研究成果報告書(基金分)

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せぴあしげい
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2 様式 C-19 F-19 Z-19( 共通 ) 1. 研究開始当初の背景漢方における問診のひとつの情報として体から発するにおいは重要なシグナルである皮膚や呼気などから排出される物質の中から病気を示すにおい物質を特定できればにおいセンサーによる非侵襲性の病気診断が可能となる実際に Novak らの報告では Ⅰ 型糖尿病患者の呼気中の硝酸メチルと血糖値には相関があり検査法を開発できることが示唆されている (Novak B.J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 104, 15613, 2007) また最近イヌや線虫がガン患者と健常人を嗅ぎ分けるとの報道がテレビや新聞でも報道されヒト以外の嗅覚による病気診断の可能性が示唆されているこのヒト以外の嗅覚を模倣すればヒトでは判断できないガンなどの病気を感知するにおいセンサーを開発することができるしかしヒトにとってにおいのある物質のみを追求するだけではガン患者を識別できる動物の嗅覚の模倣には不十分であるなぜならイヌや線虫の嗅覚受容体はヒトの約 350 より多い 1200 種以上あるそしてヒトにとって二酸化炭素 (C 2) は無臭であるがショウジョウバエはこれを忌避物質として感知しマウスは空気中の C 2 レベル (0.038%) に近い濃度を感知できることが報告されているからである (Hu J. et al., Science, 317, 953, 2007) 2. 研究の目的本研究は動物が病気の患者と健常人を判別する際に指標としているにおい物質はヒトには無臭であるが動物ではにおいとして感知する物質であると想定したものであるヒト以外の動物がにおいと感じる物質による病態の診断を可能とするには数多くの化学物質からそれらの物質を簡便迅速に選別することが必要である従来におい物質と無臭物質を比較すると分子量オクタノール / 水分配係数蒸気圧や官能基等についてある種の傾向がみられることが知られているそこでにおい物質と無臭物質の化学構造の分子記述子について多変量解析を行いヒトにとってにおい物質と無臭物質のケミカルスペースを構築しこの無臭物質のケミカルスペース上から動物のみがにおいと感じる物質を選別することを検討した一方病態の診断には病態と関連のある生体成分の測定が必要であるしかしヒトの皮膚表面や呼気に放出される化学物質の量は極微量でありその捕集と測定は困難であるそこでバイオマーカーの探索を容易にするために表皮が変形してできる爪には皮膚表面や汗から放出される臭気成分が高濃度に蓄積されていると考え爪中の成分を簡便迅速に分析する方法を検討した 3. 研究の方法 (1) ヒト以外の動物がにおいと感じる物質を迅速簡便に選別する方法の検討 1 ケミカルスペースの構築 TXNET ( ) PubChem( The Good Scents Company Information System ( 2.html) 日本薬局方及びその他各種データベースから 875 個のヒトにとって無臭物質を探し出したまたヒトにとってにおい物質は Saito らがにおい物質の分子記述子による神経応答感受性の予測に用いたにおい物質 2683 個 (Saito, et al., Sci Signal, 2, ra9, 2009) の内 SDF ファイルを取得できた 2486 個を利用した一方ヒトにとって無臭であるが動物にとってにおい物質と考えられる化学物質は各種文献検索から得た PubChem より SDF ファイル (3D Conformer) を取得しこれらの構造を分子記述子計算アプリケーション DRAGN Ver 6.0( アフィニティサイエンス ) により 4,885 種の記述子を計算した得られた記述子を多変量解析ソフトウェア SIMCA Ver 13.0 ( インフォコム ) により多変量解析法の PCA(Principal Component Analysis) PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis) PLS-DA ( rthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis) を行った 2 記述子の最適化 1 で得られた無臭物質におい物質を環構造の有無で区分けしプレカテゴライゼーションを行ったまたにおい物質のうちほとんどにおいの無い物質は除外した環構造を持たないにおい物質のうち 1055 個を 10 グループに分けた各々と環構造を持たない 94 個の無臭物質群について判別に関連性の低い記述子を削除しながら PLS-DA を繰り返し判別に必要な記述子を抽出し最適化した (2) 皮膚に存在する無臭物質におい物質の測定法の検討 1 前処理爪切りで切った爪を精製水で 30 秒間超音波洗浄し真空デシケーターで 3 時間乾燥後美容用電動爪やすり ( ネイルケア,TL111, テスコム電機 ) で粉砕した爪中の成分の同定には爪の粉末 1mg とエタノール (99.5%)100 µl を入れたエッペンドルフチューブを室温で 5 分間超音波処理を行い抽出した遠心分離 (10000 rpm, 2 分 ) して得られる上清 (20 µl) を試料とした爪中のコエンザイム Q10() の定量には爪の粉末 1mg と 0.02% の塩化第二鉄を含むエタノール (99.5%)50 µl 入れたエッペンドルフチューブを 25 で 5 分間超音波処理を行い抽出した遠心分離 (10000 rpm, 2 分 ) して得られる上清 (20 µl) を試料とした

