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あいぞうひがき
5 years ago
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620 植物防疫第 64 巻第 9 号 2010 年植物防疫基礎講座昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践近畿中国四国農業研究センターはじめみうらかずき三浦一芸爪楊枝が適している図 4 に 2 その中に proteinase K 20 mg/ml を 2μl 入 DNA を扱う技術は日進月歩であるそれに伴い昆れるChelex 100

そんなやり方をするのかという不思議なこ 100 均などの発泡スチロールの箱 0.

安い方法次に確実に抽出する方法を紹介するまずそれぞれの方法に入る前に発泡スチロールの入れ物にクラッシュアイスを入れる図 1 次にサーマルサイクラー用の 0.2 ml のチューブに区別のため図 1 実験の準備の番号をマジックなどで書き込む図 1 そしてチューブをサーマルサイクラー用のベースに置く図 1 この 0.

1 620 植物防疫第 64 巻第 9 号 2010 年植物防疫基礎講座昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践近畿中国四国農業研究センターはじめみうらかずき三浦一芸爪楊枝が適している図 4 に 2 その中に proteinase K 20 mg/ml を 2μl 入 DNA を扱う技術は日進月歩であるそれに伴い昆れるChelex 100 は余分なものの吸着や DNA 分解酵素虫類やダニ類の分類同定行動遺伝および農薬等のの阻害等に役に立っているProteinase K は邪魔なタン応用分野についても DNA が利用されてきているしかパク質を分解するし難しそうお金がかかりそう周りにやっている人がいない等の理由でそれらの技術を敬遠している人も多いまた各研究室の伝統みたいなものがありなぜそんなやり方をするのかという不思議なこ 100 均などの発泡スチロールの箱 0.2 ml チューブと番号などのマーク印とを目撃することがあるここでは難しい理論は避け DNA を扱う手法の入り口である DNA 抽出と PCR polymerase chain reaction について簡単で安い具体的なルーチンを紹介するサーマルサイクラー用のベースなど I DNA 抽出 PCR 用テンプレート DNA を抽出する方法はたくさんあるここではまずクラッシュアイス安い方法次に確実に抽出する方法を紹介するまずそれぞれの方法に入る前に発泡スチロールの入れ物にクラッシュアイスを入れる図 1 次にサーマルサイクラー用の 0.2 ml のチューブに区別のため図 1 実験の準備の番号をマジックなどで書き込む図 1 そしてチューブをサーマルサイクラー用のベースに置く図 1 この 0.2 ml チューブは PCR 用のチューブと色違いにしておくと後に探すのに楽である図 1 のチューブは左が色つき右が白色不透明例えば私たちの研究室では PCR 用テンプレートは色つきのチューブで PCR は白色不透明のチューブであるまたサーマルサイクラー図 2 の電源を入れておくPCR にかけたい虫体が小さい場合は体全体から DNA を抽出するまた虫体が大きい場合は脚とか必要な部分を適当にカットして DNA を抽出する 1 キレックス法 ml のサーマルサイクラー用チューブに 5 の Chelex は滅菌した超純水図 3 30μl を入れるその中に虫体を入れる顕微鏡などを使い確実に潰す潰すには先が尖った使い捨てのプラスチック Introduction of DNA Extraction and PCR Method. MIURA キーワード DNA 抽出 PCR プロトコール By Kazuki 図 2 サーマルサイクラーの例アプライドバイオシステムズ GeneAmp PCR system

昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践 621 3 サーマルサイクラーで 56 2 時間以上 99.

ートができる 5 Chelex 100 は粒状である分注器ピペットマンなどのチップによってはこの粒が入らない場合があるギルソン社の純正チップは Chelex 100 を分注す

5 ml チューブなどに 20μl の 50 mm NaOH を入れるその中に虫体を入れるそしてキレックス法と同様に顕微鏡下で潰すなお NaOH は図 3 キレックス

0 を加え軽く混合しチビタン図 6 などでスピンダウンする軽く回す 4 これで DNA 抽出が終わり PCR 用のテンプレートができる 3 PrepManTM Ultra

5 ml チューブに 200μl の PrepMan TM Ultra Reagent を入れる虫体の大きさに合わせて量を調整す図 4 使い捨てプラスチック爪楊枝と PCR 用 0.

