慶應義塾大学拠点 「再生医療実現化を目指したヒトiPS細胞・ES細胞・体性幹細胞研究拠点」 拠点リーダー: 岡野 栄之

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1 再生医療の実現化プロジェクト慶應義塾大学拠点の取り組み拠点リーダー : 岡野栄之 特定臓器の再生医療と幹細胞制御 中枢神経系 ( 岡野, 中村 ) : 前臨床加速プログラム 心筋 ( 福田 ): 前臨床ハイウェイ 感覚器 ( 榛村 ) : 前臨床ハイウェイ 造血系 ( 須田 ) 基盤技術開発 PF 技術 体性幹細胞の分離と ips 細胞の樹立 ( 標準化 ) ( 松崎 ) 疾患特異的 ips 細胞の樹立 ( 岡野 福田 ) マーモセットと NOG マウスを用いた前臨床研究 ( 実中研 : 伊藤 ) ips 細胞の GMP 化 ヒト多能性幹細胞由来神経幹細胞分化の標準化 ( 国立病院機構大阪 : 金村 ) 知財戦略 ( 羽鳥 )

2 慶大拠点の方向性 ips 細胞技術を活用したトランスレーション研究 : 神経 感覚器 循環器を中心とした幹細胞研究の基礎研究成果の臨床への応用対象疾患 : 脊髄損傷 角膜障害 心不全 ( 前臨床研究加速プログラム ハイウェイ ) 体性幹細胞研究と ips 細胞研究の融合 : 造血幹細胞 間葉系幹細胞を中心に ips 細胞技術を駆使した疾患モデル細胞研究 : 神経系と循環器疾患を中心に 幹細胞研究に関する知財戦略の強化と人材育成

3 iips 細胞技術を用いた脊髄損傷の再生医療 : これまでの概略と課題 安全性の確保 前臨床研究加速プログラムで取り組む 腫瘍原性の抑制 ゲノムに挿入にない ips 細胞の作成 適切なクローンの選択 適切な起源細胞の選択 リプログラミングの解析 セルソーターよる解析 免疫不全動物移植による腫瘍原性の確認 サル同種移植による腫瘍原性の確認 Okano et al. Circulation Research, in press Miura et al., 2009, Tsuji et al., PNAS, 2010, Nori et al., PNAS, 2011

4 良質なヒト ips 細胞由来神経幹細胞の選択 1. 樹立時の c-myc 使用の有無は 神経分化誘導後の腫瘍化とは相関しない 2. 分化誘導に伴うリプログラミング因子の再活性化の防止は 腫瘍化の抑制に必要だが十分ではない 3. 誘導した神経幹細胞による奇形腫の形成は見られない ( グリオーマを形成 ) 分化誘導後の未分化細胞の除去のみでは 腫瘍化対策は不十分 4. 不完全にリプログラミングされたクローンは ゲノム不安定性を介して造腫瘍性を示す 完全にリプログラミングされたクローンの選択が重要 今後の課題 完全にリプログラミングされた良質なクローンを選択 全遺伝子ではなく 選択した遺伝子の発現プロファイルにより 未分化状態で迅速 簡便に良質なクローンを選別する方法の開発 未分化状態のみならず 分化誘導後のゲノム安定性を確認 Integration-free hips 細胞を用いた解析 Integration-free hips 細胞 (Episomal vector-hips) を用いた神経分化能と造腫瘍性の解析

5 前臨床研究加速プログラム ( 京大拠点 山中研との連携 ) 臨床に使える細胞の選出 使用するクローン数 Integration-free ips の樹立 in vitro でのスクリーニング クローン 神経前駆細胞への分化誘導 (30 50 クローン ) in vitro でのスクリーニング クローン 5 10 クローン integration-free ips 由来神経前駆細胞の造腫瘍性の検討 ( 免疫不全マウスへの移植 ) 脊髄損傷に対する integration-free ips 由来神経前駆細胞の安全性 有効性の検討

6 脊髄損傷治療に有効な移植細胞 : 成功への鍵 ニューロンとグリア両方を生みだす神経前駆細胞の移植 (Kumagai et al., PLoS ONE 2009, Tsuji et al., PNAS, 2010) 亜急性期における移植 (a few weeks after the injury). (Okada et al., FASEB J,2005) 移植する細胞の非腫瘍原性 (Miura et al., Nat Biotech, Nori et al., PNAS, 2011) 移植後の細胞の traceability ( Ellis, Okano et al. Cell Stem Cell, 2010, Yasuda et al. in preparation)

