論文内容要旨豚マイコプラズマ性肺炎 (MPS) 病変末梢血免疫能選抜純粋種豚及びそれらの交雑豚の MPS 抵抗性と免疫特性に関する研究東北大学大学院農学研究科資源生命科学専攻陆拾柒指導教員佐藤正寛教授

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しまなさんきち
5 years ago
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2 論文内容要旨豚マイコプラズマ性肺炎 (MPS) 病変末梢血免疫能選抜純粋種豚及びそれらの交雑豚の MPS 抵抗性と免疫特性に関する研究東北大学大学院農学研究科資源生命科学専攻陆拾柒指導教員佐藤正寛教授

3 緒論近年日本における養豚業は飼養戸数の減少と同時に規模拡大と集約的飼育が行われる一方で飼育密度が高まることに伴い感染症の発生増加が養豚経営者にとって大きな問題となっているこうした疾病に対してワクチン接種投薬公衆衛生隔離及び特定病原菌フリー (SPF) 化などの対策が実施されているが衛生管理に伴う設備投資とワクチネーション等における治療コストの増加が養豚生産者にとって大きな経済的負担となっている薬剤に依存せず家畜自身の抗病性を遺伝的に高める育種改良はこれらの諸問題を解決できる一つの方策であり動物遺伝育種学領域の研究者にとって挑戦すべき大きな課題である抗病性育種のためには直接病原菌に家畜を暴露する条件下での選抜または抗病性と密接に関連する免疫指標に基づく選抜のいずれかによる方法が考えられる従来末梢血免疫能を選抜指標とした試験の取り組みが行われてきたが病原菌に家畜を暴露する方法による育種改良の取り組みは皆無であったこうした背景の下で宮城県畜産試験場では常在菌であるマイコプラズマハイオニューモニエの感染による肺炎 (MPS) 病変を選抜指標としランドレース種豚について 5 世代の選抜育種を行い MPS 肺病変が少ない系統 (L) を造成した一方日本ハム中央研究所では末梢血免疫能を選抜指標とし大ヨークシャー種について 6 世代の選抜育種を行い免疫能の高い系統 (W) を造成したいずれも東北大学大学院農学研究科動物遺伝育種学分野との共同研究である L については一部の免疫特性が調べられているが詳細な免疫特性は未解明であるまた W についても MPS 抵抗性及び詳細な免疫特性は明らかでないさらに純粋種で改良された抗病性や免疫能の遺伝的能力が雑種第代及び三元交雑豚でどの程度発揮されるかについては不明である本研究では第章では MPS 肺病変選抜ランドレース種と免疫能選抜大ヨークシャー種について第章と第章ではこれらの両選抜純粋種豚の交雑 F 豚及び三元交雑豚を対象とし MPS ワクチンまたは羊赤血球 (SRBC) 接種に対する末梢血唾液及び免疫関連組織の各免疫形質及び内分泌ホルモンなどと屠畜時点での MPS 肺病変について無選抜の純粋種やそれらの交雑豚と比較検討したまた第章では MPS 肺病変選抜ランドレース種維持集団の末梢血免疫形質と肺病変との関連性を明らかにするため遺伝的パラメーターの推定を行い MPS 抵抗性に関して有効な免疫指標を探索したさらに MPS 抗病性に関わる免疫指標について総合考察を行った

