ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,01 06(2014) なお本試験は ( 株 ) ヤクルト本社中央研究所ヒト試験倫理審査委員会の承認を受け被験者から試験参加の同意を得て実施された量を測定後 9 倍量の PBS を添加してガラスチューブ内で 10 倍希釈したさらに適宜希釈後適当な

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あけなおいなおか
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1 乳酸菌飲料飲用後の糞便から回収される Lactobacillus casei シロタ株の生菌数測定 - 用量 ( 菌数 ) 依存性の検討 - 乳酸菌飲料飲用後の糞便から回収される Lactobacillus casei シロタ株の生菌数測定 - 用量 ( 菌数 ) 依存性の検討 - 清水健介 * 久代明 * 星亮太郎 ** 野本康二 * Number of Living Lactobacillus casei Strain Shirota (LcS) Recovered from Fecal Samples after Ingestion of Fermented Milk Beverage Containing Different Doses of LcS Kensuke Shimizu*, Akira Kushiro*, Ryotaro Hoshi** and Koji Nomoto* *Yakult Central Institute, Yakult Honsha Co., Ltd Izumi, Kunitachi-Shi, Tokyo Japan **Development Department, Yakult Honsha Co., Ltd Higashishinbashi, Minato-ku, Tokyo Japan Abstract We measured the number of living Lactobacillus casei strain Shirota (LcS) in fecal samples by culture method after ingestion of three different dose beverages of LcS to evaluate dose dependent recovery. Twenty four healthy subjects were recruited and ingested a fermented milk beverage containing low dose LcS (approximately 10 9 cells bottle), medium dose LcS (approximately cells bottle), or high dose LcS (approximately cells bottle) daily for one week followed by a twoweek non-ingestion period in a crossover design. Number of LcS recovered (Log CFU g feces) was 5.50 ± 1.55 (mean ± SD) in the low dose LcS group, 6.26 ± 1.50 in the medium dose LcS group, and 7.14 ± 0.90 in the high dose LcS group. The correlation between the number of LcS recovered from fecal samples and the number of LcS in fermented milk beverages was high and the slope of the regression line was The results suggested that the viable LcS count recovered from fecal samples increases 7.6 fold with a 10-fold increase in ingestion dose. 緒言これまでLactobacillus casei シロタ株 (LcS) の糞便からの回収性試験についてはヤクルト 400 LT 1,2) ヤクルト 400 3) ヤクルト 300V 4) およびジョアプレーンなど 5) の製品を用いた国内試験の他海外においてもベルギー 6) やタイ 7) で行われており糞便からの高い LcS の生菌数を培養法で測定する飲用試験を実施したまた細胞膜の透過性の有無を生菌の判断基準とする propidium monoazide- 定量的 PCR 法 (PMA 法 ) での生菌数測定方法が開発された 8) そこで培養法と PMA 法のデータ比較を行うために PMA 法による生菌数も測定した回収性が報告されているしかしいずれも単一の試験飲料を用いた試験であり異なる菌数の試験飲料での用量依存的な回収性試験は未だ行われていないそこで 24 名の被験者に LcS を約 10 億個含む低菌数飲料約 100 億個含む中菌数飲料および約 1,000 億個含む高菌数飲料を 2 週間の休止期を挟むクロスオーバー形式で1 週間飲用させ糞便から回収される実験方法 1. 