141025mishima
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- ふじきみ ながだき
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1 NGS (RNAseq)
2 »NGS Now Generation Sequencer»NGS»» 4
3 NGS(Next Generation Sequencer) Now Generation Sequencer
4
5 MiSeq NextSeq 7
6 SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR DAAXX:5:1:123:563 length= DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR DAAXX:5:1:123:476 length= DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII 8
7 NGS RNA RNAseq(transcriptome sequencing) DNA ChIPseq( ) ChIP Chromatin immunoprecipitation Exome(exon ), Re-sequence 9
8 NGS (RNAseq)
9 RNAseq RNA cdna Whole transcriptome shutgun sequencing (WTSS) Transcriptome sequencing 11
10 SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 FASTQ 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR DAAXX:5:1:123:476 length= DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII RNAseq 1.fa 1.tophat (bowtie).bam 2.cufflinks.gtf 3.cummeRbund 12
11 1 FASTA.fa.fasta 2 FASTQ.fq.fastq 3 SRA/SRA-lite.sra.lite.sra 4 SAM/BAM.sam.bam 5 GTF(GFF).gtf.gff 6 BED.bed 7 VCF.vcf 13
12 1. FASTA FASTA :.fa.fasta 1 > 1 2 >gi gb AAD cytochrome b [Elephas maximus maximus] LCLYTHIGRNIYYGSYLYSETWNTGIMLLLITMATAFMGYVLPWGQMSFWGATVITNLFSAIPYIGTNLV EWIWGGFSVDKATLNRFFAFHFILPFTMVALAGVHLTFLHETGSNNPLGLTSDSDKIPFHPYYTIKDFLG LLILILLLLLLALLSPDMLGDPDNHMPADPLNTPLHIKPEWYFLFAYAILRSVPNKLGGVLALFLSIVIL GLMPFLHTSKHRSMMLRPLSQALFWTLTMDLLTLTWIGSQPVEYPYTIIGQMASILYFSIILAFLPIAGX IENY : 14
13 2. FASTQ NGS :.fq.fastq GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT + ''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65 : 15
14 3. SRA, SRA-lite FASTQ NGS :.sra.lite.sra SRA-toolkit FASTQ fastq-dump -A SRR SRR lite.sra 16
15 4. SAM/BAM SAM (ASCII) BAM (binary) 1:497:R: M17D24M M CGGGTCTGACCTGAGGAGAACTGTGCTCCGCCTTCAG 0;==-==9;>>>>>=>>>>>>>>>>>= 19:20389:F:275+18M2D19M M = TATGACTGCTAATAATACCTACACATGTTAGAACCAT >>>>>>>>>>>>>>>>>>>><<>>><<>>4: 19:20389:F:275+18M2D19M M2D19M = GTAGTACCAACTGTAAGTCCTTATCTTCATACTTTGT ;44999;499<8<8<<<8<<><<<<>< 9: M2I25M:R: M2I27M = CACCACATCACATATACCAAGCCTGGCTGTGTCTTCT <;9<<5><<<<><<<>><<><>><9> : 17
16 5. GTF(GFF) General Transfer Format. GFF(General Feature Format) version2 : X Ensembl Repeat hid=trf; hstart=1; hend=21 X Ensembl Repeat hid=alusx; hstart=1; hend=303 X Ensembl Repeat hid=dust; hstart= ; hend= X Ensembl Pred.trans genscan=genscan X Ensembl Variation X Ensembl Variation : 18
17 6. BED : track name=pairedreads description="clone Paired Reads" usescore=1 chr clonea ,488, 0,3512 chr cloneb ,399, 0,3601 : 19
18 7. VCF Variant Call Format ##fileformat=vcfv4.0 ##filedate= ##reference=1000genomespilot-ncbi37 ##phasing=partial ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data"> ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth"> ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency"> ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele"> ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129"> ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership"> ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data"> ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality"> ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth"> ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality"> #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample rs6057 G A 29. NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0 0:48:1:52,51 1 0:48:8:51,51 1/1:43:5:., T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0 0:46:3:58,50 0 1:3:5:65,3 0/0:41: rs6055 A G,T 67 PASS NS=2;DP=10;AF=0.333,0.667;AA=T;DB GT:GQ:DP:HQ 1 2:21:6:23,27 2 1:2:0:18,2 2/2:35: T. 47. NS=2;DP=16;AA=T GT:GQ:DP:HQ 0 0:54:7:56,60 0 0:48:4:56,51 0/0:61: microsat1 GTCT G,GTACT 50 PASS NS=2;DP=9;AA=G GT:GQ:DP 0/1:35:4 0/2:17:2 1/1:40:3 : 20