4 第章 :MPS 肺病変選抜ランドレース種及び末梢血免疫能選抜大ヨークシャー種豚の肺病変と免疫特性第節 :MPS 肺病変選抜ランドレース種豚の肺病変と免疫特性 MPS 肺病変選抜ランドレース種 (L) の MPS 抵抗性と免疫学的特徴を明らかにするために無選抜ランドレース種 (L) と比較した試験は時期と対照となる豚の系統を変えて度繰り返し行った試験設計と測定方法は以下の通りである MPS ワクチン二次接種日を日とし -7 7 日の計 5 回供試豚より継時的に採血を行い -7 と日において採血後に MPS ワクチンを接種した日目の採血後に屠畜し肺病変検査及び肺と腸管組織のサンプリングを行った総白血球数は全自動血球計数器で測定し食細胞活性はケミルミネッセンス法免疫担当細胞割合はフローサイトメトリー法抗体産生量は ELISA 法サイトカイン発現量は ELISA 及び Rel-time PCR 法ホルモン濃度は RIA 法でそれぞれ測定した末梢血免疫応答の継時的データ MPS 肺病変スコア ADG 免疫組織中サイトカイン及び TLRs の発現などについては SAS プログラムを用いて分散分析と Tukey の多重比較検定を行った回目の試験では L と L 豚を各頭用いた ( 平均 7 週齢 7kg) その結果選抜による遺伝的抵抗能力を反映し L の肺病変スコアは L 豚に比べて有意に少なかった ( 図 A ) L 豚の末梢血中 B 細胞割合が L に比べて有意に減少したのに対しミエロイド顆粒球の割合は有意に増加した ( 図 B 図 C ) また末梢血中成長ホルモン(GH) は L が L 豚に比較して日目に有意に減少した ( 図 B ) IFN-γ 蛋白質発現は L が L 豚に比べて日目で有意に増加した ( 図 D ) 回目の試験では L と L 豚を各 6 頭用い ( 平均 6 週齢 66kg) 回目の試験と同様の調査を行ったその結果 L 豚が L 豚より有意に少ない肺病変スコアを示した ( 図 A ) B 細胞割合は L が L 豚に比べて有意に減少し ( 図 B ) また MPS 特異的 IgG 産生も抑制された ( 図 D) GH の濃度も L 豚が L 豚に比較して有意に抑制された ( 図 B ) 一方 NK 細胞割合唾液中 IgA 濃度及び IFN-γ mrna 発現は L が L 豚に比較して有意に増加した ( 図 C ; 図 D ) 以上の結果から L 豚が MPS 抵抗性に優れていることが確認されまたワクチン刺激に対して液性免疫能が抑制され自然細胞性及び粘膜性免疫能が活性化されることが明らかとなった第節 : 末梢血免疫能選抜大ヨークシャー種豚の肺病変と免疫特性

5 免疫能選抜大ヨークシャー種 (W) と無選抜大ヨークシャー (W) を各頭 ( 平均 8 週齢 68kg) 用い MPS 肺病変と免疫学的特徴を調べた試験計画測定項目及び統計解析は第節と同じであるその結果 MPS 肺病変スコアは W が W 豚に比べて相対的に高い値を示した ( 図 A ) 末梢血中 NK 細胞と T 細胞 (CD + CD - CD8 + と CD + CD + CD8 - T 細胞 ) の割合は W が W 豚と比較して有意に多かった ( 図 B) 一方食細胞活性と抗原特異的 IgG 産生量は W が W 豚に比較して有意に高く唾液中 IgA は有意に低かった ( 図 A ) これらの結果は末梢血免疫能を高める方向への選抜は MPS 肺病変抵抗性に対して必ずしも有効ではないことを示唆しているまた W 豚はワクチン接種に対する液性免疫能と自然免疫能が活性化され粘膜免疫能が抑制されることが示唆された第章 :MPS 選抜ランドレース種と免疫能選抜大ヨークシャー種の交雑 F の肺病変と免疫特性本章では両選抜純粋種 (L と W) の MPS 抗病性や免疫能力がそれらの雑種第代にどの程度引き継がれるかを検討した試験は交雑方法を変えて度行った回目の試験では L(6 週齢 6kg) と W(8 週齢 7kg) 豚を各 6 頭それらの雑種第代 LW(6 週齢 7kg) と一般雑種第代 LW( 週齢 6kg) を各頭 ( 合計 6 頭 ) 用いた試験計画測定項目及び統計解析は第章と同じであるその結果 MPS 病変スコアについて系統間で有意差は認められなかった ( 図 A ) 末梢血中抗原特異的 IgG 産生量は W が他の系統より有意に増加した ( 図 A ) IL-7 発現量は L 豚が他の系統より有意に増加した ( 図 A ) GH 濃度は LW 豚が L W と同じく LW より低い増加を示した ( 日目 )( 図 A ) 回目の試験では L LW LW 及び LW の系統 ( 平均週齢体重 65kg) をそれぞれ 6 6 及び頭ずつ用いた試験計画測定項目及び統計解析は第章と同じであり異物として SRBC を接種したその結果 MPS 病変スコアは LW と比べ L LW 及び LW 豚は相対的に少なかった ( 図 B ) SRBC 刺激後 LW と LW は L と同様に末梢血中単球数が増加した ( 図 C ) のに対し B 細胞 T 細胞数 ( 図 C ) SRBC 特異的 IgG 濃度 ( 図 B ) 及び IL- 発現 ( 図 C ) が減少したさらに LW と LW の唾液中 IgA は L 豚に比べて低い値を示した ( 図 B ) 以上の結果から L 豚の MPS 病変抵抗性及び両選抜純粋種のいくつかの免疫学的特徴は交雑第代に引き継がれることが示唆された