被験者被験者は ( 株 ) ヤクルト本社国立事業所 ( ヤクルト中央研究所開発部ヤクルト薬品工業 ) に勤務する健康な男女とし 24 名を募集した男性 24 名から応募がありこれを被験者とした 1

2 ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,01 06(2014) なお本試験は ( 株 ) ヤクルト本社中央研究所ヒト試験倫理審査委員会の承認を受け被験者から試験参加の同意を得て実施された量を測定後 9 倍量の PBS を添加してガラスチューブ内で 10 倍希釈したさらに適宜希釈後適当な糞便懸濁液を Lactitol-LBS Vancomycin (LLV) 寒天培地 5) に塗布し 3 日間好気培養した培地上に生えた LcS 様 2. 食事制限試験期間中 LcS を含む当社製品の他ヨーグルトはっ酵乳およびオリゴ糖添加食品の摂取を禁止したコロニーを計数後特異的モノクローナル抗体を用いた ELISA 法 5) あるいは特異的プライマーを用いた PCR 法 3) にて同定を行った最終的な LcS の生菌数は同定法で陽性を示した割合に総数を掛けて算出した 3. 試験飲料 1 本 67 ml あたり LcS を約 10 億個含む低菌数飲料検出下限値未満の検体に関しては検出下限値 2.4 の半値を代入して平均値を算出した約 100 億個含む中菌数飲料および約 1,000 億個含む高菌数飲料を試験飲料とした高菌数飲料を作製後これを高菌数飲料と同一組成であるが LcS を含まない飲料で 10 倍希釈したものを中菌数飲料 100 倍希釈したものを低菌数飲料とし製造を ( 株 ) ヤクルト本社開発部商品研究課に依頼した 6. PMA 法による LcS の生菌数測定 propidium monoazide (PMA) 処理は藤本らの報告 8) を改良した以下の条件で行った 10 倍糞便希釈液を 200 µl 採取し PBS にて 2 回洗浄した 5 mm PMA 溶液を 2 µl 添加し遮光下で 5 分間氷上静置した光照射装置である LED Crosslinker (TaKaRa) を用いて 4. 試験スケジュール飲用期 1, 2, 3 をそれぞれ 1 週間飲用前観察期および休止期をそれぞれ 2 週間に設定し 6 期 9 週間で試験を実施した ( 図 1) 24 名の被験者を無作為に 8 名ずつ 3 群に分けて低菌数中菌数高菌数飲料をクロスオーバー形式で 1 日に 1 本ずつ飲用させた 10 分間照射後定法により DNA を抽出した定量的 PCR 法を用いた YIF-SCAN により LcS の生菌数を測定したなお PMA 処理したサンプルの DNA 抽出は当日中に行った検出下限値未満の検体に関しては検出下限値 6.0 の半値を代入して平均値を算出した 5. 培養法による LcS の生菌数測定各被験者には各期の終了日あるいはその翌日に採便用サジを用いて小指先程度の便 (0.2 ~ 1.0 g) を嫌気輸送培地 (3 ml) 入りガラスチューブ中に採取させ便重 7. 内在性菌株の菌種同定 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems) を用いたダイターミネーター法により菌株由来の 16S rrna 配列を決定し Ribosomal 2

3 乳酸菌飲料飲用後の糞便から回収される Lactobacillus casei シロタ株の生菌数測定 - 用量 ( 菌数 ) 依存性の検討 - Database Project ( により菌種同定した低かった被験者 5 名高菌数期の菌数が最も低かった被験者も 1 名おりバラツキが認められた被験者 No. 3 では LcS と類似する内在性の L. 8. データの取り扱いおよび統計解析平均値の検定は正規性を考慮し対応のある t 検定もしくは符号付順位和検定を行った帰無仮説の棄却域は両側検定有意水準 5% に設定した本試験では 3 群 3 期の試験であるため低菌数中菌数高菌数飲料の飲用順序の違いが回収性に影響を及ぼす可能性が否定できないそこでラテン方格法により結果に順序効果が生じたかを評価したまた個体差も評価した rhamnosus が試験期間中 5.6 ~ 6.8 の範囲で LLV 培地に検出されたこの被験者の高菌数期では LcS の回収菌数が 7.1 であり内在性の L. rhamnosus