140(46) Organ Biology VOL25 NO 内皮細胞 HLA の発現抑制シグナルの同定と薬剤探索岩﨑研太１) 前仲亮宏２) 小林孝彰３) REVIEW ARTICLE Identification of expression signal of endotheli

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うまじしのしま
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1 140(46) 内皮細胞 HLA の発現抑制シグナルの同定と薬剤探索岩﨑研太１) 前仲亮宏２) 小林孝彰３) REVIEW ARTICLE Identification of expression signal of endothelial HLA and drug exploration Abstract The production of donor HLA-specific antibody (DSA), especially HLA class II antibody, have been recognized to cause refractory graft failure. Since there are few effective treatment, we considered the reduction of HLA-class II on endothelial cells would prevent DSA-mediated rejection. We found that Everolimus (EVR), Prednisolone (PRD) and Fluvastatin (FLU) have the suppressive effect on IFNγ induced-hla class II-DR of ECs. EVR-mediated suppression was involved in posttranslational modification through the reduction of tetraspanin proteins CD63 and CD82 which were involved in the HLA proteasome degradation. Although further investigation is required, the usage EVR/PRD/FLU could prevent DSA-mediated graft injury, and the development of new drug targeting tetraspanin would prevent DSA-mediated rejection in organ transplantation. key words; HLA class II, Everolimus, Prednisolone, Fluvastatin, Tetraspanin HLA class II エベロリムスプレドニゾロンフルバスタチン Tetraspanin Kenta Iwasaki 1)*, Akihiro Maenaka 2)*, Takaaki Kobayashi 3)* 背景近年の腎臓移植は移植前の抗体検査法の進歩や脱感作療法また良質な免疫抑制剤を背景に 5 年 10 年生着率がそれぞれと良好な成績を保ってきた 1 加えて mtor mammalian Target of Rapamycin 阻害剤である Everolimus が免疫抑制剤として使用できるようになり更なる成績向上が期待されているが 2 維持期における大きな成績向上は見られないのが現状である個々の薬剤は TDM Therapeutic Drug Monitoring の対象薬剤であり血中濃度を指標とした投与量の調節が行われているTDM を基本とした厳密な濃度調整をすることで多剤併用療法が可能となり移植後早期の拒絶反応は大幅に軽減受付年 3 月 23 日受理年 5 月 11 日 1 Department of Kidney Disease and Transplant Immunology, Aichi Medical University School of Medicine 愛知医科大学腎疾患移植免疫学寄附講座 2 Department of Pharmacy, Aichi Medical University School of Medicine 愛知医科大学薬剤部 3 Department of Kidney Disease and Transplant Immunology, Aichi Medical University School of Medicine 愛知医科大学腎移植外科されてきた現在長期の成績向上を阻む要因は Donor HLA Specific Antibody (DSA) 特に de novo DSA による慢性抗体関連型拒絶反応である慢性抗体関連型拒絶反応の抑制は臓器の長期生着およびそれに伴う患者 Quality of Life の向上のために重要になってくる臓器移植においては抗 ABO 抗体と DSA が抗体関連型拒絶反応の原因となる中でも HLA class I (A, B) class II (DR) のミスマッチは以前からリスクが高いとされている 3 HLA class I と class II のミスマッチに対する予後の比較では HLA class II のミスマッチの方が不良であるという報告もある 4 さらに de novo DSA による抗体関連型拒絶反応は度々治療困難となり移植臓器の廃絶となる通常抗体関連型拒絶反応の治療においては免疫抑制剤の強化もしくは Rituximab や Bortezomib (BOR) といった B 細胞を標的とした治療もしくは血漿交換による抗体除去療法が取られるしかしながら移植後慢性期においては現在これらの治療効果は限定的であり 5, 6 de novo DSA の出現特