2 昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践サーマルサイクラーで 56 2 時間以上分かける図 5 その後は 4 または 20 で維持または保存する図 5 私は早急な場合以外 56 を 24 時間以上する 4 これで DNA 抽出が終わり PCR 用のテンプレートができる 5 Chelex 100 は粒状である分注器ピペットマンなどのチップによってはこの粒が入らない場合があるギルソン社の純正チップは Chelex 100 を分注することは可能であるが他の会社のチップを使用する場合は顕微鏡で確認することが必要である 2 アルカリ法 ml のサーマルサイクラー用チューブ大きい虫などは 1.5 ml チューブなどに 20μl の 50 mm NaOH を入れるその中に虫体を入れるそしてキレックス法と同様に顕微鏡下で潰すなお NaOH は図 3 キレックス劇物なので取り扱いに注意する 2 サーマルサイクラーなどで分維持する 3 取り出し 20μl 0.2 M Tris HCl ph8.0 を加え軽く混合しチビタン図 6 などでスピンダウンする軽く回す 4 これで DNA 抽出が終わり PCR 用のテンプレートができる 3 PrepManTM Ultra Reagent 法アプライドバイオシステムズ商品番号 ,000 円 ml チューブに 200μl の PrepMan TM Ultra Reagent を入れる虫体の大きさに合わせて量を調整す図 4 使い捨てプラスチック爪楊枝と PCR 用 0.2 ml チューブる虫体の量は PrepManTM Ultra Reagent の 5 20 程度その中に虫体を入れる 2 キレックス法と同様に顕微鏡下で潰すボルテックス図 6 で混合しチビタン図 6 などでスピンダウンする軽く回す 56 適時後適時後 99.9 でで33 分で維持 4 で維持適時にするため無限大に設定図 5 サーマルサイクラーで DNA 抽出図 6 ボルテックス左チビタン中央ボルテックス右 53

3 ,000 g 3 6 PCR 4 DNeasy R Blood & Tissue ,000 DNA DNA DNA ml 180 l ATL buffer 2 20 l proteinase K l AL buffer l DNeasy Mini spin column 2ml 3 6,000 g 8,000 rpm 1 5 DNeasy Mini spin column 500 l AW 1 buffer 6,000 g 8,000 rpm 1 6 DNeasy Mini spin column 500 l AW 2 buffer 20,000 g 14,000 rpm ml DNeasy Mini spin column AE buffer 200 l 1 6,000 g 8,000 rpm 1 DNA 8 7 DNA proteinase K 7 AE buffer 50 l DNA PCR 20 II PCR PCR PCR primer DNA 2 1 PCR DAVIES et al p. 537 C1 J GGA GGA TTT GGA AAT TGATTA GTT CC 3 and C1 N ACT GTAAAT ATA TGA TGT GCT CA 3 ex SIMON et al., 1994 C1 J GGA GGA TTT GGA AAT TGATTA GTT CC 3 invitrogen jp/poem/login.jsp 7 50 nmol 5 3 C1 J 1718 GGA GGA TTT GGA AAT TGATTA GTT CC C1 N 2329 ACT GTAAAT ATA TGA TGT GCT CA 1 1,000 PCR 45.8 nmol nmol l nmol 458 l 100 l 1.5 ml 900 l PCR 20 DNA SIMON et al AmpliTaq Gold 360 Master Mix ml 54

昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践 623 図 7 プライマーの注文例表 1 PCR 用薬品の分量ーブに番号をマジックなどで書き込むそしてチューサンプル数ブをサーマルサイクラー用のベースに置くサーマルサイクラーの電源を入れる 2 クラッシュアイスの中に AmpliTaq Gold 獏 360 Master Mix とプライマーを置き解凍する 3 PCR を行う

4 昆虫類やダニ類からの DNA 抽出と PCR の実践 623 図 7 プライマーの注文例表 1 PCR 用薬品の分量ーブに番号をマジックなどで書き込むそしてチューサンプル数ブをサーマルサイクラー用のベースに置くサーマルサイクラーの電源を入れる 2 クラッシュアイスの中に AmpliTaq Gold 獏 360 Master Mix とプライマーを置き解凍する 3 PCR を行う本数分の AmpliTaq Gold 獏 360 AmpliTaq Gold 360 Master Mix プライマー 1 プライマー 2 超純水 Master Mix 超純水およびプライマーを表 1 に合わせて 1.5 ml チューブに入れる軽くボルテックスをしチビタンで回す1 本分分量を 0.2 ml のチューブに分注する先に作成した PCR 用テンプレートを 1μl 0.2 ml のチューブに入れる 4 ふたをした 0.2 ml のチューブをサーマルサイクラーに置き温度を設定する例えば前述した C1 J 1718 と C1 N 2329 のプライマーは図 8 のとおりになる図 8 の四角で囲まれた温度はプライマー図 8 PCR の温度条件例白い四角で囲んだところはプライマーによって温度が変わるによって異なる 5 PCR が終わったら次は電気泳動である 6 なお Taq ここでは AmpliTaq Gold 獏 360 分量や温度設定は同じである Master Mix が異なれば分量なども変わるApplied Biosystems 社の AmpliTaq Gold 獏 PCR Master Mix や AmpliTaq Gold獏 Fast PCR Master Mix, UP を使うときは 55