6 第章 : 抗病性三元交雑豚の肺病変に関わる免疫特性本章では L と W の MPS 抵抗性と免疫能が三元交雑豚 (LWD) にどの程度伝えられるかを検討した材料として L( 週齢 8kg) LWD(LW 雌デュロック種雄 (D): 週齢 kg) と一般の三元交雑豚 (LWD: 週齢 8kg) を各頭合計 6 頭を用い MPS 肺病変と免疫特性を比較した試験計画測定項目及び統計解析は第章と同じであるその結果 MPS 肺病変は LWD が L と LWD の中間値を示した ( 図 A ) 各種免疫細胞割合において LWD に対する L の影響は小さかった ( 図 B) 抗原特異的 IgG 産生量は LWD 豚が L 豚と同様に LWD より有意に低い値で推移した (-7 及び日目 ) が日目に L 豚より有意に増加した ( 図 A ) 更に LWD は L と LWD より唾液中 IgA 分泌量が高く推移した ( 図 A ) 一方免疫細胞機能で L 豚が LWD 豚に強く影響しており末梢血中 IFN-γ IL- IL-6 及び TGF-β mrna 発現量は LWD が L 豚と同じ傾向を示し LWD より有意に増加した ( 図 C) 以上の結果から LWD は LWD 豚と遺伝的に異なること L の MPS 病変抵抗性及び両選抜種の免疫学的特性が三元交雑豚に影響していることが示唆された第章 :MPS 抵抗性を改良のための免疫指標に関する遺伝的パラメーターの推定本章では選抜効率を高める観点から豚の成長の早い時期での選抜指標探索のため MPS 病変選抜 L の維持集団での子豚約頭に対し 8 週齢時で採血を行い末梢血中各種サイトカイン濃度を調べ選抜集団の MPS 肺病変測定値と血縁情報をもとに MPS 肺病変と各種サイトカイン濃度の遺伝的パラメーターを推定した測定項目の IFN-γ と IL-7 の濃度は ELISA Development Kit により IL- IL-6 IL- IL-β 及び IFN-α の濃度は PrortPlex TM Immunossy Kit により測定した遺伝的パラメーターの推定はアニマルモデル REML 法により VCE6 プラグラムを用いて行ったその結果 ( 表 ) MPS 肺病変は低い遺伝率を示した.(.6) 一方 MPS 肺病変は IL-7 濃度と高い負の遺伝相関 (-.6±.) を示した以上の結果から IL-7 濃度の高い方向への選抜が MPS 抵抗性の選抜指標として有効である可能性が示唆された