2 141( 47) 図 1. EA.hy 926 に各薬剤を投与し 30 分後に IFNγ にて刺激を行った刺激後 48 時間後に HLA-DR の発現をフローサイトメトリーで解析したところ CSA, TAC, MPA では HLA-DR に対して影響を及ぼさなかったが EVR, FLU, PRD では誘導性の HLA-DR を抑制したにドナー HLA class II に対する抗体産生は移植腎 7 機能不全と強い相関があるン (PRD) フルバスタチン (FLU) を本研究では用いた内皮細胞における HLA-DR は炎症状態 HLA class II は一般的には抗原提示能を有するによりサイトカインの作用を受けて発現する誘 B 細胞やマクロファージ樹状細胞といった細胞導性のものである 8 そのためヒト臍帯静脈内に発現を認める内皮細胞においては定常状態で皮細胞由来細胞 (EA.hy 926) を各薬剤存在下では発現レベルは低く炎症など活性化された状態 Interferon-γ (IFNγ) を添加し細胞膜上の HLA- で誘導されることがわかっている抗体関連型拒 DR の発現をフローサイトで解析したその結果絶反応は抗体抗原反応を機に発生することを CSA TAC MPA では IFNγ にて誘導された考えるとその治療法においては抗体除去と同 HLA-DR の抑制効果は見られなかったが EVR 様抗原除去もその一助となり得ると考える事 PRD FLU の 3 剤では抑制効果を示した図 1 実異種移植における主要な標的抗原であった当研究室では EVR にて内皮細胞上の HLA-DR の αgal 抗原の除去が異種移植を現実のものへと発現が抑制されることを明らかにしている 9 本希望を与えた結果では EVR に加えて PRD と FLU にも同様そこで現在我々の研究室では移植後に使用される薬剤の中で内皮細胞上の誘導性 HLA class II へ影響を与える薬剤の探索を行っている免疫抑制剤による内皮細胞上の HLA class II DR(HLA-DR) への影響の効果がある可能性が示された EVR とステロイドは移植後の免疫抑制療法に使用される薬剤であるが FLU は HMG-CoA(3Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA) 還元酵素阻害剤の一種としてとして脂質異常症に使用される心血管イベントを抑制するためにもスタチンの投通常移植後に使用される薬剤シクロスポリ与による脂質異常症のコントロールは重要であン (CSA) タクロリムス (TAC) ミコフェノールり移植後に合併するものも例外ではないその酸 (MPA) エベロリムス (EVR) プレドニゾロため移植後の患者でも使用頻度の高い薬剤であ

II の転写が促進されることでタンパク質として作られそれが細胞内にて Tetraspanin family との会合により安定化されて細胞膜上へ発現する ( 右図 )

qrt-pcr にて CIITA と HLA-DR の mrna 発現を測定した( 左図 )CIITA の mrna では PRD で抑制傾向を示したEVR,FLU

誘導性の MHC class HLA-DR の抑制効果を示した EVR PRD FLU II の発現を抑制するという報告は以前にもされての 3

出し CIITA と HLA-DR の mrna を qrt-pcr にて測定したその結果 PRD は CIITA と HLA- 転写への影響 HLA

FLU は HLA-DR の mrna を抑制していた一方 EVR はいずれの mrna も抑制しないことが明らかとなった図 3 翻訳後修飾への影響

その発現は高値となるそのため IFNγ について検討したHLA-DR は翻訳後調節を受けてよる JAK/STAT シグナル経路を介した Class II

3 142(48) 図 2. ( 左図 )HLA class II は IFNγ で刺激を受けるとまず JAK/STAT シグナル経路から CIITA の発現が増強する続いて HLA class II の転写が促進されることでタンパク質として作られそれが細胞内にて Tetraspanin family との会合により安定化されて細胞膜上へ発現する ( 右図 ) 細胞膜上の HLA class II はユビキチン化を受けてプロテアソームにて分解を受けるその際のユビキチン化にも Tetraspanin family は影響を与えているとされている図 3. EA.hy 926 に HLA-DR の発現抑制効果がみられた各薬剤を投与し 30 分後に IFNγ にて刺激を行った刺激後 24 時間後に mrna を回収し qrt-pcr にて CIITA と HLA-DR の mrna 発現を測定した( 左図 )CIITA の mrna では PRD で抑制傾向を示したEVR,FLU は影響を与えなかった( 右図 )HLA-DR の mrna では PRD,FLU にて抑制傾向を示した EVR は影響を与えなかったるまたスタチンが IFNγ 誘導性の MHC class HLA-DR の抑制効果を示した EVR PRD FLU II の発現を抑制するという報告は以前にもされての 3 剤の作用機序について検討したおり免疫調節を可能にする薬剤として期待できるものであると考える 10, 11 IFNγ 刺激後 24 時間のサンプルより RNA を抽出し CIITA と HLA-DR の mrna を qrt-pcr にて測定したその結果 PRD は CIITA と HLA- 転写への影響 HLA class II は主に 3 つのプロモーターを使用してその発現が制御されている恒常的な発現の際に使用されるプロモーターと炎症因子によって DR の mrna FLU は HLA-DR の mrna を抑制していた一方 EVR はいずれの mrna も抑制しないことが明らかとなった図 3 翻訳後修飾への影響制御されるプロモーターは異なる内皮細胞では炎症時のサイトカインの作用を受けたときの次に EVR が持つ HLA-DR の発現抑制効果にみその発現は高値となるそのため IFNγ について検討したHLA-DR は翻訳後調節を受けてよる JAK/STAT シグナル経路を介した Class II その発現が制御される恒常的に MHC II が発現 transactivator (CIITA) の発現増強が大事となるしている樹状細胞においてそのタンパク質発現 CIITA により HLA class II の転写が促進されるはユビキチン化によって制御されることが報告さことで HLA class II が細胞膜上へ発現する図れている 12)HLA class II の翻訳後修飾に関わる 2 左これら一連の発現メカニズムにおいてタンパク質の一種として Tetraspanin family と呼