の菌数を上回ったため問題なく測定できた中菌数期では LcS は内在性の L. rhamnosus と同程度であったが測定可能であったしかし低菌数期では多数混在する内在性 L. rhamnosus のために LcS を検出することができなかった被験者 No. 10( 低菌数期 ) および No. 20( 中菌数期 ) でも LLV 培地上で全くコロニーが検出されなかった評価項目低菌数中菌数高菌数飲料飲用後に回収される LcS の生菌数帰無仮説 1 H 0 : 高菌数飲料飲用後と中菌数飲料飲用後がその原因については不明である飲用前観察期では 1 名から 2.6 の菌数が検出されたが休止期 1 では LcS は全く検出されなかった休止期 2 においても 24 名中 4 名で平均 2.8 ± 0.2 の菌数がに回収される LcS の生菌数が等しい帰無仮説 2 H 0 : 中菌数飲料飲用後と低菌数飲料飲用後に回収される LcS の生菌数が等しい多重性補正のため Bonferroni の補正を行うすなわち上記の検定で得られた p 値の 2 倍が 0.05 を下回れ y = x R = ば有意な差が得られたと評価した結果 1. 試験飲料中の LcS の生菌数測定培養法による試験飲料 1 本あたりの LcS の生菌数は平均値で低菌数飲料 :13.0 億個 ( 対数値 9.12) 中菌数飲料 :124.0 億個 ( 対数値 10.09) 高菌数飲料: 億個 ( 対数値 10.99) であった g PMA 2. 糞便から回収された LcS の生菌数測定 LcS の生菌数測定結果を表および図 2 に示した 1) 培養法による測定培養法での回収菌数は糞便 1 g 当たり対数値で低菌数飲料飲用期 ( 低菌数期 ):5.50 ± 1.55( 平均値 ± SD) 中菌数飲料飲用期 ( 中菌数期 ):6.26 ± 1.50 高菌数飲料飲用期 ( 高菌数期 ):7.14 ± 0.90 であり用量 ( 菌数 ) 依存性が認められたしかし高菌数期よりも中菌数期の菌数が高かった被験者 3 名中菌数期の菌数が最も g y = x R =

4 ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,01 06(2014) PMA No A Ave SD % 100% 100% 75% 75% 100% B Ave SD % 100% 100% 50% 100% 100% C Ave SD % 88% 100% 50% 63% 88% Ave SD % 96% 100% 58% 79% 96% 検出されたのみであり LcS の摂取を 2 週間中止することにより LcS は体内からほぼ完全に排出されていた 3. 糞便からの回収菌数と試験飲料菌数との関係性回収菌数を縦軸に試験飲料中の生菌数を横軸にプロットし両者の関係性を調べた ( 図 2) 培養法では 2)PMA 法による測定 PMA 法での回収菌数は糞便 1 g 当たり対数値で低菌数期 :5.58 ± 2.30( 平均値 ± SD) 中菌数期:6.90 ± 2.21 高菌数期:8.22 ± 1.31 であり培養法とは異なる方法でも用量 ( 菌数 ) 依存性が確認された回収菌数と試験飲料菌数には非常に高い直線性 (R 2 = 0.995) が認められ回帰直線の傾きは 0.88 であったこのことから 10 倍高い菌数を飲用すると糞便から回収される LcS の生菌数は対数値で倍に増えることが明らかとなったまた PMA 法においても回収菌数と試験飲料菌数には非常に高い直線性 (R 2 = 4

5 乳酸菌飲料飲用後の糞便から回収される Lactobacillus casei シロタ株の生菌数測定 - 用量 ( 菌数 ) 依存性の検討 ) が認められ回帰直線の傾きから 10 倍高い菌数を飲用すると回収菌数は対数値で倍に増えていた 2 名中菌数期で 1 名のみであったのに対し PMA 法では低菌数期で 10 名中菌数期で 5 名高菌数期で 1 名と多かったこれらの検体については検出下限値の半値を代入して平均値を算出しているそのため PMA 4. 統計解析結果 1) 高菌数飲料および中菌数飲料飲用後に回収された LcS の生菌数正規分布から外れていたため符号付順位和検定を行った補正済み p 値はであり高菌数飲料飲用後に回収された LcS は中菌数飲料飲用後に回収された LcS よりも有意に多かった法での低中菌数期のように検出下限値未満の被験者の比率が高い検体では平均値が押し下げられその結果みかけの傾きが大きくなったものと推察される PMA 法で検出された検体のみを培養法と比較すると低菌数期 ( 培養法 :6.16, PMA 法 :7.46; 差 1.30) 中菌数期 ( 培養法 :6.69, PMA 法 :7.94; 差 1.25) 高菌数期( 培養法 :7.20, PMA 法 :8.45; 差 1.25) となりいずれも PMA 法が培養法よりも 1.25 