7 総括. 純粋種豚の MPS 抵抗性と免疫特性 MPS 肺病変を選抜指標とした L について MPS 病変抵抗性が強いという特徴を確認したしかし W について MPS 抵抗性は認められなかった W で採用された免疫形質 ( 食細胞活性補体別経路活性及び豚丹毒特異的 IgG) は予め MPS 病変に対する有効性が確認された免疫形質ではないため今後 MPS 病変と密接に関連する免疫形質を選抜指標とすることで MPS 病変を低下させる可能性が期待できる免疫特性として L 豚は L 豚に比べて IFN-γ 発現と IgA 産生を特徴とした細胞性及び粘膜性免疫能が活性化され B 細胞と IgG 産生を特徴とした液性免疫能が抑制されるまた GH の分泌も抑制されストレスに対して抵抗性が強い可能性が示唆された一方 W は W 豚に比べて IgG 産生と食細胞活性を特徴とした液性及び自然免疫能が活性化され IgA 産生を特徴とした粘膜免疫能が抑制される従って抗原特異的 IgG を多く産生することは MPS 肺病変を悪化させる可能性があること及び IFN-γ と IgA は MPS 抵抗性に関して重要な指標であることが考えられた. 交雑豚の肺病変と免疫特性回の試験から MPS に対する L 豚の遺伝的抵抗性が交雑 F に影響することが示唆されたまた両選抜純粋種 (L と W) のいくつかの免疫応答が交雑 F で発現したことが確認された以上のことより純粋種での選抜により抗病性雑種第代豚を生産できる可能性が考えられたさらに三元交雑豚でも LWD 豚の MPS 病変スコアは L と LWD 豚の中間値を示し L の選抜による MPS の抵抗性が三元交雑豚でも発現することが示唆された一方 LWD の末梢血中の IFN-γ IL- TGF-β 及び IL-6 発現は L と同じ傾向を示し LWD に比べて有意に増加するなど免疫細胞機能で LWD に対する L 豚の影響を示す結果が得られ L 豚の免疫学的特徴が三元交雑豚へ発現することが示唆された一方 LWD の抗原特異的 IgG 産生量は L より有意に増加したことから LWD は遺伝的に W の影響を受けた可能性が考えられた. 免疫形質の遺伝的パラメーターの推定 MPS 肺病変と末梢血 IL-7 濃度は高い負の遺伝相関 (-.6±.) を示した Sto ら () は L の系統造成過程の肺病変と血しょう中 IL-7 及び IFN-γ 濃度との関連を調べそれぞれ負の高い遺伝相関 (-.86±.) と中程度の負の遺伝相関 (-.5±.9) を報告し 5 世代の選抜を通して IL-7 と IFN-γ の推定育種価は有意に増加したことを報告している以上の結果から末梢血 IL-7 と IFN-γ を高い方向に選抜することは MPS 肺病変の選抜指標として有効であると考えられた 5

8 以上の結果から免疫能を高めることによる間接的な選抜育種より MPS 病変を直接低下させる選抜育種の有効性が明らかとなった養豚産業では交雑生産が一般的だが MPS 病変と免疫能の詳細な解析から純粋種の抗病性に対する選抜が交雑豚での抗病性に有効であることが明らかとなった家畜の抗病性育種をすすめる上で抗病性や免疫形質などの多くの形質は遺伝率が低く選抜育種が困難だが抗病性形質と高い遺伝相関を示す容易に測定できる形質を探索し選抜形質とすることが選抜の精度と効率を高める上で重要だと考えられるこれらの観点から本研究で得られた成果をもとに豚集団の MPS に対する遺伝的抵抗性を高めるためには液性免疫の指標である IgG 産生を抑制し細胞性免疫の指標である IFN-γ 発現と粘膜免疫の IgA さらには末梢血 IL-7 を高める方向への選抜が有効であると結論づけた 6