4 143( 49) 図 4. EA.hy 926 に各薬剤を投与し 30 分後に IFNγ にて刺激を行った刺激後 48 時間後に CD63 と CD82 の発現をフローサイトメトリーで解析したところ EVR は両タンパク質とも大幅に抑制しており FLU は CD63 について抑制がみられたPRD は両タンパク質とも発現の増強がみられたばれるものがあり 13) このタンパク質は抗原提示はどちらの段階に作用しているのか検討したプ細胞において HLA class II の安定化に関与するロテアソーム阻害剤である BOR 存在下で EVR にと言われている図 2 HLA class II は細胞内による IFNγ の発現制御をフローサイトメトリーて抗原ペプチドを載せて細胞膜上に出現するがとウェスタンブロッティングにて検討したEVR Tetraspanin family は細胞内で HLA class II と会合が分解の段階に作用するのであれば BOR をタすることで細胞膜上への発現を安定化させる 14 ンパク質回収前に投与することでプロテアソーまた細胞膜上では HLA class II のユビキチン化をムによる HLA-DR の分解は阻害され細胞膜上阻害すると言われているすなわち HLA class II の HLA-DR はいくらか保持された状態になるとの細胞内外での発現と HLA-class II が本来所有す考えたその結果フローサイトメトリーではる抗原提示能を調節するタンパク質である BOR の添加により HLA-DR の発現が増強するこそこで Tetraspanin family の中でも抗原提示とはなく EVR による抑制効果も同程度見られ細胞にて前述の HLA class II のユビキチン化を制た一方でウェスタンブロッティングでは御するとされる CD63 と CD82 に着目しフロー BOR の添加により HLA-DR のバンドが強く出現サイトメトリーにて各薬剤の影響を検討したしたデータ不掲載フローサイトメトリーはすると EVR は両者とも大幅に抑制し FLU は細胞表面上に発現しているタンパク質において CD63 については有意な抑制を示した一方で標識抗体が接着し測定されるそれに対してウェ PRD は両者とも有意に発現を増強した図 4 スタンブロッティングでは細胞内部を含めたすなわち EVR と FLU の HLA class II の発現抑制総タンパク質としての HLA-DR を検出している効果は翻訳後修飾への影響も関係しているのですなわち BOR のプロテアソーム阻害作用によはないかと考えられるり細胞内部での HLA-DR のタンパク質量は増加 Tetraspanin family が HLA class II の発現と分解の両段階に関与しているとするならば EVR するが EVR の投与により細胞表面では抑制された状態であることが示唆される

