恵 Investigation of Rickettsiae in Ticks Collected in the Area around the First Confirmed Case of Japanese Spotted Fever Patient in Niigata Prefecture Reiko Arai,Miwako Kato,Junko Aoki,Sumire Ikeda 1),Tsutomu Tamura,Marcello Otake Sato 2),Megumi Sato 1) Japanese spotted fever patient was confirmed first time in Niigata Prefecture in July 2014.It was suspected that ticks reserving Rickettsia japonica had invaded and lived in Niigata Prefecture,therefore,we made investigation of Rickettsial DNA in ticks collected in the area where Japanese spotted fever patient infected.as a result,535 ticks identified consisted of two genera and four species; Haemaphysalis longicornis,haemaphysalis flava,ixodes ovatus,and Ixodes nipponensis.no ticks were found to be infected with Rickettsia japonica.however,spotted fever group Rickettsiae were found in 7 samples. Keywords:Japanese spotted fever,spotted fever group Rickettsiae,Tick 1 緒言日本紅斑熱はRickettsia japonicaを保有するマダニに刺咬されることによって感染, 発症するリケッチア感染症で, 1984 年に馬原らによって命名された 1). マダニに刺咬後,2 ~8 日後に発熱, 発疹を主訴として発症する. 日本国内では主に西日本で毎年 170 名程度の患者が発生し,2007 年から 2016 年までの10 年間に16 名の死亡者が報告されている 2). これまで東日本の日本海側では患者発生が確認されていなかったが,2014 年には福井県と新潟県で初めて患者が報告された 3,4). 新潟県内で初めて確認された患者は疫学調査の結果, 自宅周辺でマダニに刺咬された可能性が高く, さらなる患者の発生が危惧された. また近年,R. japonica 以外の紅斑熱群リケッチア (Spotted fever group Rickettsiae, 以下,SFGR) の感染による紅斑熱症例が国内で報告されている 5) ことから, 患者発生地域の SFGRの侵淫状況を把握するため, 患者宅周辺におけるマダニの生息状況と保有リケッチアについて調査を行った. 2 材料と方法 2.1 調査地点と調査期間調査地点として患者宅周辺の山野 2ヶ所を選出した.2ヶ所とも標高約 15~20 mで, 地点 Aは患者宅から南東約 2 km の運動公園周囲の緑地帯, 地点 Bは患者宅から西約 7 kmの林道脇草地とし,2015 年 6 月,2016 年 5 月,11 月および2017 年 3 月の計 4 回にわたりマダニを採取した. 2.2 方法 6) マダニの採取はフランネル製の白布を用いた旗ふり法により行い, 白布に付着したマダニをピンセットで回収した. 回収したマダニを採取日, 調査地点, マダニ種, 発育ステージ及び性別ごとに分類し, 一部のマダニ種の鑑別については, 後述の方法でマダニから抽出したDNAを用いて Takanoらの方法 7) により遺伝子学的に同定した. 成虫は1 個体を1 検体, 若虫及び幼虫については5 個体を1 検体としてエタノールで洗浄後, メタルビーズ入りチューブに入れて滅菌リン酸緩衝液またはIsogen Ⅱ( 日本ジーン ) を添加し細胞破砕機を用いてマダニ虫体を破砕後, Table 1. Primer pair used for detection and typing of SFGR Primer Target Gene Refarence Rr17k 1p (forward) Rr17k 539n (reverse) RpCs 780p (forward) RpCs 1258n (reverse) Rr17k 90p (forward) Rr17k 539n (reverse) RpCs 877p (forward) RpCs 1258n (reverse) 17kDa glta 8) 9) RR (forward) RR l (reverse) 190FN1 (forward) 190RN1 (reverse) ompa 9~11) rompb OF (forward) rompb OR (reverse) rompb SFG IF (forward) rompb SFG/TG IR (reverse) ompb 12) 1) 新潟大学医学部 2) 獨協医科大学医学部