624 植物防疫第 64 巻第 9 号 2010 年トランスイルミメータ染色機器図 10 電気泳動結果左からマーカーキレックス法 PrepMan Ultra Reagent 法アルカリ法撮影装置

7 8μl ずつ色素を置くサンプル分と同じ数 4 サンプル 5μl とローディングダイを分注器ピペットマンなどで混ぜるうがいをさせるように 5 5μl ずつマーカーとローディングダイ入りサ図 9 電気泳動で使う機器など

5 g を 200 ml の三角フラスコへ入れるそして 1 TAE Buffer をビーカーで 50 ml る容器に泳動が終わったゲルを入れる 2 20 分以上染色するシェークしたほうがよい 3

染色したゲルをトランスイルミネータにのせる 5 トランスイルミネータの電源を入れデジタルカメラなどで撮影する図 10 ら透明になる 3 ゲル用のプレートとコームを組み立てるお 4 2 を流し込みラップをかけ 15 分以上放置しわり

5 624 植物防疫第 64 巻第 9 号 2010 年トランスイルミメータ染色機器図 10 電気泳動結果左からマーカーキレックス法 PrepMan Ultra Reagent 法アルカリ法撮影装置ーカーおよびローディングダイを置き解凍する 2 1 TAE Buffer で適当に満たされた電気泳動装置に固まったゲルを置く 3 フィルム状のもの例えば TS フィルムに電気泳動装置分注器ピペットマンなどで 0.7 8μl ずつ色素を置くサンプル分と同じ数 4 サンプル 5μl とローディングダイを分注器ピペットマンなどで混ぜるうがいをさせるように 5 5μl ずつマーカーとローディングダイ入りサ図 9 電気泳動で使う機器などンプルをゲルの穴に注入し泳動を始める 6 ゲルの 3 分の 2 ぐらいまでマーカーがきたら止 III める電気泳動図 9 バンドの確認 1 エチジウムブロマイドエチブロが入っていゲルの作成 1 アガロース HG0.5 g を 200 ml の三角フラスコへ入れるそして 1 TAE Buffer をビーカーで 50 ml る容器に泳動が終わったゲルを入れる 2 20 分以上染色するシェークしたほうがよい 3 トランスイルミネータの上に少量の水をのせラ計り三角フラスコへ入れる 2 三角フラスコの口にラップをかけ電子レンジに置く目で確認しながら沸騰直前までかける電子レンジから取り出し完全に溶けるまで軽く振る溶けたップを敷く 4 染色したゲルをトランスイルミネータにのせる 5 トランスイルミネータの電源を入れデジタルカメラなどで撮影する図 10 ら透明になる 3 ゲル用のプレートとコームを組み立てるお 4 2 を流し込みラップをかけ 15 分以上放置しわりに今回は DNA 抽出 PCR 用テンプレートと PCR の固める泳動実践を説明した難しい理論を除くこと特定の試薬や 1 発泡スチロールの入れ物にクラッシュアイスを器具での実践紹介という形で進めたこれ以外の試薬や入れるクラッシュアイスの中に PCR 産物サイズマ器具を使う方法はたくさんあるできるだけ初心者の 56

6 DNA PCR PCR Applied Biosystems 2720 Mupid-Scope WD 0.2 ml MicroAmp Reaction Tube with Cap 1,000 P 10 P 20 P 100 P 200 P 1000 DL10 D200 D1000 R Chelex 100 preteinase K 20 mg/ml Taq AmpliTaq Gold 360 Master Mix 1 ml HS 1 TAE Buffer 10 TAE Buffer 1 l bp DNA / Ethidium Bromide 10 mg/ml 1.5 ml 2ml 200 ml 50 ml TS AD600 N , ,953 20,500 32,000 40,000 26,000 23,800 1,000 6,000 26,800 4,900 18,900 4,800 6,000 2 miurak@affrc.go.jp DNA 1 DAVIES, A. et al : Appl. Entomol. Zool. 44 : SIMON, C. et al : Ann. Rev. Ecol. Evol. Syst. 37 :

DNA/RNA調製法実験ガイド

DNA/RNA調製法実験ガイド DNA/RNA 調製法実験ガイド PCR の鋳型となる DNA を調製するにはいくつかの方法があり検体の種類や実験目的に応じて適切な方法を選択しますこの文書ではこれらの方法について実際の操作方法を具体的に解説しますまた RNA 調製の際の注意事項や RNA 調製用のキット等をご紹介します - 目次 - 1 実験に必要なもの 2 コロニーからの DNA 調製 3 増菌培養液からの DNA 調製