平成20年度調査研究報告書

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ときなわしあし
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1 平成 20 年度調査研究報告書甘草含有医薬品による偽アルドステロン症発症回避のための新規マーカーの開発名古屋市立大学大学院薬学研究科生薬学分野調査研究者氏名牧野利明名古屋市瑞穂区田辺通 3 1 TEL & FAX 要旨甘草含有製品による偽アルドステロン症の原因は甘草含有成分が腎尿細管上皮細胞内に存在する 11β ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ (HSD)2 を阻害するためである甘草による主要な代謝物であるグリチルレチン酸 (GA) は尿中には排泄されないことから尿細管上皮細胞には取りこまれないものと予想され尿中で検出できるモノグルクロニルグリチルレチン酸 (3MGA) が真の原因成分であるという可能性を明らかにするためにそれら化合物のラット腎スライスへ取り込みについての実験を行ったしかし GA および 3MGA は実験容器や腎スライスへの吸着が無視できないほど大きく腎スライスへの取り込みとして測定された値はその大部分が表面への吸着を評価していることが予想された実験系の改善することによる今後の検討が望まれる 1 調査研究目的 OTC 医薬品として汎用されている漢方製剤生薬製剤にはカンゾウ含有製品による偽アルドステロン症という副作用が知られているその頻度は比較的高くそのような医薬品が適応する訴えを示す患者に対して薬剤師登録販売者が勧める際には必ず考慮するべき事項となっているカンゾウ含有製剤による副作用である偽アルドステロン症は甘草含有成分グリチルリチン (GL) の代謝物であるグリチルレチン酸 (GA) が内因性のコルチゾルを代謝不活化する 11β ヒドロキシ -1-

2 ステロイドデヒドロゲナーゼ (HSD)2 を阻害することにより体内で過剰となったコルチゾルがミネラルコルチコイド受容体に結合することにより発症すると言われているしかし著者はコリン欠乏食飼育による非アルコール性肝障害ラットに GL を投与したときには GL のもうひとつの代謝物である 3-モノグルクロニルグリチルレチン酸 (3MGA) の血中濃度が増加していること尿中へは GL の主な代謝物である GA はほとんど排泄されず 3MGA の排泄が増加することまた肝障害ラットの肝臓において血液中のさまざまな化学物質を胆汁へ排泄する役割を担う ABC トランスポーターのひとつである Mrp2 の発現が減少していること 3MGA は Mrp2 で胆汁排泄される可能性が高いことを明らかにし (Makino et al. 2008) カンゾウよる偽アルドステロン症発症の生体内での原因成分はこれまで推定されていた GA ではなく 3MGA であることが強く示唆する結果を得ているそこで本研究ではその発症と血液中 3MGA 濃度の関連についての基礎的知見を得るために 11β-HSD2 が生体内存在する部位である腎尿細管への GA 3MGA GL の輸送特性を検討し実際に 3MGA が偽アルドステロン症の発症原因となりうるのかどうかの検討を行った 2 調査研究方法 2 1 実験動物 Wistar/ST ラット (9 週齢オス ) を日本 SLC より購入して使用した 2 2 試薬 GL は Calbiochem (San Diego, CA) より 3MGA はナカライテスク ( 京都 ) より GA は東京化成 ( 東京 ) よりウシ血清アルブミン (BSA) はシグマ (St. Louis MO) より購入したものを使用したその他の試薬は特級のものを使用した 2 3 腎スライスへの GL 3MGA GA 取り込み実験 9 週齢のラットをエーテルの過剰麻酔により屠殺し腎臓を摘出した皮膜を剥離後組織切片作成機 ( 夏目製作所 ) を用いて 0.5 mmの厚さの切片を調製し氷冷 Incubation Medium( 以下 -2-