9 ng/ml ng/ml % of ells in ul of whole loo % of ells in ul of whole loo % in lung % in lung 図表 5 MPS lesion sores MPS lesion sores L L L L 図 A. MPS 病変選抜ランドレース L と無選抜ランドレース L 豚の MPS 肺病変スコアの回目の試験 () と回目の試験 ()( 平均値 ± 標準誤差 ) の結果は採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 9 6 B ells B ells L L GH L L GH L L -7 7 L L 図 B. MPS 病変選抜ランドレース L と無選抜ランドレース L 豚の末梢血 B 細胞割合の回目の試験 () と回目の試験 () 成長ホルモン濃度の回目の試験 () と回目の試験 () の変化 ( 平均値 ± 標準誤差 ) は採血日に系統間で有意差があることを示す ( <.5) 7

10 Reltive inex IgA/protein ( ) pg/ml IFN-γ/β-tin % of ells in ul of whole loo % of ells in ul of whole loo % of ells in ul of whole loo 6 5 Myeloi Grnuloyte L L NK ells -7 7 L L -7 7 L L 図 C. MPS 肺病変選抜ランドレース L と無選抜ランドレース L 豚の末梢血ミエロイド () 顆粒球 () 及び NK 細胞 () 割合 ( 平均値 ± 標準誤差 ) は採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 8 6 IFN-γ..9.6 IFN-γ L L Mhp-speifi IgG -7 7 L L Slivry IgA -7 7 L L -7 7 L L 図 D. MPS 肺病変選抜ランドレース L と無選抜ランドレース L 豚の末梢血中 IFN-γ 蛋白質発現 () と mrna 発現 () 抗原特異的 IgG 濃度 () 及び唾液中 IgA 濃度 () の結果 ( 平均値 ± 標準誤差 ) は採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 8

11 % of ells in μl of whole loo % of ells in μl of whole loo % of ells in μl of whole loo % of ells in μl of whole loo Reltive inex IgA/protein % in lung RIU( 5 ) 5 MPS lesion sore 5 8 Phgoyte tivity W Mhp-speifi IgG W W W Slivry IgA W W -7 7 W W 図 A. 免疫能選抜大ヨークシャー種 W と無選抜大ヨークシャー種 W 豚の MPS 肺病変スコア () 食細胞活性() 抗原特異的 IgG 濃度 () 及び唾液中 IgA 濃度 ()( 平均値 ± 標準誤差 ) は採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 8 6 T ells CD + CD - CD W W CD + CD + CD W W NK ells W W W W 図 B. 免疫能選抜大ヨークシャー種 W と無選抜大ヨークシャー種 W 豚の末梢血中 T 細胞 () CD + CD - CD8 + () CD + CD + CD8 - () 及び NK() 細胞割合 ( 平均値 ± 標準誤差 ) の継時的変化は採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 9

12 Reltive inex IgA/protein % of Lungs pg/ml ng/ml % in lung Reltive inex MPS lesion sores 6 Mhp-speifi IgG LW LW L W IL LW LW L W GH LW LW L W LW LW L W 図 A. 雑種 (F)LW と LW MPS 病変選抜 L と免疫能選抜 W 豚の MPS 肺病変スコア () 抗原特異的 IgG 濃度 () IL-7 発現 () 及び成長ホルモン濃度 ()( 平均値 ± 標準誤差 ) アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す(<.5) MPS lesion sores 9 6 L LW LW LW SRBC-speifi IgG 5 Slivry IgA L LW LW LW 図 B. MPS 病変選抜 L 雑種 (F) の LW LW と LW 豚の MPS 肺病変スコア () 抗原特異的 IgG 濃度 () 及び唾液中 IgA() 濃度 ( 平均値 ± 標準誤差 ) アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) L LW LW LW

13 Reltive inex( ) IgA/protein % of lung Cells in μl of whole loo pg/ml Cells in μl of whole loo Cells in μl of whole loo Monoyte 5 5 B ells -7 7 L LW LW LW T ells L LW LW LW IL L LW LW LW L LW LW LW 図 C. MPS 病変選抜 L 雑種 (F) の LW LW と LW 豚の末梢血中単球 () B () T() 及び IL- 蛋白質濃度 ()( 平均値 ± 標準誤差 ) の継時的な変化アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5) 5 MPS lesion sores L LWD LWD Mhp-speifi IgG 8 Slivry IgA L LWD LWD -7 7 L LWD LWD 図 A. MPS 病変選抜 L 三元交雑系の LWD と LWD 豚の MPS 肺病変スコア () 抗原特異的 IgG 濃度 () 及び唾液中 IgA() 濃度 ( 平均値 ± 標準誤差 ) アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5)