19 NGS 2000 : (GEO) 21
20 oligoprobe Genespring 22
21 SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 FASTQ 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR DAAXX:5:1:123:476 length= DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII 1.tophat (bowtie) RNAseq.fa.bam 2.cufflinks.gtf 3.cummeRbund 23
22 (= ) ( )Excel Excel
23 NGS(RNAseq)
24 : RPKM Reads Per Kilobase per Million mapped reads FPKM Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments Reference: Nat Methods, 5(7):
25
26 NGS WET&DRY 28
27 The cat way tophat -p 8 -r 100 -o output_dir/ips_01 bowtie2_indexes/mm9 ips_01_1.fastq cuffdiff -p 24 ensembl_gene.gtf -L ips_01,ips_02,hesc_01,hesc_02,fibroblast_01,fibroblast_02 -o results ips_01.bam,ips_2.bam hesc_1.bam,hesc_2.bam Fibroblast_01.bam,Fibroblast_02.bam Tuxedo suite bowtie,tophat,cufflinks R + Bioconductor 29
28 SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 FASTQ 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR DAAXX:5:1:123:476 length= DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII RNAseq 1.fa 1.tophat (bowtie).bam 2.cufflinks.gtf 3.cummeRbund 30
29 0. Illumina igenomes 31
30 Illumina igenomes (human UCSC hg19 ) ( ) Homo_sapiens/UCSC/hg19/Sequence/Bowtie2Index/ % cp -r Bowtie2Index/ / ( ) Homo_sapiens/UCSC/hg19/Annotation/Genes/genes.gtf % cp genes.gtf / 32
31 1. fastq.fastq pass.sra fastq-dump fastq-dump homebrew sratoolkit % brew install sratoolkit -v tap % brew tap homebrew/science -v % fastq-dump *.sra.fastq 33
32 2. tophat(bowtie) tophat % brew install tophat -v bowtie2, samtools % tophat -p 8 -o tophat/cntl Bowtie2Index/ genome GSE50491/SRR fastq tophat bowtie 35
33 tophat2 % mkdir tophat % tophat -p 8 -o tophat/brd4 Bowtie2Index/ genome GSE50491/SRR fastq p: CPU r: ( ) 1fastq 1 (MacPro -p 12) 36
34 3. cufflinks cufflinks % brew install cufflinks -v % cufflinks -p 8 -o cufflinks_cntl tophat/ CNTL/accepted_hits.bam % cufflinks -p 8 -o cufflinks_brd4 tophat/ BRD4/accepted_hits.bam 1bam 1.5 (MacPro -p 12) 38
35 cuffmerge cuffmerge assembly merge % cuffmerge -p8 s hg19.fa assemblies.txt cuffcompare % cuffcompare -p8 s hg19.fa -r genes.gtf merged_asm/merged.gtf transcript slice variant cuffdiff 39
36 cuffdiff % cuffdiff -p 8 -L CNTL,BRD4 -o cuffdiff genes.gtf tophat/cntl/accepted_hits.bam tophat/brd4/accepted_hits.bam homebrew % ~/Downloads/cufflinks OSX_x86_64/ cuffdiff -p 8 -L CNTL,BRD4 -o cuffdiff genes.gtf tophat/cntl/accepted_hits.bam tophat/brd4/accepted_hits.bam 40
37 4. cummerbund R % R cummerbund > source(" > bioclite("cummerbund") in R Graphical Manual package=cummerbund&init=true > browsevignettes("cummerbund") 42
38 cummerbund( ) manual > library( cummerbund") > setwd("~/desktop/141025") > cuff.dir <- "cuffdiff" > cuff <- readcufflinks(dir=cuff.dir) > dens <- csdensity(genes(cuff)) > dens CSV FPKM > gene.matrix <- fpkmmatrix(genes(cuff)) > write.csv(gene.matrix, file="fpkm.csv") 43
39 4.
40 R R (R ) (R ) by from 45
41 CLC Genomics workbench Agilent Avadis NGS GeneSpring TIBCO Spotfire 46
42 SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR DAAXX:5:1:123:563 length=33 FASTQ 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR DAAXX:5:1:123:476 length= DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII RNAseq 1.fa 1.tophat (bowtie).bam 2.cufflinks.gtf 3.cummeRbund 47
43 TV CLC Genomics Workbench 48
44 RNA-seq by Avadis NGS 49
45 ChIP-seq by Avadis NGS 50
46 GeneSpring 51
47 Spotfire cuffdiff % cuffdiff -p 8 Caenorhabditis_elegans.WBcel gtf -L N2,UV -o cuffdiff SRR bam SRR bam 52
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