3 IMと記載する 120 mm NaCl 16.2 mm KCl 1 mm CaCl mm MgSO 4 10 mm リン酸緩衝液 ph 7.4) に浮遊させた新しいIMで腎スライスを 10 分間インキュベートした後 IMを吸引除去し適当な濃度のGL 3MGA GAを含むIMまたは 5% BSA 含有 IM( 取り込み溶液 ) を添加した一定時間 37 でインキュベートした後取り込み溶液を吸引除去し氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS 0.15 M ph 7.4) で腎スライスを3 回洗浄後 PBS 中で超音波によりホモジナイズしたホノジネート中のタンパク濃度は BCA TM Protein Assay kit(thermo Scientific Rockford IL) を用いて定量したホモジネート中のGL 3MGA GAは以下に述べるLC/MS/MS 法により測定した 2 4 GL 3MGA GA の定量標準液として正常腎組織ホモジネートに各化合物を溶解させたものを使用したサンプルまたは標準液 50 µlに 1:10 に希釈したスブチリシン (Sigma) を 10 µl 加え 30 分 37 でインキュベートしてタンパク質を分解した内部標準として 1 µg/mlパラヒドロキシ安息香酸 (PHB ナカライテスク ) エタノール溶液を 150 µl 加え激しく撹拌後 -20 で 30 分インキュベートした 15,000 rpm 7 分間の遠心後上清 80 µlをガラスバイアルに入れ LC/MS/MSシステム (Waters Quattro Premier XE, Milford, MA) で分析を行ったカラムはInertosil ODS-3(50 x 2.1 mm 5 µm GLサイエンス東京 ) を使用し移動層には (A) 0.1%AcOH:(B) 0.1%AcOH in CH 3 CNを直線勾配で 50:50 (0 min) 30:70 (6 min) 15:85 (8 min) 50:50 (8.1 min) 50:50 (15 min) の割合で 0.2 ml/minの流速を使用した検出は ESR(+) MRMモードで GL Cone 70V Collision 40eV;3MGA Cone 65V Collision 50eV;GA Cone 80V Collision 40eV;PHB Cone 14V Collision 10eVを使用したピークは GL (2.4 min) 3MGA(5.0 min) GA(7.4 min) PHB(5.4 min) に得られ PHBのピーク面積に対する GL 3MGA GLのピーク面積をプロットした際 3 化合物とも nmの濃度範囲で良好な検量線が得られた 3 調査研究成果 -3-

4 ラット腎スライスに GL 3MGA GA の 5% BSA 溶液を取り込ませたときの濃度依存性および時間依存性の結果を図 2に示す各化合物 5%BSA 溶液をラット腎スライスに添加したときの各化合物の 10 分間取り込み量は濃度依存的に増大し 1000 µm の濃度でも飽和は見られなかったまた各化合物を 100 µm の濃度で一定時間インキュベートしたときの時間依存性試験では添加後 5 分間後で 120 分時の取り込み量の3 分の 2 程度の取り込みが見られ比較的早く飽和に至ることが示されたまたいずれにおいても 3 化合物の間で顕著な差は認められなかった 4 考察甘草による偽アルドステロン症の副作用発症の原因のメカニズムはその含有成分グリチルリチン (GL) の代謝物が腎尿細管細胞内に存在する 11β-HSD2 を阻害することによりコルチゾルの分解が抑制されそれがミネラルコルチコイドレセプターを刺激することにより発症することが明らかになっているがその発症頻度は単なる摂取量と摂取期間によるという説 ( 塚本晶子ら 2007) もある一方で 11β-HSD2 における遺伝子変異が原因であるという説 ( 佐々木尚子ら 2008) や同じように甘草を摂取しているのに偽アルドステロン症を起こした患者と起こさない患者がいて後者においてのみ血中 3MGA 濃度が上昇していたことから患者側に何らかの特異体質が原因であるという説 (Kato H et al. 1995) もある筆者はこれまでの研究からラット肝線維症モデルにおいて血中 3MGA 濃度が上昇することを見いだし肝臓におけるトランスポーター Mrp2 の機能異常時にそのような状態となり偽アルドステロン症患者で見られた現象と肝障害との関連が疑われるデータを得ているまた血中 3MGA 濃度増加に伴い尿中 3MGA 濃度増加が観察された一方で血中 GA 濃度には変化がなく尿中には GA はいっさい検出されなかった (Makino T et al 2008) 偽アルドステロン症の原因となる 11β-HSD2 は腎尿細管細胞内にある酵素であり生体内では尿細管上皮細胞内に入ることができる化合物のみが阻害することが出来ると考えられる GA が尿中からいっさい検出されなかったということは GA は腎臓においては糸球体ろ過も尿細管分泌もされないことを意味する GA はアルブミン結合率が 99.9% 以上と非常に高いことから単純な分子 -4-