2 平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 71 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN),Isogenome( 日本ジーン ) または High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche) を用いて DNA を抽出し,nested-PCR 法により SFGR 遺伝子を検出した. 使用したプライマーは Table 1 のとおりで, まず,SFGR の共通抗原である 17kDa タンパク質をコードする遺伝子領域 ( 以下,17kDa) を検出し, 陽性となった検体について Rickettsia 属共通のクエン酸合成酵素遺伝子領域 ( 以下, glta) を検出した. 両領域とも陽性となった検体を SFGR 陽性とした. さらに,Outer membrane protein A 遺伝子領域 ( 以下,ompA) 及び Outer membrane protein B 遺伝子領域 ( 以下, ompb) の 2 ヶ所について検出し,17kDa,gltA の増幅産物とともにダイレクトシークエンス法により塩基配列を解析してリケッチア種の同定を試みた. 3 結果 3.1 マダニ生息状況 2 地点延べ8 回の調査で採取したマダニは535 個体で, そのうち490 個体 (91.6 %) がHaemaphysalis longicornis( フタトゲチマダニ ) であった. 他にHaemaphysalis flava( キチマダニ )(3.9 %),Ixodes ovatus( ヤマトマダニ )(2.8 %) 及び Ixodes nipponensis( タネガタマダニ )(0.6 %) が採取された. また, 若虫 6 個体については同定することが出来なかった.4 回の調査のうち,2016 年 5 月に採取されたマダニが255 個体と最も多く, 次いで2015 年 6 月の229 個体,2016 年 11 月の46 個体で, この3 回の調査ともH. longicornisの若虫が最も多く採取された.2017 年 3 月にはすでに積雪はなかったが,H. flava 4 個体とI. ovatus 1 個体が採取されたのみであった (Table 2). 3.2 マダニのSFGR 保有状況 535 個体のマダニから抽出したDNA153 検体のうち,7 検体からSFGRを検出した (Table 3).Ixodes 属の2 種では14 検体中 4 検体から検出された.Haemaphysalis 属ではH. Table 2. Identification of the ticks collected in Niigata prefecture. collection date species of tick stage / sex total (%) Jun-15 May-16 Nov-16 Mar-17 adult / M adult / F H. flava 21 (3.9) nymph 1 2 larva 1 H. longicornis adult / M 1 4 adult / F nymph larva (91.6) adult / M 1 I. nipponensis adult / F 1 3 (0.6) nymph 1 adult / M 4 I. ovatus adult / F (2.8) nymph 5 unknoun nymph 6 6 (1.1) total longicornis 117 検体中 2 検体から検出され,H. flava 20 検体からは検出されなかった. 同定できなかったマダニから1 検体検出された.SFGRが検出された7 検体のうち,ompBは全ての検体で検出されたが,ompAは4 検体のみ検出された. 3.3 SFGRの塩基配列解析検出された増幅産物の塩基配列に基づく系統樹解析を行った結果 (Fig.1),R. japonica と一致するものはなかったが,Rickettsia asiaticaと推定された検体が2 検体,Rickettsia monacensisが3 検体, 既知のリケッチア種のいずれかと推定することが出来なかったものが2 検体であった (Table 4). 4 考察マダニは生息の至適温度や湿度, 主たる吸血源動物が種によって異なるため, 生息する地域や環境がそれぞれ異なることが知られている 13). また, これまでに日本紅斑熱の原因であるR. japonicaの検出が報告されているマダニは地域により異なっており, 比較的温暖な地域で生息するHaemaphysalis. hystricis( ヤマアラシチマダニ ),Haemaphysalis formosensis( タカサゴチマダニ ),Haemaphysalis cornigera( ツノチマダニ ), Dermacentor taiwanensis( タイワンカクマダニ ) と, 広く全国に生息するH. longicornis 及びH. flavaである 5). 今回の調査で採取されたマダニのうち,H. longicornis, H. flava,i. ovatus 及びI. nipponensisは全て広く全国に生息している種である. 比較的温暖な地域を好むマダニ種は調査期間を通じて採取されなかったことから, 調査地点の優位種ではないと考えられた. また, 採取したマダニからR. japonicaは検出されなかったため,2014 年に当県で確認された日本紅斑熱患者の媒介マダニ種を推測することは出来なかったが, 採取されたマダニの種類と割合から,H. longicornisまたはh. flavaであった可能性が高いと考えられる. SFGRについては,Haemaphysalis 属よりもIxodes 属から検出される割合が高い傾向にあった.I. nipponensis 2 検体と同定不能マダニ1 検体からR. monacensisと推定されたsfgrが 3 株検出された (Table 4).R. monacensisはヨーロッパでは紅斑熱症の原因として確認されており, 広くIxodes 属から検出されるSFGRである 14).ompAの系統樹において韓国および中国由来の株とヨーロッパ由来の株とではそれぞれ異なるクラスターを形成する (Fig.1C). 今回検出された Table 3. Detection of SFGR's DNA from ticks species of tick no. tested no. positive by nested-pcr H. flava 20 0 H. longicornis I. nipponensis 3 2 I. ovatus 11 2 unknown 2 1 total 153 7