7 直接誘導型神経幹細胞による脊髄再生 : 来年度目標 Integration free 法によるヒト dinsc の誘導法の brush up dinsc の腫瘍原性を含む safety issue の確立 脊髄損傷モデル (NOD/SCID モデル ) への移植 脊髄損傷モデル動物を用いた autograft の開発

8 多能性幹細胞を用いた脊髄損傷治療の開発 慶應義塾大学 Geron 社 多能性幹細胞 ヒト ips 細胞 ( 臨床研究は episomal ips) ヒト ES 細胞 H1 株 (1998 年に樹立 ) 移植細胞 神経幹 前駆細胞 オリゴデンドロサイト前駆細胞 ( 特定の細胞株でのみ再現可能 ) 移植細胞の分化能 ニューロン アストロサイト オリゴデンドロサイト オリゴデンドロサイト 前臨床研究モデルマウス マーモセットラット 機能回復メカニズム 脊髄局所のシナプス形成 神経軸索再生誘導 血管新生誘導 ミエリン形成 参考文献 Nori et al. PNAS, 2011 Tsuji et al., PNAS, 2010 ミエリン形成他 trophic effect? Keirstead et al., J Neurosci, 2005

9 ips 細胞を用いた難治性心筋疾患に対する病態解析 治療法開発 ( 福田恵一 ) 採血 センダイウイルスによる 4 因子導入 TiPS 細胞 Oct3/4, Sox2 Klf4, c-myc 心移植待機患者遺伝性心筋疾患 末梢血 T 細胞 ヒト心筋細胞 純化 精製 大量培養 心筋細胞へ分化 心筋細胞移植心不全治療 疾患 ips 細胞の樹立病態解明 創薬 活動電位記録など 再生医療ハイウェイへ移行し 実用化へ 再生医療 PJ で継続して研究

10 前臨床加速プロジェクト再生心筋細胞移植の安全性 有効性の評価 最終製品 : ヒト ips 細胞由来の純化した心筋細胞の再凝集塊あるいは心筋シートによる安全有効な移植法の確立 1. 最終製品の生産 安定供給に向けた生産系の確立 製造工程管理法の確立 2. 最終製品の有効性評価 心不全改善評価 催不整脈性評価 小動物での評価 霊長類 ( コモンマーモセット サル ) ブタ ( ヒトとの相同性 : 体重 動態 ) を用いた心筋再生医療シミュレーション 3. 最終製品の安全性評価 ( 京大拠点 ( 阪大 ) 澤芳樹教授との連携

11 感覚器系 ( 眼科領域 ) のヒト幹細胞技術開発および幹細胞治療開発研究榛村重人 これまでの成果 来年度以降の課題 誘導上皮シート <in Press> 誘導角膜内皮シート移植 角膜上皮 マウス ips 細胞から上皮幹細胞をクローニングし上皮シート作成 成果を論文発表 Yoshida et al PLoS ONE 2011 角膜内皮 神経堤幹細胞 (COPs) 由来角膜内皮細胞シートの家兎移植 ヒトiPS 細胞から神経堤細胞 さらに角膜内皮細胞を誘導 ヒトiPS 細胞由来角膜内皮細胞シートの家兎移植 角膜実質 ヒト ips 細胞由来神経堤細胞誘導のマウス角膜実質内移植 < 再生 PJ> 角膜実質 疾患モデル動物を用いた治療法開発 < 再生 HW> 角膜上皮 大阪大学が主導 臨床研究の開始を目指して協力態勢をとる 角膜内皮 サル ips から角膜内皮細シートの作成 誘導角膜内皮移植技術の開発 角膜内皮機能バリデーション法の確立 誘導神経堤細胞の実質内注入

12 ips からの造血幹細胞誘導 ( 須田年生 ) 1) 新しいリプログラミング因子の同定生殖幹細胞 : Prmt5 造血幹細胞 : Nucleostemin 2) 新規造血幹細胞誘導因子の探索 ips 誘導阻害法 3) 造血幹細胞維持のための培養法