5 ふるいにより透過する糸球体基底膜を透過することが出来ないことは十分に説明できるが尿細管分泌もされないならば尿細管上皮細胞の血管側に発現しているトランスポーターの基質として GA は認識されないことが予想される一方 3MGA もアルブミン結合率は 99.9% 以上と高いが尿中から検出されたことから 3MGA は腎尿細管上皮細胞のトランスポーターに基質として認識され尿細管分泌により排泄されるものと予想されるこのことから何らかの特異体質により血中 3MGA 濃度が上昇すると尿細管上皮細胞内に 3MGA が取り込まれ 11β-HSD2 を阻害することにより偽アルドステロン症が発症することが考えられたそこで本研究ではラット腎スライスを使用して GL 3MGA GA の尿細管分泌の比較を行った腎スライスを用いた薬物の取り込み実験は尿細管上皮細胞の尿管側が閉じることから血管側から上皮細胞内への化合物の取り込みについて試験する際に汎用されている方法である ( 楠原洋之 2003) 本実験を用いて期待されることは GL および 3MGA には尿細管上皮細胞にそれらを基質として認識するトランスポーターにより取り込まれるが GA にはそれがないため取り込みされないか GL または 3MGA と比較して取り込み量が低いことである予備実験で GL 3MGA GA を IM に溶解させて腎スライスに取り込ませたところ GA が最も強く次いで 3MGA GL という順でよく尿細管細胞に取り込まれるという結果が得られていたがその順番は脂溶性の化合物ほど細胞膜を透過しやすいという ph 分配仮説に従う当然の結果であったそれら3 化合物は血清アルブミンとの結合率が極めて高く血液中から組織への化合物の移行ではトランスポーターを介して輸送されない限りは細胞膜を透過することは考えにくい従って血液の組成に 5% アルブミンに化合物を溶解して腎スライスへの取り込み実験を行ったしかし結果は予想と反して GL 3MGA GA ともに同程度に腎スライスに取り込まれるという結果が得られた ( 図 1) 濃度依存性を評価する実験結果では 1000 µm まで直線的な取り込みが見られトランスポーターで輸送される際の特徴である飽和現象は認められなかったまた時間依存性を評価する実験結果では 5 分間という短い時間で急速に取り込みが行われその後は緩やかに増加して -5-

6 ほぼ飽和に至るという結果が得られた本実験を行うにあたり LC/MS/MS 分析条件を決定する上で最も困難だったのは GA 3MGA GL のバイアルへの吸着をいかに回避するかであったこれら3 化合物のアルブミン結合率が極めて高いことは前述したが LC/MS/MS 分析のバリデーションを行う課程で低濃度領域ではプラスチックバイアルへも吸着が無視できないことが明らかとなり酸性下でガラスバイアルを使用することによりそれを回避して安定して測定できる分析条件を開発したのだがそのようなさまざまな物質に吸着しやすいというそれら3 化合物の性質は腎スライスを用いた取り込み実験でも決して無視できないものと推測されたすなわち今回測定した GA 3MGA GL の腎スライスへの取り込み量は実際には尿細管上皮細胞内に取り込まれた化合物を測定したのではなく腎スライスの表面に化合物が吸着しているものを測定しているという可能性が考えられたその可能性を考慮すると濃度依存性実験でトランスポーター輸送の特徴である飽和現象が見られなかったことまた時間依存性実験で 5 分間という短い時間でほぼ飽和に至るという結果が矛盾なく説明できる従って腎スライスを用いた方法では GA 3MGA GL のようなアルブミン結合率が高くさまざまな物質に吸着しやすい化合物のトランスポーターを介した輸送を評価することは困難であると考えられた従って今後の検討として腎スライスを用いた実験では GA 3MGA GL の 11β-HSD2 を阻害実験を行い生体に近い環境でのそれら3 化合物の阻害力価を測定するとともにそれらを輸送すると予想される有機アニオントランスポーターの遺伝子を腎尿細管上皮細胞に組み込んだ時の輸送実験を行いそのメカニズムを明らかにする実験が求められる 5 まとめ偽アルドステロン症発症の原因としてグリチルリチンおよびその代謝物の腎尿細管上皮細胞への取り込みを評価したがラット腎スライスを用いた方法では測定が困難であることが明らかになった今後遺伝子組み替え細胞を用いた実験など新たな方法による検討が求められる -6-