から 1.30 高い値を示した 2) 中菌数飲料および低菌数飲料飲用後に回収された LcS の生菌数こちらも正規分布から外れていたため符号付順位和検定を行った補正済み p 値はであり中菌数飲料飲用後に回収された LcS は低菌数飲料飲用後に回収された LcS よりも有意に多かったこの値を用いた培養法および PMA 法による回収菌数の回帰直線の傾きはそれぞれでありほぼ平行であることが示された PMA は損傷を受けている細胞膜を透過し光照射により DNA と結合するため細胞膜の損傷を持つ細胞では PCR 反応が起こらず定量的 PCR 法と組み合わせることで生菌のみの定量が可能となる藤本らは 3) 順序効果と個体差の検定ラテン方格法で検定したところ p 値はであり飲用順序が LcS の回収性に影響を及ぼしていない事が示された一方個体差については p 値がであり個体間の反応は均一ではない事が示唆されたすなわち被験者間のバラツキが大きい事が統計解析からも確認された PMA 法で測定したB. breve ヤクルト株の糞便からの回収菌数は培養法と比べて約 4 倍高く 8) B. bifidum BF-1 株の回収菌数は培養法と比べて約 50 倍高かったことを報告している 10) 本試験における LcS の PMA 法による回収菌数は培養法の結果よりも 20 倍程度高いものであった PMA 法の値が培養法よりも高い理由として PMA を透過させない程度に細胞膜が正常に保たれているがコロニーを形成できない状態の菌が糞便考察 Christensen らは被験者に Bifidobacterium animalis ssp. lactis (BB-12) を 1 日に 10 8 ~ CFU 摂取させ糞便から回収される生菌数を測定した結果用量依存的であったことを報告している 9) さらに BB-12 の摂取菌数が高くなるに従い糞便から生菌が検出される被験者の割合も高くなることを述べている本試験においても糞便から回収された LcS の生菌数および LcS が検出された被験者の割合が用量依存的に高くなっており同様の傾向が認められた PMA 法での回収菌数と試験飲料菌数との回帰直線の傾きは 1.41 であり培養法での 0.88 よりも大きかった培養法での検出下限値未満の被験者は低菌数期で中に多く存在していることが考えられるまた PMA 法と培養法の生菌数の差はそれぞれの菌の膜透過性の維持能力の差を反映しているとも考えられる生菌の定義は測定法により異なり PMA 法では PMA を透過させない細胞膜の完全性であり培養法はコロニーを形成する能力である定義が異なれば測定値も異なることは当然であるがコロニー形成能を欠くが膜の完全性は保たれている菌がどのような生理活性を有するか今後検討していきたい Cummings らによると健康な英国人の一日当たりの排便量の中央値は 106 g であり 11) 本試験の被験者も同様の排便量であると仮定すると摂取した LcS のうち一日の糞便から回収された培養法での LcS 回収率 5

6 ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,01 06(2014) は低菌数期で 2.5% 中菌数期で 1.6% 高菌数期で 1,2,3,4,5,6,12) 1.5% と計算された以前行われた回収性試験本淳治主任研究員 ( ヨーロッパ研究所 ) に感謝の意を表しますでの回収率は 1.1% から 10% の範囲であり摂取菌数が 10 億個から 1,000 億個の範囲において LcS の回収率は大きく変動しないことが明らかになった被験者 No. 3 の低菌数期では内在性 L. rhamnosus のために LcS を検出することができなかった内在性の L. rhamnosus が検出された場合に限り L. casei と L. rhamnosus を鑑別可能である M-RTLV 培地 6) を使用することも考えられるがいずれにせよ LLV 培地で増殖可能な内在性の Lactobacillus 菌数が高い被験者は回収菌数の測定に影響を及ぼしてしまうため 10 億個程度の LcS しか含まない飲料を用いた飲用試験には不向きであると考えられる参考文献 1) Matsumoto K, Takada T, Shimizu K, Kado Y, Kawakami K, Makino I, Yamaoka Y, Hirano K, Nishimura A, Kajimoto O, Nomoto K. Bioscience Microflora., 25, (2006). 2) Matsumoto K, Takada T, Shimizu K, Moriyama K, Kawakami K, Hirano K, Kajimoto O, Nomoto K. J Biosci Bioeng., 110, (2010). 