3 72 平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) A B AF R. sibirica U17088 R. parkeri AE R.conorii subs. conorii Malish7 CP R. africae ESF-5 HF R. peacockii CAA501 AF R. honei kDa D16515 R. japonica YH AB R. heilongjiangensis Sendai-16 CP R. raoultii Khabarovsk AB Rickettsia sp. Hf332 T kDa AB Rickettsia sp. Hj126 KJ R. amblyommii isolate IL4 T kDa AB Rickettsia sp. clone: Saga006 CP R. rhipicephali strain HJ-5 M74042 R.australis T kDa T kDa AB R. asiatica IO-1 AB Rickettsia sp. IO-25 GU R. helvetica isolate 102 T kDa T kDa T kDa LN R. monacensis strain IrR Munich AB R. tamurae HM-1 CP R.prowazeki Breinl 0.01 KU R. rickettsii strain InDRE 1098/Mexico/ glt CP R. heilongjiangensis 054 AP R. japonica strain YH-M CP R. raoultii strain Khabarovsk T16-58 glta AY R. principis CP R. amblyommatis isolate An13 T15-110glt DQ R. helvetica AB R. asiatica strain: Huangshan-3(China:Mt.Huang-shan) AB R. asiatica strain: Jeju-2(South Korea: Jeju Island) AB Rickettsia sp. IO-25 AF R. asiatica strain IO-1 /Japan/2001 T glta T glta AB R. tamurae strain HM-1 EU R. monacensis(central China) KC R. monacensis strain CN45kr(South Korea) T16-71 glta T16-54 glta T glta KP R. monacensis strain Est1623 LN R. monacensis strain IrR/Munich/USA U59715 R. prowazekii KC R. typhi 0.01 C D FJ R. parkeri JF R. sibirica DQ R. rickettsii strain 1989CO1 EU R. conorii AP R. japonica strain: YH_M rompa CP R. heilongjiangensis 054 T rompa DQ R. antechini GQ R. tasmanensis strain T152 AH R. raoultii strain Khabarovsk JN Rickettsia sp. GL162 JX R. monacensis strain MT34 (Korea/2012) EU R. monacensis (China: Anhui) KJ R. monacensis strain CHO11 (Korea/2014) T16-71 rompa T16-54 rompa T rompa DQ R. monacensis strain IrR/Munich /USA KT R. monacensis isolate Est1623 /Estonia/ FJ R. monacensis isolate N19 /Italy/2009 DQ R. tamurae strain AT AE R. conorii str. Malish 7 CP R. peacockii str. Rustic AF R. conorii subsp. caspia A-167 HM R. sibirica strain RH05 T rompb T16-58 rompb AP R. japonica strain: YH_M GQ R. tasmanensis strain T152 KJ R. raoultii strain 4 EU R. monacensis strain CN45Kr(South Korea) LN R. monacensis strain IrR/Munich T16-71 rompb T16-54 rompb T rompb DQ R. tamurae strain AT-1 DQ R. asiatica strain IO-1 T rompb T rompb KP R. helvetica isolate Komi 0.02 Fig.1.Phylogenetic trees for identification of species of Rickettsiae based on 450 nucleotide of 17kDa gene(a),382 nucleotide of glta gene(b),540 nucleotide of ompa gene(c),and 426 nucleotide of ompb gene(d).black dots indicate positive samples detected from ticks,and white circles(a,b,and C) indicate R. japonica identified from Japanese spotted fever patient in Niigata Prefecture in 2014.