13 Secondary Neurosphere Mouse ips clone ips 細胞樹立 培養トレーニングプログラムの実施 A Nestin GFP 神経幹細胞への分化誘導 B 分化誘導後の Nestin-GFP を指標に残存 ips 細胞を検出 (2-4 weeks) 分化誘導に適した ips クローン選択 松崎有未 来年度 神経系 血球系 N 数を増やす # of cells FACS 解析 SSC FACS による SSC 解析 (1-2 hours) 本年度 分化誘導に適したヒト ips クローンの選別に適用が可能か? 分化誘導の際に幼若 ips 細胞が残存する ips クローンは SSC 強度が高い SSC FSC Granules Nucleus SSC; inner complexity of the cell FSC; approximate cell size

14 GMP レベルのヒト ips 細胞プロセシング技術開発と HLA バリエーションを有する同種他家ヒト ips 細胞マスターセル ライブラリーの構築 実施機関名 研究者名 : 大阪医療センター 金村米博 1 ヒト多能性幹細胞 (ips/es 細胞 ) から種々の方法で作製した神経幹細胞 / 前駆細胞の特性評価 1.5 群の neurosphere 間での遺伝子発現差異の傾向の同定 2. 各細胞間で分化マーカー発現 領域特異性に差異の同定 ( 主成分解析 ) ( 各種マーカー遺伝子 (27 個 ) の発現特性比較 ) 2HLA バリエーションを有するヒト ips 細胞の神経幹細胞 / 前駆細胞への分化指向性評価 201B7 DMC μm 500 μm 3. 長期培養の影響で発現変動する遺伝子群の同定 98% 6.5% 各種ヒト ips 細胞の神経分化指向性の多面的な評価の実施 移植用細胞の品質評価に応用可能な指標の抽出 (24 年度 ) 未分化ヒト ips 細胞の神経分化指向性予測分子マーカーの抽出 (24 年度 )

15 疾患モデル動物を用いた幹細胞治療の安全性と有効性の検討実施機関名 研究者名 : 実験動物中央研究所 伊藤豊志雄 1 マーモセットの複数の ips 細胞株の樹立とその性状解析 目標 : 非侵襲的に採取可能なマーモセット組織由来の細胞からゲノムに遺伝子挿入のない方法でiPSを樹立するための基盤整備および樹立実験 A) RT PCR を行う 実施内容 : 成体マーモセット由来 T 細胞及び皮膚繊維芽細胞に Oct3/4, Sox2, Klf4, c Myc, Nanog, Lin28の6 因子を組み込んだSセンダイウイルス (SeV) を導入し ips 細胞の樹立を試みた 2 重症度免疫不全マウスを用いたヒト由来幹細胞の安全性確認のためのシステムの構築 目標 : in vivo イメージング技術による移植ヒト ips 細胞の検出方法を検討する 実施内容 : ips 細胞を修飾することなく検出できる方法の確立を目指し 異なる 2 種類の NIR(near infrared; 近赤外 ) 物質標識プローブを用い 標識物投与 24 時間後の Kodak ivivo imager による近赤外部蛍光の検出を検討した 3 疾患モデルマーモセットを用いた前臨床研究の開発 目標 : 疾患モデルマーモセットを用いた治療実験を実施する 実施内容 : 脊髄損傷や心筋梗塞モデルマーモセット作出とモデル動物を用いたヒトやマーモセット ips 細胞から分化誘導された細胞移植による治療実験の実施と MRI を用いたマーモセット脊髄路の可視化の検討 Each factor /SeV SeV 感染細胞の評価 XenoLight CN770 標識抗 HLA 抗体よるヒト大腸がん細胞のイメージング IRDye800CW 2- DG プローブによるヒト ips 細胞のターゲッティング 7 テスラ MRI を用いた脊髄損傷モデルの画像解析法の開発 SenV ベクターによる非侵襲的に採取可能なマーモセット組織由来の細胞からの ips 細胞の樹立と性状解析 (24 年度 ) NOG マウスによる多分化能 腫瘍原性評価ならびに標識抗体による ips 細胞のターゲッティング感度度向上 (24 年度 ) 疾患モデルマーモセットを用いた治療実験の実施と解析技術の開発 (24 年度 )