7 6 調査研究発表なし 7 引用文献 Kato H, Kanaoka M, Yano S, Kobayashi M. 3-Monoglucuronyl- glycyrrhetinic acid is a major metabolite that causes licorice-induced pseudoaldosteronism. J Clin Endocrinol Metab 1995;80: Makino T, Ohtake N, Watanabe A, Tsuchiya N, Imamura S, Iizuka S, Inoue M, Mizukami H. Down-regulation of a hepatic transporter Mrp2 is involved in alteration of pharmacokinetics of glycyrrhizin and its metabolites in a rat model of chronic liver injury. Drug Metab. Dispos. 36(7): , 2008 楠原洋之. 薬物トランスポーター膜輸送の基礎から薬物動態生理的役割まで (6) 腎臓脳 ( 血液脳関門血液脳脊髄液関門 ) における有機アニオンの排泄メカニズムとしての Organic Anion Transporter (OAT) の役割 (1). Drug Metab Pharmacokinet 2003;18:11-4. 佐々木尚子西尾久英高岡裕李明鎮中川加奈子佐々木知啓薄木成一郎西本隆平井みどり. 甘草による偽アルドステロン症発症に関連すると思われた遺伝子変異について. 第 25 回和漢医薬学会大会講演要旨集 2008;93. 塚本晶子, 本間真人, 神林泰行, 木津純子, 幸田幸直. 芍薬甘草湯誘因性低力リウム血症発現に及ぼす種々の併用薬の影響. 医療薬学 2007;33:

8 H 3 C COOH O H CH 3 RO H 3 C CH 3 CH 3 GL 3MGA GA R = glucua-glucua R = glucua R = H 図 1 GL 3MGA GA の構造式 -8-

9 GL 3MGA GA GL 3MGA GA éêçëçûç éûä ÅiminÅj 図 2 GL 3MGA GA の腎スライスへの取り込み各化合物の 5%BSA 溶液をラット腎スライスに取り込ませた左 : 各化合物各濃度の溶液をを 10 分間腎スライスに取り込ませたときの濃度依存性実験結果右 :100 µm の濃度の各化合物 5%BSA 溶液を一定時間腎スライスに取り込ませたときの時間依存性実験結果 -9-

10 Development of marker compound for pseudoaldosteronism by OTC drug containing licorice Toshiaki Makino Department of Pharmacognosy Graduate School of Pharmaceutical Sciences Nagoya City University 3-1 Tanabe-Dori, Mizuho-ku, Nagoya, Japan Tel & Fax Abstract The mechanisms of pseudoaldosteronism induced by OTC drug containing licorice was that some compounds containing licorice inhibit 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) II which is in renal tubular epithelial cells. Since glycyrrhetinic acid (GA), the major metabolite of licorice compounds, is not eliminated into urine and is predicted not to be penetrated through tubular epithelial cells, 3-monoglucuronyl glycyrrhetinic acid (3MGA), which is another metabolite and is eliminated into urine, is estimated to be a true origin for pseudoaldosteronism by licorice. Then, we evaluated the uptake pattern of GA and 3MGA into rat kiney slice to identify the transporter that transport these compounds from blood into the inside of tubular epithelialil cells. However, these compounds highly adsorbed onto many substances, and we could not measure the true uptake of these compounds in tubular epithelialium. Further experiments are demanded. -10-

PRESS RELEASE 平成 31 年 2 月 6 日名古屋市立大学事務局企画広報課広報係名古屋市瑞穂区瑞穂町字川澄 1 TEL: FAX: MAIL: HP UR

PRESS RELEASE 平成 31 年 2 月 6 日名古屋市立大学事務局企画広報課広報係名古屋市瑞穂区瑞穂町字川澄 1 TEL: FAX: MAIL: HP UR PRESS RELEASE 平成 31 年 2 月 6 日名古屋市立大学事務局企画広報課広報係 467-8601 名古屋市瑞穂区瑞穂町字川澄 1 TEL:052-853-8328 FAX:052-853-0551 MAIL: ncu_public@sec.nagoya-cu.ac.jp HP URL:http://www.nagoya-cu.ac.jp/ 漢方薬による副作用の原因物質を発見副作用発症の予防