4 平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 73 Table 4. Presumed species of SFGR in ticks. sample No. date species of tick stage / sex gene ompa ompb species of Rickettsiae T Jun-15 H. longicornis nymph + + unknown T Jun-15 I. ovatus adult / M - + R. asiatica T Jun-15 I. ovatus adult / M - + R. asiatica T Jun-15 I. nipponensis nymph + + R. monacensis T16-54 May-16 I. nipponensis adult / F + + R. monacensis T16-58 May-16 H. longicornis nymph - + unknown T16-71 May-16 unknown nymph + + R. monacensis 株も東アジア地域の株と相同性が高く, ヨーロッパ地域から検出される株とは遺伝子学的に若干の違いが見られる可能性が示唆された. また,I. ovatusの2 検体からR. asiaticaと推定された株が検出された.r. asiaticaは,1993 年にFujitaらが福島県でI. ovatusから分離した株で 15) その後も国内各地で同様の株が分離され, ニホンジカの血液からも検出されている 14). 今回使用したプライマーではompBの領域は検出されたが, ompaについては検出することが出来なかったこともfujita らの報告と同様の結果となった. H. longicornisから検出した2 株はいずれもリケッチア種が推定できなかった (Table 4).17kDaの系統樹 (Fig.1A) においてNo. T15-110と塩基配列が一致したRickettsia sp. clone Saga 006(AB699873) は佐賀県で野生のアライグマの脾臓から検出された株である 16). またNo. T16-58についてはgltAの領域 (Fig.1B) で極東ロシアや中国東北部で Haemaphysalis japonica( ヤマトチマダニ ) から検出されているCandidatus Rickettsia principis(ay578114) 14) と一致した. 同様の株は国内で広く検出されている 17) ことから, これら2 検体と同じようなSFGRは広く国内に生息していると示唆された. この2 検体については, さらに詳細な解析を実施して行く必要があると考えている. 今回は日本紅斑熱患者発生地域で調査を実施したが,R. japonicaは検出されなかった. しかしR. japonicaを媒介すると指摘されているh. longicornis 及びH. flavaが採取されたことや, 病原性が不明ながらもR. japonica 以外の4 種の SFGRが検出されていることから, この地域において紅斑熱が発生する可能性は否定できず, 今後も監視を継続することが必要と考えられた. また, 当県は南北に長く, また海岸部と山間部では気象条件も大きく異なることから, 広く県内で同様の調査を実施し, 新潟県全体のマダニの生息状況と病原体の保有状況を把握する必要がある. 5 結語 2014 年に新潟県内で初めて日本紅斑熱患者の発生を確認したことから, 患者宅周辺の山野においてマダニ生息状況と保有 SFGRの調査を実施した.H. longicornis,h. flava,i. ovatus 及びI. nipponensisの2 属 4 種のマダニと同定不能マダニ計 535 個体が採取された. これらのマダニからR. japonica は検出されなかったが, 他のSFGRが7 検体から検出された. 本報文は, 経常研究新潟県のマダニにおけるリケッチア等の検索 (2015~2016 年度 ) 及び科学研究費助成事業基盤研究 (C) マダニ棲息分布調査と次世代シーケンシングによる保有病原体の網羅的検出 (2016~2018 年度 ) ( 研究代表者 : 新潟大学医学部サトウ恵助教 ) の成果である. 6 文献 1) 馬原文彦, 古賀敬一, 沢田誠三等 : わが国初の紅斑熱リケッチア感染症, 感染症誌,59, (1985). 2) 国立感染症研究所, 病原微生物検出情報月報,38, (2017). 3) 高田伸弘, 清水達人, 五十嵐一誠等 : 福井県南部で初確認できた紅斑熱の速報, 若狭湾地方の環境要因と症例比較から, 衛生動物,69,60(2015). 4) 新井礼子, 加藤美和子, 青木順子等 : 新潟県の日本紅斑熱患者発生地域におけるマダニ保有リケッチア調査, 第 68 回日本衛生動物学会東日本支部大会プログラム講演要旨 2016,29(2016). 5) 安藤秀二, 藤田博巳 : 国内における紅斑熱群リケッチア症を媒介するマダニ類と病原体との多様な関係,Med. Entomol.Zool.,64,5-7(2013). 6) 高田伸弘 : 病原ダニ類図譜, 金芳堂 (1990). 