16 慶應義塾大学拠点で進行中の疾患特異的 ips 細胞研究 (2011 年 12 月現在 ) 寄託数 ( 疾患数 :6, 患者数 :6, 計 22 株 ) 家族性パーキンソン病 Prader-Willi 症候群 Pelizaues- Merzbacher 病 CHARGE 症候群 アルツハイマー病など 樹立件数 ( 疾患数 :21, 患者数 :42, 株数 372): 循環器疾患では QT 延長症候群 肥大型心筋症 家族性心房 / 心室中隔欠損症 ミトコンドリア脳筋症など )

17 家族性アルツハイマー病 (PS1, PS2) 由来 ips 細胞の神経細胞への誘導とベーターアミロイドの産生 PS2-1 βiii-tubulin PS2-2 PS2-1 MAP-2 慶大神経内科八木拓也先生 伊東大介講師 鈴木則宏教授との共同研究 神経細胞へ誘導を確認 Aβ42/40 ratio ベーターアミロイド40と42の産生比 * * * 201B7 PD01-25 PD01-26 PS1-2 PS1-4 PS2-1 PS2-2 正常パーキンソン病 ips 細胞 * アルツハイマー病 ips 細胞 アルツハイマー病ではや毒性の高いベーターアミロイド 42 の産生が 2 倍に増加 アルツハイマー病の原因であるアミロイド仮説の一端を ips 細胞で証明 Yagi et al. Human Molecular Genetics, 2011

18 知財戦略 管理担当 羽鳥研一本年度の進捗の骨子 アピールできる事と来年度の課題 1. 本年度の進捗の骨子 1 研究者へのサポート研究契約関連の支援では 国内の共同研究契約の増加およびアカデミアへのヒト ips 細胞 ( 健常 疾患 ) の提供の増加が目立った ヒト細胞の提供においては 倫理指針に留意しながら 採取元に応じた必要な手続を考慮して契約手続を進めた また円滑なマテリアルの提供 受領のため 他の拠点の担当者と連携して 全国の大学と研究機関を対象に MTA セミナーを共催した 2 知財の管理 活用共有特許の権利確保等を中心に 他の拠点と連携を深めた 活用の面では バイオ 医療系の展示会として世界最大規模の BIO2011( アメリカ ) や BIO Europe2011 に参加し 再生医療に関する研究成果を大手の創薬企業やベンチャーに紹介した 疾患別 ips 細胞について 企業から薬効評価等への期待が高まっている 3 関連分野の国内外特許文献調査と研究者への情報提供 ips ネットワークの企画に協力して 知財マップの作成等に係る公開セミナーを拠点で開催した また 神経再生医療分野を対象に 過去 1 年半の間に世界で公開された特許文献のうち 特に注目すべき特許文献を抽出 分析したところ その約半数について 現時点で論文が未発行であった 更に 論文が発行されていてもその 3 割程度は 論文より特許の方が早く公開されていた 内容の点でも 論文に無い特許情報 の有用性が研究者から確認できたことから 今後 ips ネットワークを介して再生プロジェクト全体へ情報発信できるよう 継続的な活動を進めていきたい 2. 来年度の課題 関係する研究テーマの国内外特許文献の調査 細胞バンク等を介した種々の細胞の流通等ヒト細胞の取扱に関する情報収集 および知財の管理活用等の点で 拠点間で連携 協力しながら研究支援の拡大を進めるとともに 有益な情報が再生プロジェクト全体で共有化できるよう 情報発信機能を高めること 18

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を行った 2.iPS 細胞の由来の探索 3.MEF および TTF 以外の細胞からの ips 細胞誘導 4.Fbx15 以外の遺伝子発現を指標とした ips 細胞の樹立 ips 細胞はこれまでのところレトロウイルスを用いた場合しか樹立できていない また 4 因子を導入した線維芽細胞の中で ips 細 平成 19 年度実績報告 免疫難病 感染症等の先進医療技術 平成 15 年度採択研究代表者 山中伸弥 京都大学物質 - 細胞統合システム拠点 / 再生医科学研究所 教授 真に臨床応用できる多能性幹細胞の樹立 1. 研究実施の概要 胚性幹 (ES) 細胞は受精後間もない胚から樹立する幹細胞であり 様々な細胞へと分化する多能性を維持したまま 長期かつ大量に培養することが可能であることから 脊髄損傷 若年性糖尿病

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