5 144(50) まとめ今回本研究にて移植後に使用される薬剤の中で免疫抑制剤である EVR PRD 及びスタチンの一種である FLU において HLA-DR の抑制効果が見られた3 剤それぞれの抑制機序は異なっており使用タイミングなどの効率的な併用で内皮細胞膜上の誘導性 HLA-DR を制御できる可能性があるde novo DSA の発生はその後の抗体関連型拒絶反応を引き起こす移植後に産生された抗体除去を試みた治療効果は限定的であり多くの場合移植臓器は機能不全となる発現抑制メカニズムまた実際の腎組織における HLA-class II の発現確認を含めた更なる検討は必要であるが本研究は de novo DSA に起因する抗体関連型拒絶反応を克服するための免疫抑制薬の選択への一助となるとともに Tetraspanin family を標的とした新たな薬剤開発へとつながるのではないかと期待している文献 1) Zand MS. Immunosuppression and immune monitoring renal transplantation. Semin Dial 18: , ) Su L, Tam N, Deng R, Chen P, Li H, Wu L. Everolimusbased calcineurin-inhibitor sparing regimens for kidney transplant recipients: a systematic review and metaanalysis. Int Urol Nephrol 46(10): , ) Lim WH, Chadban SJ, Clayton P, Budgeon CA, Murray K, Campbell SB, Cohney S, Russ GR, McDonald SP. Human leukocyte antigen mismatches associated with increased risk of rejection, graft failure, and death independent of initial immunosuppression in renal transplant recipients. Clin Transplant 26: E , ) Opelz G, Döhler B. Association of HLA mismatch with death with a functioning graft after kidney transplantation: a collaborative transplant study report. Am J Transplant 12: , ) Macklin PS, Morris PJ, Knight SR. A systematic review of the use of rituximab for the treatment of antibody- mediated renal transplant rejection. Transplant Rev 31(2): 87-95, ) E s k a n d a r y F, R e g e l e H, B a u m a n n L, B o n d G, Kozakowski N, Wahrmann M, Hidalgo LG, Haslacher H, Kaltenecker CC, Aretin MB, Oberbauer R, Posch M, Staudenherz A, Handisurya A, Reeve J, Halloran PF, Böhmig GA. A randomized trial of bortezomib in late antibody-mediated kidney transplant rejection. J Am Soc Nephrol 29(2): , 7) Yamamoto T, Watarai Y, Takeda A, Tsujita M, Hiramitsu T, Goto N, Narumi S, Katayama A, Morozumi K, Uchida K, Kobayashi T. De Novo anti-hla DSA characteristics and subclinical antibody-mediated kidney allograft injury. Transplantation 100(10): , ) Muhlethaler-Mottet A, Otten LA, Steimle V, Mach B. Expression of MHC class II molecules in different cellular and functional compartments is controlled by differential usage of multiple promoters of the transactivator CIITA. EMBO J 16(10): , ) Iwasaki K, Miwa Y, Uchida K, Kodera Y, Kobayashi T. Negative regulation of HLA-DR expression on endothelial cells by anti-blood group A/B antibody ligation and mtor inhibition. Transplant Immunol 40: 22-30, ) Kwak B, Mulhaupt F, Veillard N, Pelli G, Mach F. The HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin inhibits IFN-γ induced MHC class II expression in human vascular endothelial cells. Swiss Med Wkly 131: 41-46, ) Kwak B, Mulhaupt F, Myit S, Mach F. Statins as a newly recognized type of immunomodulatory. Nat Med 6(12): , ) De Gassart A, Camosseto V, Thibodeau J, Ceppi M, Catalan N, Pierre P, Gatti E. MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation. Proc Natl Acad Sci USA 105(9): , ) Engering A, Kuhn L, Fluitsma D, Hoefsmit E, Pieters J. Differential post-translational modification of CD63 molecules during maturation of human dendritic cells. Eur J Biochem 270(11): , ) Hoorn Tv, Paul P, Janssen L, Janssen H, Neefjes J. Dynamics within tetraspanin pairs affect MHC class II expression. J Cell Sci 125(Pt2): , 2012 別刷請求先岩﨑研太愛知県長久手市岩作雁又 1-1 愛知医科大学腎疾患移植免疫学寄附講座 kentaiwasaki@aichi-med-u.ac.jp

Major Histocompatibility Complex 2018; 25 (2): 抄録集 2 HLA A 3 128

Major Histocompatibility Complex 2018; 25 (: 128 138 抄録集 2018 4 14 A 3 128 MHC 2018; 25 ( HLA 2013 10.5 10 8 12 10 8 2016 CD34 + HLA NC 10 8 CD34 + CD34 + 10 6 NC10.5 2013.Apr 2014.Mar NC11 2014.Apr 2016.Jun

140(46) Organ Biology VOL25 NO 内皮細胞 HLA の発現抑制シグナルの 同定と薬剤探索 岩﨑研太１) 前仲亮宏２) 小林孝彰３) REVIEW ARTICLE Identification of expression signal of endotheli

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