3 2 同定液体クロマトグラフ飛行時間質量分析計 (JMS-T100LP, JEL) により爪中の成分を同定した測定条件 [ カラム ]CAPCELL PACK18 UG120 (3.0 mm i.d. 150 mm, 5 µm, SHISEID) [ カラム温度 ] 40 [ プレカラムフィルター ]0.5 µm,peek [ 溶離液 ] メタノール : エタノール (=3:7) [ 流速 ]0.5 ml/min [ イオン化法 ]APCI - [ ニードル電圧 ]-4000V [ オリフィス 1 電圧 ]-85V [ リングレンズ電圧 ]-10V [ 飛行管電圧 ]7000V 3 定量紫外可視吸光光度検出器付高速液体クロマトグラフにより爪中のを定量した測定条件 [ ポンプ ]PU-2080 Plus (JASC) [ 検出器 ]UV-2080 Plus (JASC) [ カラム ]TSKgel DS-100V 3 µm (3.0 mm i.d. 150 mm, 3 µm, TSH) [ カラム温度 ] 45 [ プレカラムフィルター ]0.5 µm,peek [ 溶離液 ]5 mmol/l の過塩素酸ナトリウムを含むアセトニトリル :2- プロパノール : 水 (=50:50:2) 混液 [ 流速 ]0.5 ml/min [ 検出器波長 ]275 nm 4. 研究成果 (1)-1 ケミカルスペースの構築各種データベースを用いてヒトにとって無臭物質 875 個とにおい物質 2683 個を収集したこれらについて二重結合の結合数や 2 次元の自己相関等 4,885 種の分子記述子を計算し 2 つの群について PLS-DA を行ったところ両群を分けることができた (R2X(cum)=0.542, R2Y(cum)=0.766, Q2=0.72)( 図 1) 明確に 2 つの群に分かれていないのはにおいの強度を区別していないことや解析に用いた物質数が多いことが考えられた図 2,3 はそれぞれ PCA,PLS-DA であるが 2 つの群の重なりが多く PLS-DA の方が良い結果を与えていることが分かる図 1 におい物質と無臭物質の PLS-DA このように構築したヒトが感じるにおい物質と無臭物質のケミカルスペースに動物のみが敏感に感じるにおい物質例えばヒトではほとんど感じ取れないがイヌは高感度に感じ取るアンドロステノンや麻薬低級脂肪酸等を無臭物質のケミカルスペース上に配置すればその周辺には同様の物質が存在するはずであり多数の物質の中から簡便迅速に候補となる物質を選別することができる本法は動物実験をせずともヒト以外の動物がにおいと感じる物質を効率よく選別するための予測モデルである今後ケミカルスペース上に配置するための基準となる物質がたくさん見つかればより精度の高い方法になると考える図 2 におい物質と無臭物質の PCA 図 3 におい物質と無臭物質の PLS-DA (1)-2 記述子の最適化 1 で用いた無臭物質とにおい物質について環構造の有無で分けプレカテゴライゼーションを行いまたにおい物質のうちほとんどにおいの無い物質は除外して環構造を持たないにおい物質 1055 個と環構造を持たない無臭物質 94 個を得たこのにおい物質 1055 個を 10 のグループに分けた各々と 94 個の無臭物質群について判別に関連性の低い記述子を削除しながら PLS-DA を繰り返し行い判別に必要な記述子を抽出し最適化したところヘテロ原子の数など 24 個の記述子 ( 表 1) で判別できるこ