7) Takano A,Fujita H,Kadosato H,et al.:construction of a DNA datebase for ticks collected in Japan:application of molecular identification based on the mitochondrial 16S rdna gene,medical Entomology andzoology,65,13-21 (2014). 8)Mitsuhiro Ishikura,Shuji Ando,Yasuhiro Shinagawa,et al. :Phylogenetic analysis of spotted fever group Rickettsiae based on glta,17-kda,and rompa genes amplified by nested PCR from ticks in Japan,Microbiol.Immunol.,47, (2003).

5 74 平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 9)Russell L.Reggnery,Cathrine L.Spruill,Brian D.Plikaytis :Genotypic identification of Rickettsiae and estimation of interspecies sequence divergence for portion of two rickettsial genes,j.bacteriol,173, (1991). 10)Fourier PE.,Roux V.,Raoult D.:Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rompa,int.j.syst.bacteriol.,48, (1998). 11)Christpher D.Paddok,John W.Sumner,James A.Comer, et al.:rickettsia parkeri:a newly recognized cause of spotted fever rickettsiosis in the United States,CID,38, (2004). 12)Yeon-Joo Choi,Won-Jong Jang,Jong-Hyun Kim,et al. :Spotted fever group and typhus group rickettsioses in humans,south Korea,Emerging Infectious Deseases,11, (2005). 13) 高野愛 : マダニの生態とマダニ媒介感染症, 山口獣医学雑誌,42,1-8(1990). 14 ) Philippe Parola, Christopher D. Paddock, Cristina Socolovschi,et al.: Update tick-bone rickettsioses around the world:a Geographic approach,clin.microbiol.rev., 26, (2013). 15)Hiromi Fujita,Pierre-Edouard Fournier,Nobuhiro Takada, et al.:rickettsia asiatica.sp.nov.,isolated in Japan, International Jounal of Systematic and Evolutionary Microbiology,56, (2006). 16)Kenji Baba,Toshiya Kaneda,Hitoshi Nishimura,Hiroshi Sato:Molecular detection of spotted fever group Rickettsia in feral raccoons(procyon lotor)in the western part of Japan, J.Vet.Med.Sci.,75, (2013). 17)Gaowa,Norio Ohashi,Minami Aochi,et al.:rickettsia in ticks,japan, ,emerging Infectious Disease, 19, (2013).

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本文.indd 岡山県環境保健センター年報 41,77-82,2017 資料日本紅斑熱リケッチアを特異的に検出する Real-timePCR 法に弱反応を示したリケッチア属菌の解析 Genomic Analysis of Rickettsia Reacted Weakly in Specific Real-time PCR Method for Rickettsia japonica 松岡保博, 木田浩司, 谷川徳行,

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平成 28 年度新潟県保健環境科学研究所年報第 32 巻 (2017) 71 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN),Isogenome( 日本ジーン ) または High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche) を用いて DNA を抽出し