14 IL-/β-tin TGF-β/β-tin IFN-γ/β-tin IL-6/β-tin % of ells in μl of whole loo % of ells in ul of whole loo % of ells in μl of whole loo % of ells in μl of whole loo 5 Myeloi 5 Grnuloyte L LWD LWD T ells -7 7 L LWD LWD B ells L LWD LWD -7 7 L LWD LWD 図 B. MPS 病変選抜 L 三元交雑系の LWD と LWD 豚の末梢血中ミエロイド () 顆粒球 () T() 及び B() 細胞数 ( 平均値 ± 標準誤差 ) の継時的な変化アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5).8 IFN-γ.5 IL L LWD LWD IL L LWD LWD TGF-β L LWD LWD L LWD LWD 図 C. MPS 病変選抜 L 三元交雑系の LWD と LWD 豚の末梢血中 IFN-γ() IL-6() IL-() 及び TGF-β() の mrna 発現 ( 平均値 ± 標準誤差 ) の継時的な変化アルファベット文字の違いは採血日に系統間で有意差があることを示す (<.5)

15 表. L 豚の選抜形質と各種サイトカインの遺伝率及び遺伝相関形質単位頭数 IL- IL-6 IL- IL-7 IL-β IFNα IFNγ 遺伝率 DG g/y 9.±..9±.8 -.±. -.8±.6.98±.6 -.5± ±..6±.6 MPS % 67.7±. -.6±.79 -.±.5 -.6±. -.8±.7 -.±.8 -.7±.6.±.6 BF m ±..5±.5.8±. -.5±.6.±. -.7±.5 -.8±.5.66±.5 CORT ugl 97.6±.7.8±.5 -.± ±..±.8 -.7± ±.7.±.5 IL- pg/ml 65.±.58 IL-6 pg/ml.7±. IL- pg/ml 7.9±. IL-7 pg/ml 9.5±.6 IL-β pg/ml 8.±.5 IFNα pg/ml 9.±.7 IFNγ ng/ml.±. DG: 一日平均増体量 ; MPS: 豚マイコプラズマ性肺炎 ; BF: 背脂肪厚 ; CORT: コルチゾール濃度

豚における簡便法を用いた産子数の遺伝的改良量予測 ( 独 ) 農業食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所石井和雄豚の改良にはある形質に対し優れた個体を選抜してその個体を交配に用いることでより優れた個体を生産することが必要である年あたりの遺伝的改良量は以下に示す式で表すことができる年

豚における簡便法を用いた産子数の遺伝的改良量予測 ( 独 ) 農業食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所石井和雄豚の改良にはある形質に対し優れた個体を選抜してその個体を交配に用いることでより優れた個体を生産することが必要である年あたりの遺伝的改良量は以下に示す式で表すことができる年あたりの遺伝的な改良量 = 選抜強度選抜の正確度遺伝分散の平方根 / 世代間隔この式によると年あたりの改良量を増すためには

論文内容要旨 豚マイコプラズマ性肺炎 (MPS) 病変 末梢血免疫能選抜 純粋種豚及びそれらの交雑豚の MPS 抵抗性と免疫特性 に関する研究 東北大学大学院農学研究科資源生命科学専攻 陆拾柒 指導教員 佐藤正寛教授

論文内容要旨豚マイコプラズマ性肺炎 (MPS) 病変末梢血免疫能選抜純粋種豚及びそれらの交雑豚の MPS 抵抗性と免疫特性に関する研究東北大学大学院農学研究科資源生命科学専攻陆拾柒指導教員佐藤正寛教授