3) Fujimoto J, Matsuki T, Sasamoto M, Tomii Y, Watanabe K. Int J Food Microbiol., 126, (2008). 4) Shioiri T, Yahagi K, Nakayama S, Asahara T, 要約異なる菌数のLactobacillus casei シロタ株 (LcS) を含有する乳酸菌飲料を飲用後糞便から回収される LcS の生菌数を測定し用量 ( 菌数 ) 依存性を検証した 24 名の被験者を 3 群に分け LcS 低菌数飲料 ( 約 10 億個 ) LcS 中菌数飲料 ( 約 100 億個 ) あるいは LcS 高菌数飲料 ( 約 1,000 億個 ) をクロスオーバー形式で 1 日 1 本ずつ 1 週間飲用させた飲用終了日あるいはその翌日の糞便から回収される LcS の生菌数を培養法で測定した LcS の回収菌数は糞便 1 g 当たり対数値で低菌数飲料飲用期 :5.50 ± 1.55( 平均値 ± SD) 中菌数飲料飲用期 :6.26 ± 1.50 高菌数飲料飲用期:7.14 ± 0.90 であり用量 ( 菌数 ) 依存性が認められたまた飲料 1 本あたりの生菌数は対数値で低菌数飲料 :9.12 中菌数飲料 : 高菌数飲料: であった LcS の回収菌数と飲料に含まれる菌数との回帰直線の傾きが 0.88 であったことから 10 倍高い菌数を飲用すると糞便から回収される LcS の生菌数は対数値で倍に増えることが明らかとなった Yuki N, Kawakami K, Yamaoka Y, Sakai Y, Nomoto K, Totani M. Bioscience Microflora., 25, (2006). 5) Yuki N, Watanabe K, Mike A, Tagami Y, Tanaka, R, Ohwaki M, Morotomi M. Int J Food Microbiol., 48, (1999). 6) Sakai T, Oishi K, Asahara T, Takada T, Yuki N, Matsumoto K, Nomoto K, Kushiro A. Int J Food Microbiol., 139, (2010). 7) Tiengrim S, Leelaporn A, Manatsathit S, Thamlikitkul V. J Med Assoc Thai., 95 Suppl 2, S42-7 (2012). 8) Fujimoto J, Tanigawa K, Kudo Y, Makino H, Watanabe K. J Appl Microbiol., 110, (2011). 9) Christensen HR, Larsen CN, Kæstel P, Rosholm LB, Sternberg C, Michaelsen KF, Frøkiær H. FEMS Immunol Med Microbiol., 47, (2006) 10)Fujimoto J, Watanabe K. Appl Environ Microbiol., 79, (2013) 謝辞試験飲料の製造を担当していただきました齊藤洵己研究員 ( 開発部 ) に深謝いたしますまた PMA 法による LcS の生菌数測定にご協力いただきました緒方清仁研究員松田一乗指導研究員 ( ヨーロッパ研究所 ) 藤 11)Cummings JH, Bingham SA, Heaton KW, Eastwood MA. Gastroenterology., 103, (1992) 12)Spanhaak S, Havenaar R, Schaafsma G. Eur J Clin Nutr., 52, (1998) 6

ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,07 14(2014) らに便秘患者または便が硬めの健常成人を対象とする LcS 含有乳酸菌飲料の摂取試験が国内外で実施され LcS の摂取による硬い便が軟らかくなる作用が報告されている 11~13) 一方過去の LcS の摂取による整腸効果検証試験では

ヤクルト研究所研究報告集第 32 号,07 14(2014) らに便秘患者または便が硬めの健常成人を対象とする LcS 含有乳酸菌飲料の摂取試験が国内外で実施され LcS の摂取による硬い便が軟らかくなる作用が報告されている 11~13) 一方過去の LcS の摂取による整腸効果検証試験では便が硬めの人の排便および腹部症状の改善に対する Lactobacillus casei シロタ株含有乳酸菌飲料の用量反応性の検討 ( パイロット試験 ) 便が硬めの人の排便および腹部症状の改善に対する Lactobacillus casei シロタ株含有乳酸菌飲料の用量反応性の検討 ( パイロット試験 ) 高田敏彦 * 清水健介 * 佐藤美紀子 * 星亮太郎 ** 野中千秋 ** 吉岡真樹 ** 久代明