4 とを明らかにした (R2X(cum)=0.844, R2Y(cum)=0.744, Q2=0.72)( 図 4) この 24 個の記述子が示す化学構造の情報はにおいの有無と化学構造の関係を明らかにするための知見となり得るものである表 1 におい物質と無臭物質の判別に必要な記述子 nhet MATS1s P_VSA_e_1 Mor19e IC0 SpMax3_Bh(p) P_VSA_p_1 Mor26p IC4 SpMin4_Bh(m) P_VSA_i_4 Mor17i SIC0 SpMin2_Bh(i) P_VSA_s_2 Mor19i SM1_Dz(i) SpMin3_Bh(i) Mor19u Mor21s MATS1e SpMin1_Bh(s) Mor13e TPSA(Tot) (2)-2 同定 1 で得られた粉末に含まれる成分をエタノールで抽出し質量分析計付液体クロマトグラフにより分析することで皮膚にも存在するが爪にも含まれていることを明らかにした図 6-(A) はの標準品 (2.5 ng) のクロマトグラムと対応するピーク ( 保持時間 :5.7 分 ) における質量スペクトルでありの分子量 (863.34) に相当する m/z:863.58, [M-H] - : が得られた図 6-(B) は健常人 (41 才, 男性 ) の爪から得られたクロマトグラムであり標準品と同じ保持時間と質量スペクトルを示すことから爪中のであることを同定した (A) H 3C H 3C 9 図 4 環構造を持たないにおい物質 ( ほとんどにおいの無い物質は除外 ) と無臭物質の PLS-DA (2)-1 前処理微量の固い爪を簡便迅速に粉末にする方法として美容用の安価な電動爪やすりを用いることで粉末にする方法を考案した図 5 は粉末にした爪の電子顕微鏡像であり数 µm ~ 数十 µm 程度に粉砕さているのが分かる臨床医学的見地からも生体試料としての爪の利用が注目されているが微量で固いことを特徴とする爪を粉末にするためには高価な粉砕機や煩雑な前処理が必要であることが問題のひとつであり現在のところ爪の分析法は普及していないこの前処理法は迅速安価に前処理を行うことができるので爪の分析を普及するために有用になると考える (B) 図 5 粉末にした爪の電子顕微鏡像図 6 の標準品 (A) と健常人 (41 才, 男性 ) の爪 (B) のクロマトグラム ( 上図 ) と質量スペクトル ( 下図 )

5 従来爪の中に含まれる成分は無機物が主体であり有機物はほとんど含まれないと考えられてきたこともあり爪中の成分分析の報告は少ない皮膚中の成分を測定することは困難であるが爪中に存在する皮膚成分に着目することでバイオマーカーの候補を絞り込むことができ迅速なバイオマーカーの探索に寄与できると考える (2)-3 定量 1 2 で同定した爪中のを紫外可視吸光光度検出器付高速液体クロマトグラフにより定量する方法を開発した爪中のの抽出溶媒として塩化第二鉄が溶解する溶媒の内エタノールが最適であった ( 表 2) 表 2 爪中の抽出率抽出溶媒抽出率メタノール 90.3 エタノールプロパノール 90.3 酢酸エチル 3.2 メタノール : クロロホルム=1: 主な発表論文等 ( 研究代表者研究分担者及び連携研究者には下線 ) 学会発表 ( 計 3 件 ) 1 野原幸男 LC-MS による爪に含まれる皮膚成分の探索日本薬学会第 135 年会 2015 年 3 月 27 日神戸サンボーホール ( 兵庫県神戸市 ) 2 野原幸男爪中コエンザイム Q10 の分析第 53 回日本薬学会東北支部大会 2014 年 10 月 5 日いわき明星大学 ( 福島県いわき市 ) 3 野原幸男分子記述子の多変量解析により無臭物質を予測する方法の検討日本薬学会第 134 年会 2014 年 3 月 29 日熊本市総合体育館 ( 熊本県熊本市 ) 6. 研究組織 (1) 研究代表者野原幸男 (NHARA, Yukio) いわき明星大学薬学部准教授研究者番号 : 図 7-(a) はの標準品 (580 pg) のクロマトグラムであり保持時間 8 分にのピークが見られる図 7-(b) は健常人 (45 才, 男性 ) の爪から得られたクロマトグラムであり標準品と同じ保持時間にピークが検出された図 7-(c) は (b) で用いた試料にの標準品 (580 pg) を添加したクロマトグラムでありのピークであることが確認された検量範囲は 290 pg-75 ng /injection, 検出限界は 146 pg, 回収率 (580 pg) は 97.1%, 変動係数 ( 日内変動 : 1.17 ng,n=5) は 5.4% であった健常人 13 人 (20 50 才 ) の爪を測定したところ pg/mg ±265.8( 平均値 ± 標準偏差 ) であった本前処理法により爪中の成分を簡便迅速に定量することができる爪中の成分からバイオマーカーになり得る候補物質を探索してから実際の皮膚表面や汗から放出される極微量の臭気成分を測定できるようにすればより迅速なバイオマーカーの探索ができると考える (a) (b) (c) 図 6 の標準品 (a), 健常人 (45 才, 男性 ) の爪 (b), の標準品を爪に添加したクロマトグラム (c)

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研究報告58巻通し.indd 25 高性能陰イオン分析カラム TSKgel SuperIC-Anion HR の特性とその応用バイオサイエンス事業部開発部セパレーショングループ佐藤真治多田芳光酒匂幸中谷茂 1. はじめにイオンクロマトグラフィー (IC) は環境分析等の各種公定法に採用されている溶液試料中のイオン成分分析法であり当社においてもハイスループット分析を特長とする高速イオンクロマトグラフィーシステム IC 2010